CN109470670A - 一种人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化能力特异性检测方法 - Google Patents

一种人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化能力特异性检测方法 Download PDF

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CN109470670A CN201811406867.1A CN201811406867A CN109470670A CN 109470670 A CN109470670 A CN 109470670A CN 201811406867 A CN201811406867 A CN 201811406867A CN 109470670 A CN109470670 A CN 109470670A
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刘沐芸
丁海雷
陈康卓
曾伟杰
刘云城
梁晓
曾桂芳
彭浩
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Individual Cell Therapy Technology National Local Joint Engineering Laboratory (shenzhen)
Shenzhen Kono Medical Laboratory
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Individual Cell Therapy Technology National Local Joint Engineering Laboratory (shenzhen)
Shenzhen Kono Medical Laboratory
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    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
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    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract

本发明提供了一种人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化能力特异性检测方法，其特征在于，所述的方法是将人脐带间充质干细胞mRNA与带有RNA开关分子序列的pET‑3a质粒进行混合，再进行体外无细胞蛋白表达，所述的RNA开关分子的核苷酸序列如SEQ N0.1所示。本发明具有如下技术效果：1）不需要将hMSCs进行长时间的软骨微球诱导，不需要进行软骨微球的组织学检测，步骤简单，快捷，对于临床研究及转化具有极大意义。2）从分子水平进行特异性检测，为定性检测，具有很高的检测结果重复性。

