CN109467565A

CN109467565A - 双氢青蒿素三聚体及其制备方法和应用

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Publication number: CN109467565A
Application number: CN201810936945.2A
Authority: CN
Inventors: 沈征武; 何珮岚; 张菁华
Original assignee: Yunbaiyao Zheng Wu Technology (shanghai) Co Ltd
Current assignee: Yunbaiyao Zheng Wu Technology (shanghai) Co Ltd
Priority date: 2018-08-16
Filing date: 2018-08-16
Publication date: 2019-03-15
Anticipated expiration: 2038-08-16
Also published as: CN109467565B

Abstract

本发明公开了一种具有下述通式(I)的双氢青蒿素三聚体或其异构体、或其可药用盐、或其前药分子，其中，三个双氢青蒿素分子各在其10位与连接体X相连接而形成双氢青蒿素三聚体。本发明还公开了该双氢青蒿素三聚体的制备方法及其在制备治疗癌症的药物中的应用。本发明的双氢青蒿素三聚体，对多株肿瘤细胞显示出很强的抑制活性，且毒性小，应用前景非常广阔。

Description

双氢青蒿素三聚体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及一种双氢青蒿素三聚体及其制备方法和应用。

背景技术

自从上世纪70年代发现青蒿素具有强大的抗疟作用以来，青蒿素，青蒿琥酯，蒿甲醚，双氢青蒿素及其复方制剂分别先后在中国被批准为抗疟药物，并在全球得到广泛应用。同时，该类化合物也被广泛报道具有抗癌作用。其中11，13-位双氢青蒿素显示较明显的抗癌活性。近年来各类青蒿素的衍生物，包括双氢青蒿素及其二聚物，青蒿琥酯，蒿甲醚等化合物的抗癌活性得到广泛和深入的研究。这类化合物在体外实验中不仅对白血病、结肠癌有效，对其他癌症如黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌等均具有良好的活性。

伴随着我国经济建设的发展，人民生活得到了很大的改善。但是同时，由于我国人口老龄化加剧、生态环境遭受破坏、不健康生活方式及食品安全问题凸现，我国肿瘤发病率多年持续上升，已成为一个必须高度重视的公共卫生问题乃至社会问题，根据国际癌症研究署预测，如不采取有效措施，我国癌症发病数和死亡数到2020年将上升至400万人和300万人；2030年将上升至500万人和350万人。国家癌症中心发布的《2012中国肿瘤登记年报》显示，全国肿瘤登记地区恶性肿瘤发病第一位的是肺癌，其次为胃癌、结直肠癌、肝癌和食管癌；死亡第一位的是肺癌，其次为肝癌、胃癌、食管癌和结直肠癌。

肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌分为两大类：小细胞肺癌和非小细胞肺癌。小细胞肺癌主要表现为神经内分泌特性，恶性程度高，生长快，较早出现淋巴转移和血行播散，对化疗和放疗敏感；大多数非小细胞肺癌缺乏神经内分泌特性，组织学上包括鳞癌、腺癌和大细胞癌三大类，对化疗和放疗的敏感性明显低于小细胞肺癌。非小细胞肺癌约占所有肺癌病例的80％-85％，小细胞肺癌占15％-20％。化疗是肺癌的主要治疗方法，90％以上的肺癌需要接受化疗治疗。化疗也是治疗非小细胞肺癌的主要手段，化疗治疗非小细胞肺癌的肿瘤缓解率为40％～50％。化疗一般不能治愈非小细胞肺癌，只能延长患者生存和改善生活质量。随着分子生物学技术的发展，多种分子靶向药物已经投入了临床治疗非小细胞肺癌。目前，治疗非小细胞肺癌的靶向药物有16种，是所有癌种中靶向药物最多的癌种。抗体类大分子靶向药物有6种，小分子靶向药物有10种。CFDA批准在中国上市的有5种，包含4种小分子靶向药物，1种大分子靶向药物。从每年FDA批准上市的靶向药物的数量可以看出，从2011年开始几乎每年都会有针对肺癌的靶向药物上市，2014年非小细胞肺癌的靶向药物上市数量达到了历史峰值，有5种之多。这些靶向药物的上市，对患者减轻了痛苦，延长了其生存期。但是目前而言，由于在大部分肿瘤中仍未检测到驱动突变，因而无法采用靶向药物进行治疗，同时获得性耐药是这类靶向药物最大的缺陷之一。因此发展新的低毒广谱类的肿瘤药物，仍是治疗非小细胞肺癌和耐药性的非小细胞肺癌所面临的重大挑战。

