CN109627153A - 一种从地木耳提取分离对羟基苯甲醛的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从地木耳提取分离对羟基苯甲醛的方法，包括：取地木耳干品，以70～95％乙醇为提取试剂，回流提取，提取液浓缩至无醇味，得到浸膏；浸膏进行硅胶柱层析，以石油醚—乙酸乙酯梯度洗脱，TLC检测，合并得到组分Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5、Fr.6、Fr.7、Fr.8、Fr.9、Fr.10；Fr.9上大孔吸附树脂柱，以甲醇一水为洗脱液梯度洗脱，按照洗脱梯度收集馏分，每个馏分浓缩至完全干燥，得到亚组分Fr.9.1、Fr.9.2、Fr.9.3；亚组分Fr.9.2、Fr.9.3分别采用半制备高效液相色谱分离纯化，得到对羟基苯甲醛纯品，纯度达98％，得率为0.5％。

Description

一种从地木耳提取分离对羟基苯甲醛的方法
技术领域
本发明属于天然药物化学提取分离领域，涉及一种从地木耳提取分离抗炎活性成分对羟基苯甲醛的方法。
背景技术
地木耳，学名为普通念珠藻(Nostoc commune)，是一种固氮蓝藻，平时所见的是其原植体，它外由胶被包裹，内由藻丝弯曲、相互缠绕而成。地木耳是一种药食两用食材，性凉，味甘，入肝经。清热明目，收敛益气。主治目赤红肿、夜盲、烫火伤、久痢、脱肛等病症。地木耳含有多种营养成分，其蛋白质含量高于鸡蛋、木耳、银耳等，总氨基酸含量与发菜、香菇相近，还含有多种维生素和水溶性多糖。地木耳具有一定的抑菌、抗肿瘤、抗衰老、免疫调节作用以及抗氧化损伤等功效，有较大的开发和应用前景。
地木耳含有的化学成分复杂多样，主要含有多糖、生物碱、萜类化合物、β-紫罗兰酮衍生物及酚酸等。目前对其生物碱部分研究较多，藻青素及还原型藻青素都有微弱的抗炎作用。为了进一步明确地木耳其他类型的抗炎活性成分，非常有必要对地木耳进行抗炎化合物的分离和开发。
发明内容
本发明首次以地木耳为原料，从中提取分离出抗炎活性成分对羟基苯甲醛。
本发明的技术方案是通过以下技术方案实现的：
一种从地木耳提取分离对羟基苯甲醛的方法，包括以下步骤：
步骤(1)、取地木耳干品，以体积分数70～95％乙醇水作为提取试剂，回流提取1～4次，每次提取1～5小时，合并提取液，减压浓缩至无醇味，得到浸膏；
步骤(2)、浸膏进行硅胶柱层析，以石油醚—乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，根据TLC检测，合并得到10个组分，记为Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5、Fr.6、Fr.7、Fr.8、Fr.9、Fr.10；
步骤(3)、组分Fr.9上大孔吸附树脂柱，以10％、30％、50％甲醇一水为洗脱液梯度洗脱，按照洗脱梯度收集馏分，减压浓缩至完全干燥，得到亚组分Fr.9.1、Fr.9.2、Fr.9.3；
步骤(4)、亚组分Fr.9.2、Fr.9.3分别采用半制备高效液相色谱分离纯化，采用C18色谱柱(5μm，10×250mm)，流动相为10％～50％的甲醇一水，流速为4mL/min，检测波长210和280nm，等度洗脱，收集19～23min之间的色谱峰，得到对羟基苯甲醛纯品。
步骤(1)中，所述的地木耳干品与提取试剂的质量体积比为1:4～6g/mL。
优选的，所述的提取试剂优选为体积分数95％乙醇水；回流提取2次，每次提取2小时。
步骤(2)中，硅胶柱层析采用200-300目硅胶。
所述的石油醚—乙酸乙酯的体积比为20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:3、0:1。
步骤(3)中，非极性大孔吸附树脂对对羟基苯甲醛的分离效果明显优于中等极性和大极性吸附树脂，因此，大孔吸附树脂为非极性大孔吸附树脂，优选为HP-20大孔吸附树脂或D101大孔吸附树脂，进一步优选为HP-20大孔吸附树脂。
具体的，大孔吸附树脂湿法装柱；组分Fr.9用95％乙醇溶解后拌样，干法上样；依次以10％、30％、50％、70％、100％甲醇一水为洗脱液梯度洗脱，洗脱速度为1～3Bv/h，每个梯度洗脱5Bv，按照洗脱梯度收集馏分，减压浓缩至完全干燥，得到5个亚组分Fr.9.1、Fr.9.2、Fr.9.3、Fr.9.4、Fr.9.5，对羟基苯甲醛主要集中在Fr.9.2(30％段)和Fr.9.3(50％段)。
