CN109628335B - 柠檬蒸馏酒酿酒酵母和其应用以及柠檬蒸馏酒制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种柠檬蒸馏酒酿酒酵母柠2.1709，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏登记号为CGMCC No.15455。还公开了一种酿酒酵母制剂，其活性成分为柠2.1709。还公开了柠2.1709在酿酒中的应用。还公开了一种柠檬蒸馏酒制备方法：1)将去皮柠檬粉碎，得到的柠檬粉碎液灭菌；2)在步骤1)中的柠檬粉碎液中接种权利要求1中的酿酒酵母柠2.1709，搅拌均匀；3)将步骤2)的柠檬粉碎液进行发酵：维持26～30℃静置发酵13～17天，得到发酵液；4)将步骤3)得到的发酵液进行过滤；5)将步骤4)得到的发酵滤液进行蒸馏，得到柠檬蒸馏酒。

Description

柠檬蒸馏酒酿酒酵母和其应用以及柠檬蒸馏酒制备方法
技术领域
本发明涉及一种柠檬蒸馏酒酿酒酵母和其应用以及柠檬蒸馏酒制备方法，属于微生物工程领域。
背景技术
柠檬是芸香科植物，作为较为热门的水果，吸引了相当多的农业种植户进行种植。随着种植者的增多，很容易导致生产过剩，而新鲜柠檬在常温下在储存不到一个月就会出现黑点等瑕疵，影响品相，而本身就有瑕疵的柠檬就更难被售出。气候变化也容易导致柠檬丰产不丰收，残次果在产量的三成到七成间徘徊。卖不出去的柠檬会使柠檬种植户会蒙受较大的损失，大多数农户只能任其腐烂在田间地头。目前，处理柠檬残次果主要有以下三种方法：1.将全果堆沤作为农家肥料；2.将柠檬切片后晒干或冻干出售；3.将柠檬泡酒出售。这些方法的应用从一定程度上处理了柠檬残次果，但是却并没有完全发挥柠檬的价值，使柠檬的利用出现了巨大的价值浪费。
在酿酒工业中，酵母菌在无氧环境中将葡萄糖分解为乙醇和二氧化碳。但不同种类、不同来源的酵母菌对酿酒原料的发酵能力差异很大，所生成的乙醇的含量也有很大的差异。现在的酿制果酒的生产用菌种，一般采用酿制葡萄酒的酵母菌，用于生产的酵母菌种缺乏专一性，导致果酒应具有的特性不明显、产量较低，需要选育具备柠檬果酒优良品质的专一性强的菌株。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种适用于柠檬蒸馏酒酿造的菌株。该菌株也可用于其它果酒或啤酒的酿造。
本发明实现其目的采用的是如下技术方案：
一种柠檬蒸馏酒酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)柠2.1709，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏登记号为CGMCC No.15455。
本发明还提供了一种酿酒酵母制剂，所述制剂的活性成分为权利要求1所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)柠2.1709。
本发明还提供了所述的柠檬蒸馏酒酿酒酵母柠2.1709在酿酒中的应用。
作为优选地，将柠檬蒸馏酒酿酒酵母柠2.1709应用在柠檬酒酿造中。
本发明还提供了一种柠檬蒸馏酒制备方法，包括以下步骤：
1)将去皮柠檬粉碎，得到的柠檬粉碎液灭菌；
2)在步骤1)中的柠檬粉碎液中接种权利要求1中的酿酒酵母柠2.1709，搅拌均匀；
3)将步骤2)的柠檬粉碎液进行发酵：维持26～3℃静置发酵13～17天，得到发酵液；
4)将步骤3)得到的发酵液进行过滤；
5)将步骤4)得到的发酵滤液进行蒸馏，得到柠檬蒸馏酒。
柠檬制乙醇(酒)的原理：
①柠檬野生酵母菌在有氧的条件下使柠檬粉碎液中的葡萄糖和水反应，大量增殖，产生水和二氧化碳(反应方程式C6H12O6+6O2+6H2O→6CO2+12H2O)。
