CN109620979A - 低离子休克提高氨基糖苷类抗生素杀灭持留菌效率的方法 - Google Patents

低离子休克提高氨基糖苷类抗生素杀灭持留菌效率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了低离子休克提高氨基糖苷类抗生素杀灭持留菌效率的方法。本发明方法是将抗生素采用等渗溶液或无菌水溶液配制成一定浓度的抗生素预处理液，所述等渗溶液为0.3M的甘油溶液或0.9%Nacl溶液，所述无菌水溶液为双蒸水。所述抗生素预处理液用于对含有待灭持留菌的菌液进行重悬处理。本发明方法可以大幅度提高氨基糖苷类抗生素杀灭持留菌的效率，有效消除细菌持留性，降低细菌耐受性，同时在达到同样治疗效果的前提下，减少用药量和给药时间，从而降低抗生素的副作用。

Description

低离子休克提高氨基糖苷类抗生素杀灭持留菌效率的方法
技术领域
本发明属于抗生素和微生物领域，具体涉及低离子休克提高氨基糖苷类抗生素杀灭持留菌效率的方法。
背景技术
通过抗生素治疗细菌感染是临床上及养殖业中典型的治疗方法，但随着抗生素的广泛使用也导致了部分细菌产生耐药性。另外，在一些慢性持续性感染和生物膜感染中，细菌并没有发生耐药突变，但是在使用抗生素治疗时需要更长的接触时间，这种现象与细菌的持留性(persistence)有关。
持留菌(persister)是细菌群体中一小部分具有表型耐药的细菌，自身基因没有发生耐药突变，而是由于自身处于低代谢不生长或生长缓慢状态导致对抗生素不敏感和耐受。
营养转换(即：转换底物碳源)与持留菌(persister)的形成有密切的关系，通过营养转换的方法改变底物碳源，细菌则无法进行完整地三羧酸循环，其大部分细胞生长缓慢或不生长，处于一种生长休眠状态，细菌在这种状态下对氨基糖苷类抗生素有着极高的耐受性。氨基糖苷抗生素属于杀菌型抗生素，主要原理是其自身与细菌核糖体30S小亚基结合，导致细菌合成错误的蛋白质，产生有害的蛋白质聚集体，最终杀死细菌。
目前临床医用或养殖业使用的氨基糖苷类抗生素主要包括：妥布霉素，卡那霉素，链霉素，庆大霉素，新霉素，阿米卡星，安普霉素，达苄霉素，奈替米星，西索米星等。
发明内容
经过营养转换(即：转换底物碳源)后的革兰氏阴性/阳性持留菌(共三种，即Ⅰ型大肠杆菌，Ⅱ型大肠杆菌，Ⅲ型金黄色葡萄球菌)分别经过四种氨基糖苷类抗生素测试，即直接加入卡那霉素，妥布霉素，庆大霉素或链霉素(浓度分别为100μg/ml，50μg/ml，50μg/ml和200μg/ml)处理此三种持留菌2h或3h后，持留菌仍保持较高的耐受性。
本发明所要解决的技术问题是如何在短时间内提高对上述三种持留菌的杀灭效率，为此本发明公开了一种低离子休克提高氨基糖苷类抗生素杀灭持留菌效率的方法。本发明方法可以强化氨基糖苷类抗生素杀灭经过营养转换诱导产生的革兰氏阴性持留菌或革兰氏阳性持留菌。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
低离子休克提高氨基糖苷类抗生素杀灭持留菌效率的抗生素预处理方法：将抗生素采用等渗溶液或无菌水溶液配制成一定浓度的抗生素预处理液，所述等渗溶液为0.3M的甘油溶液，所述无菌水溶液为双蒸水。
所述抗生素为妥布霉素、庆大霉素、链霉素或卡那霉素。
所述抗生素预处理液中抗生素的浓度为50-200μg/ml。
所述抗生素预处理液用于对含有待灭持留菌的菌液进行重悬处理。
所述持留菌为经过转换底物碳源诱导产生的革兰氏阴性持留菌(比如大肠杆菌)或革兰氏阳性持留菌(比如金黄色葡萄球菌)。
所述重悬过程，抗生素预处理液与含有待灭持留菌的菌液的体积比为1∶1。