脑胶质瘤是由于大脑和脊髓胶质细胞癌变所产生的、最常见的原发性颅脑肿瘤。脑胶质瘤在儿童及青少年高发，特别是5～9岁儿童发病率最高。儿童病人常以分化较差的极性成胶质细胞瘤、髓母细胞瘤和室管膜瘤为多，成年病人则以星形细胞瘤为多。儿童患者病程短、进展快；常在较短时间内即引起严重的脑干症状；成年患者病程长、进展慢，可数月甚至1年以上始出现严重的脑干症状。近30年来，原发性恶性脑肿瘤发生率逐年递增，年增长率约为1.2％,中老年人群尤为明显。据文献报道，中国脑胶质瘤年发病率为3-8人/10万人，年死亡人数达3万人。胶质瘤系浸润性生长物，它和正常脑组织没有明显界限，难以完全切除，对放疗化疗不甚敏感，非常容易复发，生长在大脑等重要部位的良、恶性肿瘤，手术难以切除或根本不能手术。化学药物和一般抗肿瘤的中药，因血脑屏障等因素的影响，疗效也不理想，因此脑胶质瘤至今仍是全身肿瘤中预后最差的肿瘤之一。

目前，替莫唑胺是治疗胶质瘤唯一有明确疗效的化疗药物。对于高度恶性的脑胶质瘤，替莫唑胺的应用，可以显著延长患者的生存预后。而其他抗肿瘤药物对脑瘤没有明显治疗作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种双氢青蒿素三聚体，该三聚体比双氢青蒿素具有更强的抗癌活性，可应用于各种恶性肿瘤包括非小细胞肺癌、耐药性的肺癌和脑瘤的治疗。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种具有通式(I)的双氢青蒿素三聚体或其异构体、或其可药用盐、或其前药分子，

其中，三个双氢青蒿素分子各在其10位通过连接体X相互连接而形成双氢青蒿素三聚体；

连接体X为具有连接多个分子功能的分子或基团，包括：

含三个以上羟基的多元醇如甘油、季戊四醇、赤藓糖醇、核糖醇、山梨醇(葡萄糖醇)、甘露糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇，以及上述多元醇的衍生物如多元醇酮、多元醇酸、多元醇胺、多元醇酯、多元醇酰胺、多元醇亚胺、多元醇羟胺；

含三个以上羟基的糖如核糖、脱氧核糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖和果糖，以及上述糖的衍生物；

含三个以上羟基的胺类化合物如三乙醇胺、N，N-四乙醇乙二胺等；

含三个以上羟基或酚羟基的芳香化合物如间苯三酚、1，2，4，5-四酚基苯、2，4，5-三酚基苯甲酸、3，5-二酚基苯甲醇、3，5-二羟甲基苯甲醇；

含三个以上羟基的杂环化合物，其包含吡啶类、呋喃类、噁唑及异噁唑类、噻吩类、砒咯类、喹啉类、噻唑及异噻唑类、咪唑类、吲哚类、托烷类、吩噻嗪类、苯并二氮杂卓类、吡唑酮类、哒嗪类、嘧啶类、砒嗪类、哌嗪类、奎宁和异奎宁类、咔唑类、喋啶类；

含三个以上羧基的生物碱衍生物，包括麻黄碱、咖啡碱、小檗碱等生物碱的衍生物；

含有三个以上羧基的多元酸如丙三酸、丁烷四羧酸、EDTA、三羧基苯等。

R包括H，OH，-CF₃，NH₂，-CN，-NO₂，酰胺，卤素，巯基及取代巯基，羧基及其酯或盐，磺酸酯及其盐，亚磺酸酯及其盐，硫酸酯及其盐，1-15个碳原子的烷烃、烯烃或炔烃，含1-15个碳并含1-6个卤素的卤代烷烃、卤代烯烃或卤代炔烃，1-15个碳原子的芳香烃包括含有或不含有取代基的苯基、苄基、卤代芳香烃、酚或多元酚及其酯或醚、芳香羧酸、芳香胺及其衍生物、萘基或萘酚类衍生物，1-15个碳原子的醇或多元醇及这些醇的衍生物如酯、醚、磺酸酯、硫酸酯、硝酸酯、硼酸酯等，1-15个碳原子的羧酸或多元羧酸及其酯或盐，1-15个碳原子的磺酸及其盐，1-15个碳原子的胺、胺盐、季胺盐，1-15个碳原子的酰胺，1-15个碳原子的烷氧基，1-15个碳原子的卤代烷氧基，2-15个碳原子的烷氧基醇或烷氧基多元醇，2-15个碳原子的烷氧基醇或烷氧基多元醇的醚、羧酸酯、磺酸酯或硫酸酯及其盐，2-15个碳原子的烷氧基醚，2-15个碳原子的烷氧基羧酸或烷氧基多元羧酸及其盐，2-15个碳原子的烷氧基磺酸及其盐，2-15个碳原子的烷氧基胺或其胺盐，2-15个碳原子的烷氧基酰胺，含3-15个碳原子的烷氧基烯烃，含3-15个碳原子的烷氧基炔烃，含3-20个碳原子的氨基酸及其衍生物，含3-20个碳原子的氨基醇及其衍生物，3-15个碳的环烷基醚，带有各种取代基的呋喃、砒喃、哌嗪、吡啶、哌啶、吡咯、四氢吡咯、噻吩等含有1-4个杂原子的五元-八元的杂环或苯并杂环，含有或不含有取代基的黄酮或异黄酮，含有或不含有取代基的香豆素，含有或不含有取代基的萜类与倍半萜，含有或不含有取代基的二萜及甾体，含有或不含有取代基的生物碱，3-15个碳的糖如果糖，半乳糖，核糖和脱氧核糖，蔗糖等。