②柠檬野生酵母菌在缺氧的条件下使柠檬粉碎液中的葡萄糖反应，产生二氧化碳和乙醇(反应方程式C6H12O6→2CO2+2C2H5OH)。
本发明的有益效果是：所提供的柠檬蒸馏酒酿酒酵母柠2.1709解决了柠檬蒸馏酒酿制工艺中因使用普通果酒酵母菌导致酒体不协调、酒的柠檬风味香气不纯正和出品率低下问题。使用本发明的酿酒酵母生产的柠檬蒸馏白酒中的柠檬风味浓郁、幽雅，产酒量较普通果酒酵母菌有显著提高。采用酿酒酵母柠2.1709可以将农户的残次果用于酿酒，提高残次果利用价值，为农民增加收入，减少农户因为柠檬果实大量残次带来的损失，同时减轻了因残次果腐烂造成对土壤和水体的污染。
附图说明
图1为接种后的平板分离培养基培养图。
图2为接种后的斜面试管培养基培养图。
图3为本发明酿酒酵母柠2.1709显微镜下观察图。
具体实施方式
实施例1柠檬残次果的质量分级
由于生长的状况不同，柠檬残次果的质量参差不齐，柠檬的大小和质量将影响其用途，故将柠檬果分为以下几类：
1.优质果：果重大于150g，色泽为柠檬黄色，外皮无损坏，含水量丰富，用于制乙醇、乙酸；
2.可加工残次果：果重大于60g，色泽为柠檬黄色或青色，含水量较为丰富，去皮较为方便，质量占比大，用于制乙醇、乙酸；
3.不可加工残次果：果重小于60g，色泽为柠檬黄色或青色，外皮坚硬，含水量较少，去皮较为麻烦，质量占比小，不便于加工。
本申请采用优质果和可加工残次果制乙醇。
实施例2
一、培养基的配制
1、培养基材料的预加工
A、麦芽汁的制备：将小麦浸泡24小时，催芽，待其发芽至芽长0.2-0.5cm，将其切碎，按1:10的比例加水，在65℃下水浴加热，糖化12小时后过滤，取滤液，使用灭菌釜灭菌后放入冰箱备用。
B、米曲汁的制备：将大米浸泡12小时，煮熟，接种米曲霉，在28-30℃下培养48小时，按1:8的比例加水，在65℃下水浴加热，糖化12小时后过滤，取滤液，使用灭菌釜灭菌后放入冰箱备用。
C、土豆汁的制备：将土豆去皮切丁，按照1:5的比例加水煮沸1小时，过滤后取滤液，使用灭菌釜灭菌后放入冰箱备用。
D、黄豆汁的制备：将黄豆浸泡24小时，煮沸三小时后过滤，取滤液，使用灭菌釜灭菌后放入冰箱备用。
2、柠檬汁
制作原料：带皮柠檬，将带皮柠檬粉碎得到的汁液，下文简称“柠檬汁”。
制作目的：为带皮柠檬上的柠檬野生酵母菌提供生长环境。
3、平板分离培养基
制作原料(五份培养基用量)：碳酸钙2g、柠檬汁48ml、麦芽汁48ml、琼脂2g。
制作目的：为柠檬野生酵母菌提供生长环境，形成种群优势。
4、普通斜面试管培养基
制作原料(十份培养基用量)：碳酸钙2g、柠檬汁24ml、麦芽汁24ml、黄豆汁24ml、土豆汁24ml、琼脂2g。
制作目的：为柠檬野生酵母菌提供丰富的营养，使其快速增殖。
5、米糠培养基
制作原料(十份培养基用量)：碳酸钙2g、柠檬汁98ml、米糠100g。
制作目的：米糠十分蓬松，气体流通较为顺畅，而且米糠含有丰富的微量元素，可使接种的酵母菌快速、大量增殖。
6、加糖斜面试管培养基
制作原料(十份培养基用量)：碳酸钙2g、柠檬汁23.75ml、麦芽汁23.75ml、黄豆汁23.75ml、土豆汁23.75ml、麦芽糖1g、琼脂2g。
制作目的：在培养基内添加更多的糖分，测试柠檬野生酵母菌在不同环境下的适应性。
7、偏酸性斜面试管培养基
制作原料(十份培养基用量)：柠檬汁24.5ml、麦芽汁24.5ml、黄豆汁24.5ml、土豆汁24.5ml、琼脂2g。
制作目的：调整培养基的pH值，测试柠檬野生酵母菌在不同环境下的适应性。
8、偏碱性斜面试管培养基
制作原料(十份培养基用量)：碳酸氢钠2g、柠檬汁24.5ml、麦芽汁24.5ml、黄豆汁24.5ml、土豆汁24.5ml、琼脂2g。
制作目的：调整培养基的pH值，测试柠檬野生酵母菌在不同环境下的适应性。