Description

一种人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化能力特异性检测 方法
技术领域
本发明属于生物医学检测领域，具体提供人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化能力特异性检测方法。
背景技术
人体脐带来源的间充质干细胞(hMSCs)，是指存在于新生儿脐带组织中的一种多能成体干细胞，具有高度自我更新能力和多向分化潜能，人脐带间充质干细胞的这些生物学功能特性，以及其制备的方便性，使得人体间充质干细胞成为目前临床治疗研究领域发展最为迅速的一类干细胞。体外评价间充质干细胞向不同细胞谱系分化的能力是间充质干细胞生物学有效性评价的重要内容，也是影响其临床研究和产品转化的重要环节。
目前脐带间充质干细胞的鉴定标准是由国际细胞治疗协会(InternationalSociety for Cellular Therapy，ISCT)于2006年首次提出的以成骨、成脂和成软骨诱导分化能力的“三系”诱导分化评价体系。在诱导分化评价中，有关成软骨细胞诱导分化能力的评价更具有临床适应症的相关性。在hMSCs生物学有效性质量研究中发现，关于成软骨细胞诱导分化能力的评价，目前常用的基于阿辛蓝(alcian blue)染色的hMSCs成软骨细胞诱导分化技术。然而，该评价方法是首先将hMSCs经28天诱导出软骨微球，再进行组织学检测。检测周期较长，不利于临床研究及转化。此外所得结果往往存在异议，结果的重复性和特异性较差。
综上，现有技术存在的技术问题是：检测周期长，检测结果重复性和稳定性较差。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化能力特异性检测方法，既能约在1天内快速地检测出结果，又能从分子水平特异性地检测出hMSCs成软骨能力，为临床研究及转化提供快速、准确的数据支持。
本发明通过以下技术方案实现：
一种人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化能力特异性检测方法，所述的方法是将人脐带间充质干细胞mRNA与带有RNA开关分子序列的pET-3a质粒进行混合，再进行体外无细胞蛋白表达；所述的RNA开关分子的核苷酸序列如SEQ N0.1所示。
所述的方法中，所述的体外无细胞蛋白表达所用的蛋白为增强型绿色荧光蛋白EGFP，可发射绿色荧光，可做定性分析。
一种用于人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化能力特异性检测的RNA开关分子，所述的RNA开关分子的核苷酸序列如SEQ N0.1所示。
所述的RNA开关分子在制备人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化能力特异性检测试剂中的应用。
所述的应用中，所述的RNA开关分子是构建到pET-3a质粒中的，所述的pET-3a质粒的核苷酸序列如SEQ N0.2所示。
本发明的技术思路如下：先设计一段内含成软骨特异性标志基因COL2A1互补的具发夹状结构的RNA开关序列，再构建到质粒序列中，只需将人脐带间充质干细胞提取目标RNA与其一同混合，目标RNA结合到开关序列的COL2A1基因互补片段，这种结合降低了发夹结构域的稳定性，从而促进核糖体或核糖体复合体与其同源核糖体位点的相互作用，使下游报告基因序列表达，再置于酶标仪上检测，特异性人脐带间充质干细胞检测成软骨诱导分化能力。
本发明的创新点在于提供了一种全新的技术思路，在分子水平特异性地检测人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化能力，由于属于定性检测，特异性和效率都很高，解决了现有技术检测效率低和特异性不高的技术问题。为了解决上述技术问题，发明人创造性地设计了一种新的RNA开关分子，本发明中的RNA开关分子是一段与成软骨特异性标志基因COL2A1互补的、具稳定发夹状结构的、下游具报告基因的RNA开关分子，且能特异性地与成软骨标志基因的RNA序列片段结合，降低发夹状结构稳定性，从而使下游报告基因序列表达出报告蛋白，最终特异性检测成软骨能力，主要包括成软骨标志基因RNA的互补片段(单链的脚保持域和发夹结构域)，核糖体结合位点(RBS)，起始启动密码子和报告基因序列。
在设计新的RNA开关分子过程中，发明人付出大量创造性劳动，经过了反复的实验摸索，主要筛选过程如下：登陆NCBI搜索COL2A1mRNA for alpha1(II)collagen，找到二型胶原mRNA序列：应用软件Primer 5.0，筛选COL2A1mRNA for alpha1(II)collagen序列片段中反转录成DNA后，发明人经过摸索，最终依据多重标准：①避免形成发夹状结构；②避免形成二聚体；③避免序列错配；④序列特异性等，选出评分较高的5段特异性序列。从这5段特异性序列中查找满足RNA开关序列设计要求的序列。设计出5段特异性RNA开关序列交由公司合成，并构建pET-3a重组质粒。再通过本说明书实施例中描述的实验方案，比较5段序列所表达的eGFP蛋白荧光OD值，最终在经过一系列的筛选和效果验证后，明确本发明的RNA开关分子的序列更具有特异性表达的意义。
本发明具有如下技术效果：
1)不需要将hMSCs进行长时间的软骨微球诱导，不需要进行软骨微球的组织学检测，步骤简单，快捷，对于临床研究及转化具有极大意义。
2)从分子水平进行特异性检测，为定性检测，具有很高的检测结果重复性。
附图说明
图1为5份hMSCs样本表面标记物特征检测结果。
图2为特异性结合成软骨特异性标志基因COL2A1片段的RAN开关分子序列结构图。
图3A-J分别为5份hMSCs样本软骨细胞小球切片经阿利辛蓝染成蓝色的形态学照片，其中图3A为样本一阴性对照组照片，其中图3B为样本一成软骨诱导组照片，其中图3C为样本二阴性对照组照片，其中图3D为样本二成软骨诱导组照片，其中图3E为样本三阴性对照组照片，其中图3F为样本三成软骨诱导组照片，其中图3G为样本四阴性对照组照片，其中图3H为样本四成软骨诱导组照片，其中图3I为样本五阴性对照组照片，其中图3J为样本五成软骨诱导组照片。
图4为本发明检测方法检测诱导分化能力，实验数据用均数±标准误表示，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
具体实施方式
人脐带间充质干细胞的制备方法，参考已经授权的中国专利，专利号CN201010528733.4，专利名称：一种人脐带间充质干细胞的制备方法，公开(公告)号CN101974484A。
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1含RNA开关分子的pET-3a重组质粒的制备和应用
第一步：通过NCBI下载成软骨特异性标志基因COL2A1序列，筛选其中一段特异性序列(序列：GGCTCCAATGGCAACCCTGGACCCCCTGGTCCCCCTGGTCCTTCTGGAAAAGATGGTCC)，再设计出能特异性结合该目的序列的RAN开关序列，结构如图2所示。交由金斯瑞公司合成具有一段与成软骨特异性标志基因COL2A1互补的，具稳定发夹状结构的，下游具报告基因的RNA开关分子序列的pET-3a质粒。所用pET-3a质粒购买自Novagen公司。
RNA开关分子的核苷酸序列如SEQ N0.1所示。
pET-3a质粒的核苷酸序列如SEQ N0.2所示。
第二步：将待检hMSCs采用Invitrogen公司的Reagent RNA提取试剂盒进行RNA抽提，然后将合成的质粒和抽提的RNA混合，再使用Invitrogen公司的ExpresswayTMMilligram Cell-Free E.coli Expression System体外无细胞表达试剂盒进行蛋白表达。pET-3a质粒在解除双链状态下，其中RNA开关分子形成稳定的发夹结构，使下游报告基因(eGFP)抑制表达，待检hMSCs中成软骨标志基因的RNA序列片段与RNA开关分子序列结合，降低发夹状结构稳定性，从而使下游报告基因序列表达出报告蛋白，根据表达蛋白发射的绿色荧光，通过酶标仪进行检测，从而确定待检hMSCs的成软骨诱导分化能力。
实施例2本发明方法检测诱导分化能力与阿辛蓝(alcian blue)常规染色法检测诱导分化能力的对照实验
取5份第4代对数生长期的hMSCs，图1所示，流式检测表面标记物特征符合CD29、CD73、CD90和CD105阳性(阳性比例均高于95％)，不表达CD14、CD79a、CD34、CD45和HLA-DR(阳性比例均低于2％)，说明符合质量标准。