优选的，所述连接体X包括季戊四醇、赤藓糖醇、核糖醇、山梨醇(葡萄糖醇)、甘露糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇，以及上述多元醇的衍生物如多元醇酮、多元醇酸、多元醇胺、多元醇酯、多元醇酰胺、多元醇亚胺、多元醇羟胺；含三个以上羟基的糖如核糖、脱氧核糖、木糖，阿拉伯糖，葡萄糖、甘露糖、半乳糖和果糖。

更优选的，所述连接体X选自：季戊四醇、赤藓糖醇、核糖醇、山梨醇(葡萄糖醇)、甘露糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇。

所述连接体X以三个共价键分别与三个双氢青蒿素分子的10位连接，其立体构型可以是α构型，也可以是β构型。

本发明式(I)中，R可以是连接体自身带入的化学结构或基团，如OH，CH₂OH，COOH，酮基，氨基等，也可以是形成双氢青蒿素三聚体后，通过化学修饰而引入的结构或基团，以改善双氢青蒿素三聚体的水溶性等理化性质，或者改善其体内的生物效应。

本发明通式(I)双氢青蒿素三聚体的异构体包括其所有的异构体，如位置异构体，立体异构体和光学异构体。

优选的，所述通式(I)双氢青蒿素三聚体包括下述具体结构的化合物：

在本发明中，双氢青蒿素三聚体的可药用盐，包括钾盐，钠盐，钙盐，镁盐，或者与天然的和非天然的有机含氮化合物形成的有机盐。

在本发明中，双氢青蒿素三聚体的前药分子，是指药物经化学结构修饰后得到的在体内能迅速转化为上述通式(I)所示母体化合物的化合物，设计前药分子的目的在于增加药物的生物利用度，加强靶向性，降低药物的毒性和副作用等。

在本发明的另一方面，还提供了一种药物组合物，其含有治疗有效量的上述双氢青蒿素三聚体或其异构体、或其可药用盐、或其前药分子，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

上述可接受的载体是无毒的、能辅助施用并且对结合物的治疗效果没有不利影响。此类载体可以是本领域的技术人员通常能得到的任何固体赋形剂、液体赋形剂、半固体赋形剂或者在气雾剂组合物中的气体赋形剂。固体药物赋形剂包括淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、甘油硬脂酰酯、氯化钠、无水脱脂乳等。液体和半固体赋形剂可以选自甘油、丙二醇、水、乙醇和各种油，包括那些源于石油、动物、植物或人工合成的油，例如，花生油、豆油、矿物油、芝麻油等、优选的液体载体，特别是用于可注射溶液的，包括水、盐水、葡萄糖水溶液和甘醇。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明的药物组合物可以通过口服或其他给药方式给药，如注射，透皮给药，喷雾给药，直肠给药，阴道给药等。优选的给药方式是口服，它可根据疾病程度调节。

本发明的药物组合物可以和其他抗癌药物包括中药抗癌药物联合用药，如阿霉素类，博莱霉素，长春碱类，紫杉烷类，依托泊苷，5-氟尿嘧啶，环磷酰胺，甲氨蝶呤，顺铂，维甲酸，替莫唑胺，放线菌素以及靶向药物如伊马替尼、吉非替尼、索拉非尼、厄洛替尼、舒尼替尼、利妥昔单抗、西妥昔单抗、曲妥珠单抗等。

本发明的药物组合物也可以和其他癌症治疗方法联合使用，如手术治疗，放射治疗，骨髓移植等。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规方法制备。例如使该化合物与一种或者多种载体混合，然后将其制成所需的剂型，如片剂、药丸、胶囊、半固体、粉末、缓释剂型、溶液、混悬液、配剂、气雾剂等。