二、柠檬野生酵母菌的选育
1、柠檬野生酵母菌的增殖培养
操作方法：将未经清洗的柠檬粉碎，取50ml倒入250ml锥形瓶，在28℃的条件下增殖培养72小时，获得柠檬野生酵母菌的增殖培养液。
操作目的：使附在柠檬表皮和内部的野生酵母菌大量增殖。
2、柠檬野生酵母菌的分离
操作方法：取柠檬野生酵母菌增殖培养液使用无菌蒸馏水分别稀释1倍、80倍、160倍、320倍、640倍，使用接种环蘸取稀释液，在平板分离培养基上画井字，经过三日培养后分离出数十个单独的酵母菌落，接种后的平板分离培养基如图1所示。根据野生酵母菌的单细胞菌落的菌落大小，选择四个健壮的纯菌株镜检后分别移接至斜面试管培养基，分别命名为1、2、3、4号柠檬野生酵母菌。
操作目的：柠檬野生酵母菌在接近原本生长环境的环境下大量增殖，形成种群优势，再根据自然选择原理选出最适应去皮柠檬粉碎液环境的野生酵母菌。
3、柠檬野生酵母菌的驯化
操作方法：将1至4号柠檬野生酵母菌在28℃的环境下培养三天后接种至新的斜面试管培养基，重复此操作至F10代。接种后的斜面试管培养基如图2所示。
操作目的：稳定柠檬野生酵母菌的优秀遗传性状。
4、单一柠檬野生酵母菌的增殖培养
操作方法：将1至4号柠檬野生酵母菌F10代在28℃的环境下培养三天后倒入少量无菌蒸馏水制成菌悬液，再将其倒入米糠培养基并摇匀，将其命名为将1至4号柠檬野生酵母菌F11代。
操作目的：米糠培养基的优良条件可使柠檬野生酵母菌大量增殖，为柠檬野生酵母菌的制酒能力测试做准备。
三、生长环境对柠檬野生酵母菌的影响
1、培养基含糖量对柠檬野生酵母菌的影响
操作方法：在加糖斜面试管培养基上接种柠檬野生酵母菌，在28℃的环境下培养三天。
操作现象：通过肉眼观察，加糖斜面试管培养基的菌落数量及大小普遍低于普通斜面试管培养基。
操作结论：加糖的培养基提高了培养环境的的渗透压，说明渗透压大会部分抑制菌体的生长繁殖。
2、培养基pH值对柠檬野生酵母菌的影响
操作方法：在偏碱性斜面试管培养基和偏酸性斜面试管培养基上接种柠檬野生酵母菌，在28℃的环境下培养三天。
操作现象：通过肉眼观察，偏碱性斜面试管培养基的菌落数量及大小普遍低于偏酸性斜面试管培养基，偏酸性斜面试管培养基的菌落数量及大小略低于普通斜面试管培养基。
操作结论：酸性和碱性环境都不利于柠檬野生酵母菌的增殖和发酵，柠檬野生酵母菌对酸性环境的适应性强于对碱性环境适应性。
四、柠檬野生酵母菌制酒能力的对比测试
柠檬野生酵母菌产酒的原料是灭菌去皮柠檬粉碎液(下文简称为“柠檬粉碎液”)，而不是带皮的柠檬粉碎液。柠檬皮富含油类物质，在发酵过程中，这些油类物质会溶解到发酵液中，在蒸馏过程中会使生产出的乙醇中混入油类物质，生产出的成品会有白色的块状物，影响产品质量，故发酵液的原料使用灭菌去皮柠檬粉碎液，而不是带皮的柠檬粉碎液。
1、意大利“英纳帝斯”(Enartis)活性干酵母菌制酒能力测试
意大利“英纳帝斯”(Enartis)活性干酵母菌为市面上通用的高效发酵用酵母菌之一，本实验用它作为对照。
操作方法：将柠檬粉碎液质量0.02％的意大利“英纳帝斯”(Enartis)活性干酵母菌倒入装有10kg柠檬粉碎液(含糖量12％)的发酵罐中，同时加入柠檬粉碎液质量10％的蔗糖、柠檬粉碎液质量0.01％的果胶酶，加入水2.5kg，搅拌均匀，将其命名为1号罐。在28℃的条件下发酵15天，再将发酵液蒸馏成柠檬蒸馏酒(采用果酒蒸馏酒常规制备方法)。
对比测试：另取一发酵罐加入和1号罐等量的底物，但不加果胶酶。
测试结果：有果胶酶的发酵罐中发酵液酒精度为10％，蒸馏后得到0.7L蒸馏酒；而无果胶酶的发酵罐中发酵液酒精度为7％，蒸馏后得到0.15L蒸馏酒。
2、柠檬野生酵母菌制酒能力的测试