本发明方法对抗生素采用等渗溶液进行预处理，可以大幅度提高氨基糖苷类抗生素杀灭持留菌的效率，有效消除细菌持留性，降低细菌耐受性，同时在达到同样治疗效果的前提下，减少用药量和给药时间，从而降低抗生素的副作用。
实验证明通过低离子渗透能瞬间增大细菌本身对抗生素的摄取，从而使细菌快速死亡。针对Ⅰ型大肠杆菌，用0.3M等渗甘油或无菌水配制的抗生素溶液(以妥布霉素为例)重悬处理菌体，其杀菌效率均能提高5个数量级(参见图1)；针对Ⅱ型大肠杆菌，用0.3M等渗甘油或无菌水配制的抗生素溶液(以妥布霉素为例)重悬处理菌体，其杀菌效率为无穷大(参见图2)；针对金黄色葡萄球菌，用0.3M等渗甘油或无菌水配制的抗生素溶液(以妥布霉素为例)重悬处理菌体，其杀菌效率均能提高3和1个数量级(参见图3)。
附图说明
图1为氨基糖苷类抗生素在低离子休克处理条件下杀灭Ⅰ型大肠杆菌效率的比较。图中，每个处理下的6个菌落图从左至右分别为稀释度为105、104、103、102、10和1下的菌落图。
图2为氨基糖苷类抗生素在低离子休克处理条件下杀灭Ⅱ型大肠杆菌效率的比较。图中，每个处理下的6个菌落图从左至右分别为稀释度为105、104、103、102、10和1下的菌落图。
图3为氨基糖苷类抗生素在低离子休克处理条件下杀灭Ⅲ型金黄色葡萄球菌效率的比较。图中，每个处理下的6个菌落图从左至右分别为稀释度为105、104、103、102、10和1下的菌落图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的大肠杆菌(E.coli).K-12BW25113(Baba T.et al.(2006)Construction of Escherichia coli K-12in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection.Mol Systems Biol 2(1),1-11,doi:10.1038/msb4100050.)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用)。
下述实施例中的金黄色葡萄球菌(S.aureus)ATC25923(北京大学来鲁华教授实验室)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1
低离子休克增强氨基糖苷类抗生素杀灭Ⅰ型大肠杆菌的效率
1、活化大肠杆菌标准菌株(E.coli BW25113)。吸取用40％甘油保存于-80℃冰箱的菌液1μl，接种于1ml M9加葡萄糖液体培养基中(配置成分：M9培养基，5g/L葡萄糖，1.5g/L(NH4)2SO4，1mg/L VB1，PH＝7.3)，37℃摇床(220rpm)培养到平台期，重新稀释1000倍后接种于10ml M9加葡萄糖液体培养基中，37℃摇床(220rpm)培养到对数期(OD600＝0.5-0.6)。取2个5ml EP管，每管分装4ml菌液离心(5000g，4℃，5min),去除上清；用同体积4℃预冷的M9液体培养基重悬离心(5000g，4℃，5min)，去除上清；用1ml常温M9液体培养基(PH＝7.3)重悬离心(5000g，4℃，5min)，去除上清；用同体积4ml M9加延胡索酸液体培养基(配置成分：M9培养基，2g/L延胡索酸，1.5g/L(NH4)2SO4，1mg/L VB1，PH＝7.3)混悬，移至灭菌摇瓶中在37℃摇床(220rpm)处理4h。
2、取1.5ml步骤1得到的菌液分装于15个无菌离心管，每管分装有100μl菌液，将其中15管菌液离心(13000g，2min)，吸去上清，分别用100ul该实验相应溶液将细胞重悬，并孵育相应时间(5min)后，终止反应；