在本发明的另一方面，还提供了上述双氢青蒿素三聚体的制备方法，包括以下步骤：

三个双氢青蒿素分子分别在其10位共价键和连接体X上的羟基或羧基连接，得双氢青蒿素三聚体。

具体的制备方法如下：

路线一：双氢青蒿素在路易斯酸的存在下，直接和连接体X反应，得双氢青蒿素三聚体。

路线二：在连接体X具有多个羟基的情况下，特别是具有立体位阻相对比较小的羟基，如伯羟基和其他的羟基共同存在下，为了使双氢青蒿素连接于连接体X的特定位置，就需要先将连接体X位阻较小的羟基如伯羟基用保护基如乙酰基，苯甲酰基，Piv，氯乙酰基，苄基，MOM，TMS，TES，TMBS，TIPS，TBDPS等进行保护，然后这些有保护基的连接体X在路易斯酸存在下与双氢青蒿素进行反应，使得双氢青蒿素以醚键与连接体X的特定位置的羟基连接，最后，在酸性、碱性或中性的条件下脱掉保护基，得到双氢青蒿素三聚体。

在本发明的另一方面，还提供了上述双氢青蒿素三聚体的第三种制备方法，包括以下步骤：

双氢青蒿素或其衍生物先和一个小分子Y通过酯键，醚键，酰胺键，碳-碳单键或者碳-氮、碳-硫单键连接成为中间体，该中间体再通过共价键与连接体X反应，形成双氢青蒿素三聚体。

其中的一个小分子Y一般含有两到三个可以成键的活性基团，如卤代醇，卤代酸，氨基酸，羟基酸，氨基醇，多元醇如丙二醇、甘油等，多元酸如乙二酸、丙二酸、EDTA等，糖如果糖、核糖、赤藓糖、赤藓糖醇等，多元胺类如乙二胺、丙二胺、丁二胺、苯二胺、哌嗪等，多元酚如间苯酚、间苯三酚及其衍生物，杂环类如哌嗪、氨基噻唑乙酸类衍生物等。优选的一个小分子Y为多元醇或卤代醇如溴代乙醇、乙二醇、丙三醇等。

具体的制备方法如下：

路线一：采用双氢青蒿素和一个小分子Y如多元醇或卤代醇(如溴代乙醇，乙二醇，丙三醇，间苯酚，间苯三酚等)在路易斯酸的存在下，形成带有羟基、酚羟基或溴的中间体Z，然后该中间体Z在路易斯酸或碱的存在下和连接体X反应连接成醚。

路线二：在连接体X反应具有多个羟基的情况下，特别是具有立体位阻相对比较小的羟基如伯羟基和其他位置的羟基共同存在下，为了使双氢青蒿素通过连接体连接于连接体X的特定位置，就需要先将连接体X上位阻较小的羟基如伯羟基用保护基团如乙酰基，苯甲酰基，Piv，氯乙酰基，苄基，MOM，TMS，TES，TMBS，TIPS，TBDPS等进行保护，然后加上了保护基的连接体X在路易斯酸的存在下与中间体Z进行反应，使得双氢青蒿素以醚键与连接体X的特定位置连接，最后，在酸性、碱性或中性的条件下脱掉保护基，得到双氢青蒿素三聚体。

上述反应中，所述酸性条件使用的酸可以是质子酸或路易斯酸，优选为三氟化硼乙醚、对甲苯磺酸、三氟乙酸、硫酸或盐酸。所述碱性条件使用的碱可以是有机碱或无机碱，优选为三乙胺、砒咯烷、碳酸钠或碳酸氢钠。各反应所使用的溶剂可以是质子溶剂或非质子溶剂。优选为：乙醚，四氢呋喃，乙腈，DMF，DMSO，醇，水。反应温度一般在摄氏温度10-80度。

上述反应的粗产物可以用色谱法进一步纯化，一般用柱层析法，填料用硅胶或氧化铝，洗脱剂可以用石油醚-丙酮或石油醚-乙酸乙酯的不同比例的混合。

在本发明的另一方面，还提供了上述双氢青蒿素三聚体或其异构体、或其可药用盐、或其前药分子在制备治疗癌症的药物中的应用。

所述癌症包括脑癌、脑胶质瘤、子宫内膜癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、白血病、淋巴癌、皮肤癌、基底细胞瘤、血管瘤、子宫癌、喉癌、胃癌、唇癌、食道癌、鼻咽癌、胆囊癌、胰腺癌、肾癌、舌癌、膀胱癌、黑素瘤、脂肪瘤、甲状腺癌、胸腺癌、骨癌等。其中肺癌包括非小细胞肺癌、EGFR-TKI耐药的非小细胞肺癌等。