每份细胞设置3组样本，其中，2组作为使用常规的阿辛蓝(alcian blue)染色法检测法(2组为成软骨诱导组和阴性对照组)，1组用于本发明所述检测方法，通过对比3组数据分析本发明所述检测方法可行。
(一)常规检测方法
分别取3～4×105个细胞加入到2个15ml离心管中，300g离心10分钟，吸去上清后，其中一离心管加入0.5ml成软骨诱导分化完全培养基，作为成软骨诱导组，另一离心管加入0.5ml的hMSCs完全培养基，作为阴性对照组，拧松离心管盖子后放置于37℃，5％CO2的培养箱内培养，每3天用相应培养基全量换液，换液时不要冲散细胞团，换液后轻弹管底让细胞团脱离管底自然悬浮于液体中，诱导21天后，得到软骨细胞小球。
将诱导分化培养21天的细胞小球，用4％多聚甲醛室温条件下固定24小时，用DPBS洗3次后，对固定后的细胞小球进行常规石蜡包埋、切片、脱蜡和脱水处理。组织切片制作完成后用1％阿利辛蓝染色液将切片染色30分钟，自来水小心冲洗2次，蒸馏水冲洗1次，在显微镜下观察染色效果，如果被阿利辛蓝染色液染成蓝色，则说明细胞胞浆内富含糖胺聚糖，具有软骨细胞的生物学特性，结果如图3A-J所示，5组hMSCs均具有成软骨细胞诱导分化能力。
(二)本发明检测方法
将本发明的一组样本，共计5份待检hMSCs采用Invitrogen公司的ReagentRNA提取试剂盒进行RNA抽提，然后将含RNA开关分子序列的pET-3a重组质粒和抽提的RNA混合，再使用Invitrogen公司的ExpresswayTMMilligram Cell-Free E.coli ExpressionSystem体外无细胞表达试剂盒进行蛋白表达，再通过酶标仪进行检测，结果显示(如图4)，5组hMSCs均具有成软骨细胞诱导分化能力，表明本发明所述检测方法可行。
序列表
<110> 深圳科诺医学检验实验室
个体化细胞治疗技术国家地方联合工程实验室（深圳）
<120> 一种人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化能力特异性检测方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 834
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgcggatccc cgaggttacc gttgggacct gggggaccag ggggaccagg aagaaagagg 60
agaaacctgg tccccctact cccccacctg gcggcagcgc aaaagtacca ctcgttcccg 120
ctcctcgaca agtggcccca ccacgggtag gaccagctcg acctgccgct gcatttgccg 180
gtgttcaagt cgcacaggcc gctcccgctc ccgctacggt ggatgccgtt cgactgggac 240
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tggatgccgc acgtcacgaa gtcggcgatg gggctggtgt acttcgtcgt gctgaagaag 360
ttcaggcggt acgggcttcc gatgcaggtc ctcgcgtggt agaagaagtt cctgctgccg 420
ttgatgttct gggcgcggct ccacttcaag ctcccgctgt gggaccactt ggcgtagctc 480
gacttcccgt agctgaagtt cctcctgccg ttgtaggacc ccgtgttcga cctcatgttg 540
atgttgtcgg tgttgcagat atagtaccgg ctgttcgtct tcttgccgta gttccacttg 600
aagttctagg cggtgttgta gctcctgccg tcgcacgtcg agcggctggt gatggtcgtc 660
ttgtgggggt agccgctgcc ggggcacgac gacgggctgt tggtgatgga ctcgtgggtc 720
aggcgggact cgtttctggg gttgctcttc gcgctagtgt accaggacga cctcaagcac 780
tggcggcggc cctagtgaga gccgtacctg ctcgacatgt tcattaagct tggg 834
<210> 2
<211> 5459
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttctcatgtt tgacagctta tcatcgattt cgaattactt gtacagctcg tccatgccga 60
gagtgatccc ggcggcggtc acgaactcca gcaggaccat gtgatcgcgc ttctcgttgg 120
ggtctttgct cagggcggac tgggtgctca ggtagtggtt gtcgggcagc agcacggggc 180
cgtcgccgat gggggtgttc tgctggtagt ggtcggcgag ctgcacgctg ccgtcctcga 240
tgttgtggcg gatcttgaag ttcaccttga tgccgttctt ctgcttgtcg gccatgatat 300
agacgttgtg gctgttgtag ttgtactcca gcttgtgccc caggatgttg ccgtcctcct 360
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cggcgcgggt cttgtagttg ccgtcgtcct tgaagaagat ggtgcgctcc tggacgtagc 480
cttcgggcat ggcggacttg aagaagtcgt gctgcttcat gtggtcgggg tagcggctga 540
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aggtgccggc agcgctctgg gtcattttcg gcgaggaccg ctttcgctgg agcgcgacga 1920
tgatcggcct gtcgcttgcg gtattcggaa tcttgcacgc cctcgctcaa gccttcgtca 1980
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acgcgctggg ctacgtcttg ctggcgttcg cgacgcgagg ctggatggcc ttccccatta 2100
tgattcttct cgcttccggc ggcatcggga tgcccgcgtt gcaggccatg ctgtccaggc 2160
aggtagatga cgaccatcag ggacagcttc aaggatcgct cgcggctctt accagcctaa 2220
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acgggttggc atggattgta ggcgccgccc tataccttgt ctgcctcccc gcgttgcgtc 2340
gcggtgcatg gagccgggcc acctcgacct gaatggaagc cggcggcacc tcgctaacgg 2400
attcaccact ccaagaattg gagccaatca attcttgcgg agaactgtga atgcgcaaac 2460
caacccttgg cagaacatat ccatcgcgtc cgccatctcc agcagccgca cgcggcgcat 2520
ctcgggcagc gttgggtcct ggccacgggt gcgcatgatc gtgctcctgt cgttgaggac 2580
ccggctaggc tggcggggtt gccttactgg ttagcagaat gaatcaccga tacgcgagcg 2640
aacgtgaagc gactgctgct gcaaaacgtc tgcgacctga gcaacaacat gaatggtctt 2700