实验相应溶液为等渗甘油(0.3M)GCⅠ、无菌水WCⅠ、Nacl(0.9％)NCⅠ，分别含卡那霉素，妥布霉素，庆大霉素、链霉素(浓度分别为100μg/ml，50μg/ml，50μg/ml和200μg/ml)的等渗甘油(0.3M)KGⅠ、TGⅠ、GGⅠ、SGⅠ；分别含卡那霉素，妥布霉素，庆大霉素、链霉素(浓度分别为100μg/ml，50μg/ml，50μg/ml和200μg/ml)的无菌水KWⅠ、TWⅠ、GWⅠ、SWⅠ；分别含卡那霉素，妥布霉素，庆大霉素、链霉素(浓度分别为100μg/ml，50μg/ml，50μg/ml和200μg/ml)的Nacl(0.9％)KNⅠ、TNⅠ、GNⅠ、SNⅠ。
3、上述步骤完成后将所有菌液离心(13000g，2min)，去除上清，用100μl10mM灭菌磷酸盐缓冲液(PH＝7.4)重悬菌体，洗涤两次，最终用100μl 10mM磷酸盐缓冲液重悬后备用。
4、将菌液按照每次10倍的梯度用10mM磷酸盐缓冲液(PH＝7.4)依次稀释，每个稀释度取10μl菌液点滴在LB固体培养基六方格平板上，置于37℃温箱培养至少12小时后，检查细菌死亡，菌落计数，计算Ⅰ型大肠杆菌经处理后的存活率。
5、在细菌存活率分析中，取三次独立实验结果，实验结果见表1和图1。
表1低离子休克增强氨基糖苷类抗生素杀灭Ⅰ型大肠杆菌的效率
注：相对杀菌效率＝即等渗甘油或无菌水形成的低离子条件下无抗生素的存活率×等渗条件(0.9％Nacl)下有抗生素的存活率/等渗甘油或无菌水形成的低离子条件下有抗生素的存活率。
结果显示，将Ⅰ型大肠杆菌菌液用0.3M等渗甘油或无菌水配制的妥布霉素重悬处理，其相对杀菌效率均能提高5个数量级。类似的，将大肠杆菌菌液用0.3M等渗甘油或无菌水配制的其他类型氨基糖苷类抗生素(庆大霉素,卡那霉素，链霉素)溶液重悬处理，其杀菌效率也均有不同程度的提高。而用0.9％Nacl溶液配制的抗生素重悬处理Ⅰ型大肠杆菌的杀菌效果则不理想。
实施例2
低离子休克增强氨基糖苷类抗生素杀灭Ⅱ型大肠杆菌的效率
1、活化大肠杆菌标准菌株(E.coli BW25113)。吸取用40％甘油保存于-80℃冰箱的菌液1μl，接种于1ml MHB液体培养基中(Mueller-Hinton broth)，35℃摇床(220rpm)培养24h(平台期109CFU/ml)，重新稀释1000倍后接种于2ml MHB液体培养基，35℃摇床(220rpm)培养24h(平台期109CFU/ml)。取1个1.5mlEP管，吸取1ml菌液离心(13000g，2min),去除上清；用1ml M9无碳源液体培养基重悬后和9ml M9无碳源液体培养基分别移入灭菌摇瓶中(即：菌液以108CFU/ml的浓度在以M9无碳源液体培养基为底物的培养基中继续培养)，在37℃摇床(220rpm)处理5h后备用。
2、取1.5ml步骤1得到的菌液分装于15个无菌离心管，每管分装有100μl菌液，将其中15管菌液离心(13000g，2min)，吸去上清，分别用100ul该实验相应溶液将细胞重悬，并孵育相应时间(5min)，终止反应；
实验相应溶液为等渗甘油(0.3M)GCⅡ、无菌水WCⅡ、Nacl(0.9％)NCⅡ，分别含卡那霉素，妥布霉素，庆大霉素或链霉素(浓度分别为100μg/ml，50μg/ml，50μg/ml和200μg/ml)的等渗甘油(0.3M)KGⅡ、TGⅡ、GGⅡ、SGⅡ；分别含卡那霉素，妥布霉素，庆大霉素或链霉素(浓度分别为100μg/ml，50μg/ml，50μg/ml和200μg/ml)的无菌水KWⅡ、TWⅡ、GWⅡ、SWⅡ；分别含卡那霉素，妥布霉素，庆大霉素或链霉素(浓度分别为100μg/ml，50μg/ml，50μg/ml和200μg/ml)的Nacl(0.9％)KNⅡ、TNⅡ、GNⅡ、SNⅡ。