本发明的双氢青蒿素三聚体，合成简单，化学稳定性好，毒性小，在体外试验中对多株肿瘤细胞株都显示出非常强的抑制活性，尤其是对恶性程度非常高的髓母细胞瘤株和EGFR-TKI耐药的非小细胞肺癌细胞显示出了高度的抑制活性。本发明双氢青蒿素三聚体对肿瘤细胞的抑制率明显高于双氢青蒿素，而毒性却远小于紫杉醇，在癌症的治疗方面具有广阔的应用前景。

具体实施方式

实施例1化合物JT-01的制备

-78℃下，三氟化硼乙醚(1mL)缓慢滴加至双氢青蒿素(569mg，2.0mmol)和甘油(92mg，1.0mmol)的乙醚溶液(50mL)中，反应体系自然升至室温后搅拌过夜。TLC监测至反应结束后，用饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)缓慢淬灭反应，乙酸乙酯萃取(30mL×3)，有机相合并后用水(50mL)洗涤1次，饱和食盐水(50mL)洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压旋干即得粗产物，粗产物过柱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝12:1～6:1)得无色油状目标产物231mg(产率：38.8％)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.39(dd,J＝37.9,16.0Hz,3H),4.97(d,J＝3.4Hz,1H),4.80(dd,J＝11.4,3.3Hz,2H),4.04(tdd,J＝13.3,12.0,5.3Hz,3H),3.57(dd,J＝9.7,6.1Hz,1H),3.40(d,J＝6.2Hz,1H),2.74–2.58(m,3H),2.38(ddd,J＝14.1,10.2,3.6Hz,3H),2.04(dd,J＝9.7,6.2Hz,3H),1.96–1.85(m,3H),1.82–1.69(m,6H),1.67–1.63(m,2H),1.54–1.43(m,17H),1.34–1.19(m,6H),0.95(ddd,J＝17.4,7.4,1.5Hz,20H).

¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ104.11(d),103.10(s),102.45(s),101.11(s),88.09(d),87.84(s),81.22–80.94(m),77.30(d),77.04(s),76.72(s),74.84(s),68.73(s),66.87(s),52.75–52.35(m),44.40(d),37.66–37.15(m),36.46(d),34.61(d),30.96(s),30.72(s),26.93(s),26.40–26.05(m),24.55(dd),20.37(d),13.47(s),13.20(s).

实施例2化合物JT-02的制备

-78℃下，三氟化硼乙醚(0.7mL)缓慢滴加至双氢青蒿素(700mg，2.46mmol)和赤藓糖醇(115mg，0.94mmol)的乙醚溶液(50mL)中，反应体系自然升至室温后搅拌过夜。TLC监测至反应结束后，用饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)缓慢淬灭反应，乙酸乙酯萃取(30mL×3)，有机相合并后用水(50mL)洗涤1次，饱和食盐水(50mL)洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压旋干即得粗产物，粗产物过柱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝8:1～3:1)得白色结晶状目标产物197mg(产率：22.7％)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.50(s,1H),5.44(s,1H),5.42–5.40(m,1H),4.91(d,J＝3.3Hz,1H),4.86(d,J＝3.3Hz,1H),4.81(d,J＝3.3Hz,1H),4.21(d,J＝8.6Hz,1H),3.99(dd,J＝10.3,2.4Hz,1H),3.86–3.74(m,3H),3.65(dd,J＝10.3,3.6Hz,1H),2.65(ddt,J＝11.4,7.8,5.6Hz,3H),2.40–2.32(m,3H),2.19(s,1H),2.04–1.97(m,3H),1.92–1.57(m,12H),1.45(ddd,J＝14.7,11.3,4.6Hz,15H),1.30–1.21(m,9H),0.96–0.90(m,18H).

¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ104.28–103.78(m),103.66(s),102.56(d),102.02(s),87.96(t),81.15–80.82(m),78.05(s),77.34(d),77.08(s),76.76(s),69.84(s),69.22(s),67.89(s),60.40(s),52.75–52.28(m),44.31(m),37.37(m),36.39(d),34.92–34.26(m),31.93(s),31.39(s),30.85(d),29.68(d),29.37(s),26.39–25.95(m),25.02–24.08(m),22.70(s),20.76–20.10(m),14.18(d),13.55(s),13.41–12.86(m).