步骤(4)中，所述的C18色谱柱为YMC ODS-AC18色谱柱(5μm，10×250mm)
所述的流动相优选为25％的甲醇一水。
所述的流动相也可以为15％乙睛一水或25％甲醇一0.1％甲酸水溶液。
本发明的有益效果：
本发明针对地木耳含有的多糖、生物碱和萜类等化合物极易对对羟基苯甲醛的分离产生干扰，采用醇提富集对羟基苯甲醛，并采用硅胶柱层析去除多糖等大极性成分，通过大孔吸附树脂柱进一步去除多糖大极性成分和藻青素等小极性色素，最后使用半制备高效液相色谱快速高效地分离纯化得到抗炎活性成分对羟基苯甲醛，化合物纯度可达98％，得率为0.5％。
附图说明
图1为实施例1分离得到的对羟基苯甲醛的1H-NMR图。
图2为实施例1分离得到的对羟基苯甲醛的13C-NMR图。
图3为地木耳75％乙醇浸膏的高效液相色谱图。
图4为地木耳95％乙醇浸膏的高效液相色谱图。
图5为地木耳无水乙醇浸膏的高效液相色谱图。
图6为Fr.9.2的高效液相色谱图(对羟基苯甲醛保留时间，6.897min)。
图7为Fr.9.3的高效液相色谱图(对羟基苯甲醛保留时间，6.914min)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
提取溶剂的筛选
取地木耳干品，用不同体积分数的乙醇作为提取试剂，每50g药材使用200mL提取试剂，回流提取2次，每次2h，合并提取液，减压浓缩至无醇味，得到浸膏，浸膏真空干燥，采用高效液相色谱法检测浸膏中目标成分对羟基苯甲醛，色谱条件：Waters高效液相色谱仪，Waters Symmetry C18液相色谱柱(粒度5μm，4.6×150mm)；流动相：起始梯度为10％MeOH，30min内从10％升高到100％MeOH并保持5min；检测波长：280nm；柱温，25℃；流速，1mL/min；以对羟基苯甲醛纯品为标准品，纯度98％(HPLC)。
表1不同提取试剂对提取效果的影响
提取试剂 保留时间(min) 峰面积(％)
75％乙醇水 10.033 8.49
95％乙醇水 10.247 22.25
无水乙醇 10.492 17.57
由图3-图5可知，95％乙醇浸膏中对羟基苯甲醛含量最高，显著高于75％乙醇浸膏中对羟基苯甲醛的含量，说明采用95％乙醇水作为提取试剂，对目标成分的提取率最高。无水乙醇浸膏中对羟基苯甲醛的含量与95％乙醇浸膏差异不明显，但是提取的成分较为复杂、杂质较多，干扰目标成分的后续分离。因此，选择95％乙醇水作为提取试剂。
提取次数的考察
取地木耳干品，每50g药材使用200mL95％的乙醇水，每次回流提取2h；提取1次，浸膏得率约为70％；提取2次，浸膏得率约为93％，再次重复提取得率并未明显提高，故考虑时效性，优选提取2次。
提取时间的考察
取地木耳干品，每50g药材使用200mL95％的乙醇水，回流提取1次；提取时间为1h，浸膏得率约为55％；提取时间为1.5h，浸膏得率约为60％，提取时间延长至2.5或3h，得率并未明显提高，故考虑时效性，以回流提取2h为佳。
实施例1
取新鲜地木耳20kg，干燥，得地木耳干品0.5kg，每50g药材使用200mL95％的乙醇水，回流提取2次，每次2h，合并提取液，减压浓缩至无醇味，得到浸膏50g。
浸膏上硅胶柱色谱(200-300目硅胶，青岛海洋化工厂)，以石油醚-乙酸乙酯(20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:3、0:1V/V)为洗脱剂进行梯度洗脱，根据TLC(薄层硅胶色谱)检测，合并得到10个组分，记为Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5、Fr.6、Fr.7、Fr.8、Fr.9、Fr.10，高效液相色谱法检测10个组分中对羟基苯甲醛，对羟基苯甲醛主要集中在Fr.9，相对含量约38％。