操作方法：将1至4号柠檬野生酵母菌F11代连同米糠培养基分别倒入装有10kg柠檬粉碎液(含糖量12％)的发酵罐中，每个发酵罐中同时加入柠檬粉碎液质量10％的蔗糖、柠檬粉碎液质量0.01％的果胶酶，加水2.5kg，搅拌均匀，分别命名为1、2、3、4号柠檬野生酵母菌发酵罐。在28℃的条件下发酵15天，再将发酵液蒸馏成柠檬蒸馏酒。1、2、3、4号柠檬野生酵母菌发酵罐中发酵液酒精度分别为7％、12％、9％、11％，采用果酒蒸馏酒常规制备方法分别得到蒸馏酒0.9L、1.4L、1.0L、1.1L，
3、两菌种制酒能力对比
1号罐是使用的意大利“英纳帝斯”(Enartis)活性干酵母菌，2号柠檬野生酵母菌发酵罐使用的是柠檬野生酵母菌，1号罐发酵液酒精度为10％，蒸馏后得到0.7L蒸馏酒；而2号柠檬野生酵母菌发酵罐发酵液酒精度为12％，得到蒸馏酒1.4L，可见，使用2号柠檬野生酵母菌F11代的产酒量是“英纳帝斯”(Enartis)活性干酵母菌的两倍。
4、最优菌种的保存
2号柠檬野生酵母菌的产酒能力优于1、3、4号柠檬野生酵母菌，也明显优于意大利“英纳帝斯”(Enartis)活性干酵母菌，故将2号柠檬野生酵母菌命名为柠2.1709，由中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological CultureCollection Center，简称CGMCC)进行保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年3月20日，保藏编号为CGMCC No.15455，分类名为酿酒酵母Saccharomycescerevisiae。
5、实验结论
经对比数据和反复实验，可以得出以下结论：
在柠檬粉碎液的发酵中，适量的果胶酶可以提高蒸馏酒的产量，但果胶酶的添加量不可过多，过量的果胶酶在分解果胶的过程中会生成甲醇，而在大规模的生产中，甲醇很难从发酵液中分离，而含有甲醇的酒会对人体造成严重危害。经过多次测试，确定在使用粉碎液质量0.01％的果胶酶在65摄氏度下反应两小时能够在没有甲醇生成的情况下最大限度地分解果胶。
柠2.1709对于柠檬粉碎液的产酒能力优于意大利“英纳帝斯”(Enartis)活性干酵母菌，能够较大幅度的提高柠檬的残次果的回收效率。

Claims (5)

1.一种柠檬蒸馏酒酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)柠2.1709，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏登记号为CGMCC No.15455。
2. 一种酿酒酵母制剂，其特征在于：所述制剂的活性成分为权利要求1所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)柠2.1709。
3.如权利要求1所述的柠檬蒸馏酒酿酒酵母柠2.1709在酿酒中的应用。
4. 如权利要求3 所述的应用，其特征在于：将柠檬蒸馏酒酿酒酵母柠2.1709
应用在柠檬酒酿造中。
5.一种柠檬蒸馏酒制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将去皮柠檬粉碎，得到的柠檬粉碎液灭菌；
2)在步骤1)中的柠檬粉碎液中接种权利要求1中的酿酒酵母柠2.1709，在接种所述酿酒酵母柠2.1709的同时加入柠檬粉碎液质量10%的蔗糖、柠檬粉碎液质量0.01%的果胶酶，搅拌均匀；
3)将步骤2)的柠檬粉碎液进行发酵：维持26～30℃静置发酵13～17天，得到发酵液；
4)将步骤3)得到的发酵液进行过滤；
5)将步骤4)得到的发酵滤液进行蒸馏，得到柠檬蒸馏酒。
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