实施例3化合物JT-03-的制备

-78℃下，三氟化硼乙醚(0.7mL)缓慢滴加至双氢青蒿素(700mg，2.46mmol)和赤藓糖醇(115mg，0.94mmol)的乙醚溶液(50mL)中，反应体系自然升至室温后搅拌过夜。TLC监测至反应结束后，用饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)缓慢淬灭反应，乙酸乙酯萃取(30mL×3)，有机相合并后用水(50mL)洗涤1次，饱和食盐水(50mL)洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压旋干即得粗产物，粗产物过柱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝8:1～3:1)得白色结晶状目标产物173mg(产率：19.9％)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.59(s,1H),5.40(s,1H),5.34(d,J＝2.8Hz,1H),4.98(d,J＝3.5Hz,1H),4.82(d,J＝3.3Hz,1H),4.79(d,J＝3.3Hz,1H),4.06–3.92(m,3H),3.86(dd,J＝10.4,7.6Hz,1H),3.54(dd,J＝10.4,3.6Hz,1H),3.46(dd,J＝10.4,5.0Hz,1H),3.08(s,1H),2.66(dt,J＝15.3,5.5Hz,3H),2.37(ddd,J＝14.1,9.2,4.3Hz,3H),2.05–1.97(m,3H),1.94–1.85(m,3H),1.78–1.60(m,9H),1.49–1.39(m,15H),1.30–1.22(m,9H),0.96–0.91(m,18H).

¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ104.25–103.92(m),102.44(d),101.28(s),88.10(s),87.85(d),81.00(dd),77.89(s),77.33(d),77.07(s),76.75(s),70.80(s),69.54(s),67.57(s),60.41(s),52.51(d),44.57–44.08(m),37.67–37.08(m),36.74–35.91(m),34.85–34.09(m),31.93(s),31.02–30.52(m),29.69(d),29.37(s),26.32–25.94(m),25.12–23.82(m),22.70(s),21.08(s),20.39(m),14.18(d),13.40–12.88(m).

实施例4溴乙烷双氢青蒿素醚的制备

0℃下，三氟化硼乙醚(50μL)缓慢滴加至双氢青蒿素(284mg，1.0mmol)和2-溴乙醇(125mg，1.0mmol)的乙醚溶液(20mL)中，反应体系在0℃下搅拌过夜。TLC监测至反应结束后，用饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)缓慢淬灭反应，乙酸乙酯萃取(10mL×3)，有机相合并后用水(20mL)洗涤1次，饱和食盐水(20mL)洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压旋干即得粗产物，粗产物过硅胶柱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝30:1～8:1)得白色固体目标产物203mg(产率：51.9％)。

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.48(s,1H),4.84(d,J＝3.3Hz,1H),4.18–4.07(m,1H),3.81–3.74(m,1H),3.51(t,J＝5.2Hz,2H),2.69–2.59(m,1H),2.40–2.33(m,1H),2.06–1.99(m,1H),1.92–1.84(m,2H),1.76(m,1H),1.68–1.61(m,1H),1.55–1.43(m,5H),1.37–1.21(m,3H),0.95–0.90(m,6H).

13C NMR(101MHz,CDCl3)δ104.10(s),102.02(s),88.13(s),81.08(s),77.42(s),77.11(s),76.79(s),68.16(s),52.56(s),44.35(s),37.38(s),36.39(s),34.66(s),31.47(s),30.89(s),26.16(s),24.65(s),24.36(s),20.39(s),13.00(s).

实施例5双氢青蒿素三聚体对体外培养的各种肿瘤细胞的抑制作用

1.实验原理

采用的肿瘤细胞为：人前列腺癌细胞-PC-3细胞(CRL-1435)、人宫颈癌细胞系-HeLa细胞(CCL-2)、人急性T细胞白血病细胞-Jurkat细胞(TIB-152)、人肾透明细胞腺癌-786-O细胞(CRL-1932)和人乳腺癌细胞-MCF7细胞(HTB-22)，检测本发明上述化合物样品对这些肿瘤细胞株生长的影响作用；以非洲绿猴肾细胞-Vero细胞为正常细胞(CCL-81)，检测化合物样品的细胞毒性作用。在化合物样品干预下，活细胞可利用细胞增殖-毒性检测试剂盒Cell CountingKit-8(CCK-8溶液)进行染色，通过测定其OD值来反映细胞的存活和生长状态，即细胞存活率(％)和细胞生长抑制(％)。并计算出半数细胞存活时的化合物浓度CC₅₀，以及抑制细胞生长为半数时的化合物浓度IC₅₀。