cggtttccgt gtttcgtaaa gtctggaaac gcggaagtca gcgccctgca ccattatgtt 2760
ccggatctgc atcgcaggat gctgctggct accctgtgga acacctacat ctgtattaac 2820
gaagcgctgg cattgaccct gagtgatttt tctctggtcc cgccgcatcc ataccgccag 2880
ttgtttaccc tcacaacgtt ccagtaaccg ggcatgttca tcatcagtaa cccgtatcgt 2940
gagcatcctc tctcgtttca tcggtatcat tacccccatg aacagaaatc ccccttacac 3000
ggaggcatca gtgaccaaac aggaaaaaac cgcccttaac atggcccgct ttatcagaag 3060
ccagacatta acgcttctgg agaaactcaa cgagctggac gcggatgaac aggcagacat 3120
ctgtgaatcg cttcacgacc acgctgatga gctttaccgc agctgcctcg cgcgtttcgg 3180
tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta 3240
agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg 3300
gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga tagcggagtg tatactggct taactatgcg 3360
gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat 3420
gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 3480
gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 3540
ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 3600
ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 3660
atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 3720
aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 3780
gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta 3840
ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 3900
ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 3960
acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 4020
gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat 4080
ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 4140
ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 4200
gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 4260
ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 4320
agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt 4380
ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc 4440
gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac 4500
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gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctgcag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta 4740
tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt 4800
gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag 4860
tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa 4920
gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc 4980
gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaacac gggataatac cgcgccacat agcagaactt 5040
taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc 5100
tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta 5160
ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa 5220
taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca 5280
tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 5340
aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta 5400
ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt cttcaagaa 5459

Claims (5)

1.一种人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化能力特异性检测方法，其特征在于，所述的方法是将人脐带间充质干细胞mRNA与带有RNA开关分子序列的pET-3a质粒进行混合，再进行体外无细胞蛋白表达，所述的RNA开关分子的核苷酸序列如SEQ N0.1所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的体外无细胞蛋白表达所用的蛋白为增强型绿色荧光蛋白EGFP，可发射绿色荧光，可做定性分析。
3.一种用于人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化能力特异性检测的RNA开关分子，其特征在于，所述的RNA开关分子的核苷酸序列如SEQ N0.1所示。
4.如权利要求3所述的RNA开关分子在制备人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化能力特异性检测试剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的RNA开关分子是构建到pET-3a质粒中的，所述的pET-3a质粒的核苷酸序列如SEQ N0.2所示。
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WO2003095666A2 (en) * 2002-05-13 2003-11-20 Nanocytometry Corporation Oligonucleotide probes for in vitro, in vivo and intracellular detection
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