HP-20大孔吸附树脂柱湿法装柱；取组分Fr.9，用95％乙醇溶解后拌样，挥干乙醇，干法上样；依次以10％、30％、50％、70％、100％甲醇一水梯度洗脱，洗脱速度为1～3Bv/h，每个梯度洗脱5Bv，按照洗脱梯度收集馏分，每个馏分减压浓缩至完全干燥，得到5个亚组分Fr.9.1、Fr.9.2、Fr.9.3、Fr.9.4、Fr.9.5。高效液相色谱法检测，色谱条件：流动相：30％MeOH，20min，检测波长：280nm，目标化合物对羟基苯甲醛主要集中在Fr.9.2(30％段)和Fr.9.3(50％段)，相对含量分别为57％(图6，出峰时间6.697min)和85％(图7，出峰时间6.914min)；其中，在亚组分Fr.9.2中杂质成分主要集中在大极性部分，Fr.9.3中的杂质成分主要集中在小极性部分。
亚组分Fr.9.2、Fr.9.3分别采用半制备液相色谱分离纯化，采用YMC ODS-A C18色谱柱(粒度5μm，10×250mm)，流动相为体积分数为25％的甲醇一水，流速为4mL/min，检测波长210和280nm，收集19～23min之间的色谱峰，得到对羟基苯甲醛纯品，纯度98％(HPLC)，得率0.5％；化合物为白色固体，[M+H]+：m/z 123.1，结合氢谱和碳谱数据确定分子式为C7H6O2，鉴定为对羟基苯甲醛，英文名称为p-hydroxybenzaldehyde，化学结构式如下：
表2化合物的核磁数据
注：1H-NMR600MHz，13C-NMR 125MHz，CD3OD。

Claims (10)

1.一种从地木耳提取分离对羟基苯甲醛的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤(1)、取地木耳干品，以体积分数70～95％乙醇水作为提取试剂，回流提取1～4次，每次提取1～5小时，合并提取液，浓缩至无醇味，得到浸膏；
步骤(2)、浸膏进行硅胶柱层析，以石油醚—乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，根据TLC检测，合并得到10个组分，记为Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5、Fr.6、Fr.7、Fr.8、Fr.9、Fr.10；
步骤(3)、组分Fr.9上大孔吸附树脂柱，以10％、30％、50％甲醇一水为洗脱液梯度洗脱，按照洗脱梯度收集馏分，浓缩至完全干燥，得到亚组分Fr.9.1、Fr.9.2、Fr.9.3；
步骤(4)、亚组分Fr.9.2、Fr.9.3分别采用半制备高效液相色谱分离纯化，采用C18色谱柱(5μm，10×250mm)，流动相为10％～50％的甲醇一水，流速为4mL/min，检测波长210和280nm，等度洗脱，收集19～23min之间的色谱峰，得到对羟基苯甲醛纯品。
2.根据权利要求1所述的从地木耳提取分离对羟基苯甲醛的方法，其特征在于步骤(1)中，所述的地木耳干品与提取试剂的质量体积比为1:4～6g/mL。
3.根据权利要求1所述的从地木耳提取分离对羟基苯甲醛的方法，其特征在于步骤(1)中，所述的提取试剂为体积分数95％乙醇水。
4.根据权利要求1所述的从地木耳提取分离对羟基苯甲醛的方法，其特征在于步骤(1)中，回流提取2次，每次提取2小时。
5.根据权利要求1所述的从地木耳提取分离对羟基苯甲醛的方法，其特征在于步骤(2)中，硅胶柱层析采用200-300目硅胶。
6.根据权利要求1所述的从地木耳提取分离对羟基苯甲醛的方法，其特征在于步骤(2)中，所述的石油醚—乙酸乙酯的体积比为20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:3、0:1。
7.根据权利要求1所述的从地木耳提取分离对羟基苯甲醛的方法，其特征在于步骤(3)中，所述的大孔吸附树脂为HP-20大孔吸附树脂或D101大孔吸附树脂。
8.根据权利要求1所述的从地木耳提取分离对羟基苯甲醛的方法，其特征在于步骤(3)中，每个梯度洗脱5Bv，洗脱速度为1～3Bv/h。
9.根据权利要求1所述的从地木耳提取分离对羟基苯甲醛的方法，其特征在于步骤(4)中，所述的流动相为25％的甲醇一水。
10.根据权利要求1所述的从地木耳提取分离对羟基苯甲醛的方法，其特征在于步骤(4)中，所述的流动相为15％乙睛一水或25％甲醇一0.1％甲酸水溶液。
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