2.实验材料

Vero细胞(CCL-81)、PC-3细胞(CRL-1435)、HeLa细胞(CCL-2)、Jurkat细胞(TIB-152)、786-O细胞(CRL-1932)、MCF7细胞(HTB-22)均购自ATCC；DMEM培养液、F12培养液、MEM培养液、RPMI 1640培养液均购自Gibco公司(Life Technologies)；胎牛血清(FBS)购自Hyclone公司(Thermo Scientific)；胰酶购自Gibco公司(Life Technologies)；CCK-8溶液购自上海东仁化学科技公司；96孔细胞培养板(透明平底)购自Corning公司；SpectraMax190microplate reader酶标仪购自Molecular Devices Corporation。

3.实验方法

含10％FBS的培养液为完全培养液。Vero细胞用DMEM完全培养液进行培养；PC-3细胞用F12完全培养液进行培养；Hela细胞用MEM完全培养液进行培养；Jurkat细胞用RPMI1640完全培养液进行培养；786-O细胞用RPMI 1640完全培养液进行培养；MCF-7细胞用MEM完全培养液进行培养。所有细胞培养成对数生长后，进行以下试验。

贴壁细胞以胰酶消化收集细胞；悬浮细胞直接收集。细胞离心，计数后，用各自完全培养液将细胞调制至5*103个/100μl/孔，接种于透明96孔培养板中；同时每块培养液板中都设置不加细胞、不加样品的空白孔；以及加细胞、不加样品的对照孔。接种后的96孔培养板在37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜。次日将加入测试化合物样品50μl/孔，并加入完全培养液50μl/孔。化合物样品最终试验浓度为100μM、25μM、6.25μM、1.56μM、0.39μM、0.1μM、0.02μM、0.006μM，各个试验浓度为双复孔；对照孔和空白孔用完全培养液替代化合物样品，即加入完全培养液100μl/孔。37℃，5％CO₂培养箱中继续培养48小时。在结束培养前2小时，去培养液，加入含10％CCK-8溶液的完全培养液100μl/孔，至培养结束，酶标仪于450nM(参比650nM)处测定OD值。

根据检测Vero细胞存活率(％)，计算出半数细胞死亡浓度CC₅₀，反应出化合物样品的毒性作用；检测肿瘤细胞株的细胞生长抑制(％)，计算出细胞生长数抑制在半数时的浓度IC₅₀，反应出化合物样品的抗肿瘤活性。

计算公式如下：

细胞存活率(％)＝(化合物样品孔的OD值-空白孔的OD值)/(对照孔的OD值-空白孔的OD值)×100％

细胞生长抑制(％)＝[1-(化合物样品孔的OD值-空白孔的OD值)/(对照孔的OD值-空白孔的OD值)]×100％

4.实验结果

IC50结果见表1，结果显示，双氢青蒿素三聚体对各类肿瘤细胞生长均具有不同程度的抑制，这一系列化合物对受试肿瘤细胞的抑制率均远远强于双氢青蒿素。个别化合物对受试肿瘤细胞的抑制率与紫杉醇相近，而毒性却远远小于紫杉醇。

表1双氢青蒿素三聚体对各类肿瘤细胞的抑制作用

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.具有通式(I)的双氢青蒿素三聚体或其异构体、或其可药用盐、或其前药分子，

连接体X为具有连接多个分子功能的分子或基团，包括含三个以上羟基的多元醇及其衍生物，含三个以上羟基的糖及其衍生物，含三个以上羟基的胺类化合物，含三个以上羟基或酚羟基的芳香化合物，含三个以上羟基或羧基的杂环化合物，或含三个以上羧基的多元酸；

R包括H，OH，CF₃，NH₂，NO₂，酰胺，卤素，巯基及取代巯基，羧基及其酯或盐，磺酸酯及其盐，亚磺酸酯及其盐，硫酸酯及其盐，1-15个碳原子的烷烃、烯烃或炔烃，含1-15个碳并含1-6个卤素的卤代烷烃、卤代烯烃或卤代炔烃，6-15个碳原子的芳香烃、卤代芳香烃、酚或多元酚及其酯或醚、芳香羧酸、芳香胺及其衍生物、萘基或萘酚类衍生物，1-15个碳原子的醇或多元醇及其衍生物，1-15个碳原子的羧酸或多元羧酸及其酯或盐，1-15个碳原子的磺酸及其盐，1-15个碳原子的胺、胺盐、季胺盐，1-15个碳原子的酰胺，1-15个碳原子的烷氧基，1-15个碳原子的卤代烷氧基，2-15个碳原子的烷氧基醇或烷氧基多元醇，2-15个碳原子的烷氧基醇或烷氧基多元醇的醚、羧酸酯、磺酸酯或硫酸酯及其盐，2-15个碳原子的烷氧基醚，2-15个碳原子的烷氧基羧酸或烷氧基多元羧酸及其盐，2-15个碳原子的烷氧基磺酸及其盐，2-15个碳原子的烷氧基胺或其胺盐，2-15个碳原子的烷氧基酰胺，含3-16个碳原子的烷氧基烯烃；含3-16个碳原子的烷氧基炔烃，含3-20个碳原子的氨基酸及其衍生物，含3-20个碳原子的氨基醇及其衍生物，3-15个碳的环烷基醚，含有1-4个杂原子的五元-八元的杂环或苯并杂环，含有或不含有取代基的黄酮或异黄酮，含有或不含有取代基的香豆素，含有或不含有取代基的萜类与倍半萜，含有或不含有取代基的二萜及甾体，含有或不含有取代基的生物碱，3-15个碳的糖。