3、上述步骤完成后将所有菌液离心(13000g，2min)，去除上清，用100μl10mM灭菌磷酸盐缓冲液(PH＝7.4)重悬菌体，洗涤两次，最终用100μl 10mM磷酸盐缓冲液重悬后备用。
4、将菌液按照每次10倍的梯度用10mM磷酸盐缓冲液(PH＝7.4)依次稀释，每个稀释度取10μl菌液点滴在LB固体培养基六方格平板上，置于37℃温箱培养至少12小时后，检查细菌死亡，菌落计数，计算Ⅱ型大肠杆菌经处理后的存活率。
5、在细菌存活率分析中，取三次独立实验结果。实验结果见表2和图2。
表2低离子休克增强氨基糖苷类抗生素杀灭Ⅱ型大肠杆菌的效率
注：相对杀菌效率＝即等渗甘油或无菌形成的低离子条件下无抗生素的存活率×等渗条件(0.9％Nacl)下有抗生素的存活率/等渗甘油或无菌水形成的低离子条件下有抗生素的存活率。
结果显示，将Ⅱ型大肠杆菌菌液用0.3M等渗甘油或无菌水配制的妥布霉素重悬处理，其相对杀菌效率均为无穷大。类似的，将Ⅱ型大肠杆菌菌液用0.3M等渗甘油或无菌水配制的其他类型氨基糖苷类抗生素(庆大霉素,链霉素，卡那霉素，)溶液重悬处理，其杀菌效率也均有不同程度的提高。而用0.9％Nacl溶液配制的抗生素重悬处理Ⅱ型大肠杆菌的杀菌效果则不理想。
实施例3
低离子休克增强氨基糖苷类抗生素杀灭Ⅲ型金黄色葡萄球菌的效率
1、活化金黄色葡萄球菌标准菌株(S.aureus ATC25923)。吸取用40％甘油保存于-80℃冰箱的菌液1μl，接种于1ml MHB液体培养基中(Mueller-Hinton broth)，35℃摇床(220rpm)培养24h(平台期109CFU/ml)，重新稀释1000倍后接种于2ml MHB液体培养基，35℃摇床(220rpm)培养24h(平台期109CFU/ml)。取1个1.5mlEP管，吸取1ml菌液离心(13000g，2min),去除上清；用1ml YNB无碳源液体培养基(Yeast nitrogen base broth,without anamino acid)重悬后和9mlYNB无碳源液体培养基分别移入灭菌摇瓶中(即：菌液以108CFU/ml的浓度在以YNB无碳源液体培养基为底物的培养基中继续培养)，在35℃摇床(220rpm)处理5h后备用。
2、取1.5ml步骤1得到的菌液分装于15个无菌离心管，每管分装有100μl菌液，将其中15管菌液离心(13000g，2min)，吸去上清，分别用100ul该实验相应溶液将细胞重悬，并孵育相应时间(5min)，终止反应；
实验相应溶液为等渗甘油(0.3M)GCⅢ、无菌水WCⅢ、Nacl(0.9％)NCⅢ，分别含卡那霉素，妥布霉素，庆大霉素、链霉素(浓度分别为100μg/ml，50μg/ml，50μg/ml和200μg/ml)的等渗甘油(0.3M)KGⅢ、TGⅢ、GGⅢ、SGⅢ；分别含卡那霉素，妥布霉素，庆大霉素、链霉素(浓度分别为100μg/ml，50μg/ml，50μg/ml和200μg/ml)的无菌水KWⅢ、TWⅢ、GWⅢ、SWⅢ；分别含卡那霉素，妥布霉素，庆大霉素、链霉素(浓度分别为100μg/ml，50μg/ml，50μg/ml和200μg/ml)的Nacl(0.9％)KNⅢ、TNⅢ、GNⅢ、SNⅢ。
3、上述步骤完成后将所有菌液离心(13000g，2min)，去除上清，用100μl 10mM灭菌磷酸盐缓冲液(PH＝7.4)重悬菌体，洗涤两次，最终用100μl 10mM磷酸盐缓冲液重悬后备用。
4、将菌液按照每次10倍的梯度用10mM磷酸盐缓冲液(PH＝7.4)依次稀释，每个稀释度取10μl菌液点滴在LB固体培养基六方格平板上，置于37℃温箱培养至少12小时后，检查细菌死亡，菌落计数，计算Ⅲ型金黄色葡萄球菌经处理后的存活率。
5、在细菌存活率分析中，取三次独立实验结果。实验结果见表2和图2.