2.根据权利要求1所述的双氢青蒿素三聚体或其异构体、或其可药用盐、或其前药分子，其特征在于，所述连接体X选自：

含三个以上羟基的多元醇及其衍生物，所述多元醇包含季戊四醇、赤藓糖醇、核糖醇、山梨醇、甘露糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、或木糖醇，所述多元醇衍生物包含多元醇酮、多元醇酸、多元醇胺、多元醇酯、多元醇酰胺、多元醇亚胺、或多元醇羟胺；

含三个以上羟基的糖及其衍生物，所述糖包含核糖、脱氧核糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、或果糖；

含三个以上羟基的胺类化合物，所述胺类化合物包含三乙醇胺、或N，N-四乙醇乙二胺；

含三个以上羟基或酚羟基的芳香化合物，所述芳香化合物包含间苯三酚、1，2，4，5-四酚基苯、2，4，5-三酚基苯甲酸、3，5-二酚基苯甲醇、或3，5-二羟甲基苯甲醇；

含三个以上羟基或羧基的杂环化合物，所述杂环化合物包含吡啶类、呋喃类、噁唑及异噁唑类、噻吩类、砒咯类、喹啉类、噻唑及异噻唑类、咪唑类、吲哚类、托烷类、吩噻嗪类、苯并二氮杂卓类、吡唑酮类、哒嗪类、嘧啶类、砒嗪类、哌嗪类、奎宁和异奎宁类、咔唑类、喋啶类；

含三个以上羧基的天然或非天然的生物碱及其衍生物，包括麻黄碱、咖啡碱、小檗碱；

含三个以上羧基的多元酸，所述多元酸包含丙三酸、丁烷四羧酸、EDTA、或三羧基苯。

3.根据权利要求1所述的双氢青蒿素三聚体或其异构体、或其可药用盐、或其前药分子，其特征在于，所述连接体X通过共价键键与双氢青蒿素的10位连接。

4.根据权利要求1所述的双氢青蒿素三聚体或其异构体、或其可药用盐、或其前药分子，其特征在于，所述式(I)双氢青蒿素三聚体包括：

5.一种药物组合物，其含有治疗有效量的权利要求1～4任意一项所述双氢青蒿素三聚体或其异构体、或其可药用盐、或其前药分子，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

6.权利要求1所述双氢青蒿素三聚体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

三个双氢青蒿素分子分别在其10位以醚键或酯键和连接体X上的羟基或羧基连接，得双氢青蒿素三聚体。

7.权利要求1-4中任一项所述双氢青蒿素三聚体或其异构体、或其可药用盐、或其前药分子，或权利要求5所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述癌症包括脑癌、脑胶质瘤、子宫内膜癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、白血病、淋巴癌、皮肤癌、基底细胞瘤、血管瘤、子宫癌、喉癌、胃癌、唇癌、食道癌、鼻咽癌、胆囊癌、胰腺癌、肾癌、舌癌、膀胱癌、黑素瘤、脂肪瘤、甲状腺癌、胸腺癌、骨癌。

9.权利要求1-4中任一项所述双氢青蒿素三聚体或其异构体、或其可药用盐、或其前药分子，与至少一种另外的抗癌剂或氨基酸类化合物联用在制备治疗癌症的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述另外的抗癌剂包括阿霉素类、博莱霉素、长春碱类、紫杉烷类、依托泊苷、5-氟尿嘧啶、环磷酰胺、甲氨蝶呤、顺铂、维甲酸、替莫唑胺、放线菌素、伊马替尼、吉非替尼、索拉非尼、厄洛替尼、舒尼替尼、利妥昔单抗、西妥昔单抗、曲妥珠单抗、尼伏单抗、潘利珠单抗、阿替珠单抗、度伐单抗、和/或阿维单抗。