表3低离子休克增强氨基糖苷类抗生素杀灭Ⅲ型金黄色葡萄球菌的效率
注：相对杀菌效率＝即等渗甘油或无菌水形成的低离子条件下无抗生素的存活率×等渗条件(0.9％Nacl)下有抗生素的存活率/等渗甘油或无菌水形成的低离子条件下有抗生素的存活率。
结果显示，将金黄色葡萄球菌菌液用0.3M等渗甘油或无菌水配制的妥布霉素重悬处理，其相对杀菌效率能提高3和1个数量级。类似的，将金黄色葡萄球菌菌液用0.3M等渗甘油或无菌水配制的其他类型氨基糖苷类抗生素(庆大霉素,链霉素，卡那霉素，)溶液重悬处理，其杀菌效率也均有不同程度的提高。而用0.9％Nacl溶液配制的抗生素重悬处理Ⅲ型金黄色葡萄球菌的杀菌效果则不理想。

Claims (9)

1.低离子休克提高氨基糖苷类抗生素杀灭持留菌效率的抗生素预处理方法，其特征在于：将抗生素采用等渗溶液或无菌水溶液配制成一定浓度的抗生素预处理液，所述等渗溶液为0.3M的甘油溶液。
2.根据权利要求1所述的低离子休克提高氨基糖苷类抗生素杀灭持留菌效率的抗生素预处理方法，其特征在于：所述无菌水溶液为双蒸水。
3.根据权利要求1所述的低离子休克提高氨基糖苷类抗生素杀灭持留菌效率的抗生素预处理方法，其特征在于：所述抗生素为妥布霉素、庆大霉素、链霉素或卡那霉素。
4. 根据权利要求3所述的低离子休克提高氨基糖苷类抗生素杀灭持留菌效率的抗生素预处理方法，其特征在于：所述抗生素预处理液中抗生素的浓度为50-200 µg/ml。
5.根据权利要求1所述的低离子休克提高氨基糖苷类抗生素杀灭持留菌效率的抗生素预处理方法，其特征在于：所述抗生素预处理液用于对含有待灭持留菌的菌液进行重悬处理。
6.根据权利要求5所述的低离子休克提高氨基糖苷类抗生素杀灭持留菌效率的抗生素预处理方法，其特征在于：所述持留菌为经过转换底物碳源诱导产生的持留菌。
7.根据权利要求5所述的低离子休克提高氨基糖苷类抗生素杀灭持留菌效率的抗生素预处理方法，其特征在于：所述持留菌为革兰氏阴性持留菌或革兰氏阳性持留菌。
8.根据权利要求7所述的低离子休克提高氨基糖苷类抗生素杀灭持留菌效率的抗生素预处理方法，其特征在于：所述革兰氏阴性持留菌为大肠杆菌，所述革兰氏阳性持留菌为金黄色葡萄球菌。
9.根据权利要求5所述的低离子休克提高氨基糖苷类抗生素杀灭持留菌效率的抗生素预处理方法，其特征在于：所述抗生素预处理液与含有待灭持留菌的菌液的体积比为1∶1。
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