CN113444074A

CN113444074A - 一种具有EGFR和Wnt双重抑制作用的化合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113444074A
Application number: CN202010222799.4A
Authority: CN
Inventors: 柯细松; 董佳家; 闫蓉; 马天成; 屈祎; 黄飄
Original assignee: Shanghai Institute of Organic Chemistry of CAS; Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Shanghai Institute of Organic Chemistry of CAS; Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2020-03-26
Filing date: 2020-03-26
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2040-03-26
Also published as: CN113444074B

Abstract

本发明公开了一种具有EGFR和Wnt双重抑制作用的化合物及其制备方法和应用，所述化合物具有式Ⅰ所示的化学结构：

Description

一种具有EGFR和Wnt双重抑制作用的化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明是涉及一种具有EGFR和Wnt双重抑制作用的化合物及其制备方法和其在抗肿瘤药物中的应用，属于化学药物技术领域。

背景技术

癌症是危害人类健康的疾病。癌症的主要治疗手段为外科手术、借助仪器进行放射治疗以及利用化学药物辅助治疗，然而，即使结合这三种方式也无法保证患者痊愈，并且术后容易复发。随着分子生物技术的不断进步以及对癌症发病机制的探索的不断深入，人们开始针对细胞受体、关键基因以及调控分子作为靶点的治疗，称为分子靶向治疗(Molecular Targeted therapy)，但目前靶向治疗药物都是单靶向药物，单靶向药物存在适应范围窄、易耐药缺点，因此，本领域急需开发可用于癌症的多重靶向治疗药物。

研究表明，多种癌症中都存在表皮生长因子受体(Epidermal Growth FactorReceptor,EGFR)过表达现象，如肺癌、宫颈癌、乳腺癌等。EGFR信号通路调控着众多肿瘤发生发展过程中的重要生物学过程，包括促进细胞增殖、分化、蛋白质合成、转移，抑制细胞凋亡及促进血管生成等，是研究的热点信号通路之一。以EGFR为靶标所开发的上市药物吉非替尼(Gefitinib)、阿法替尼(Afatinib)、奥希替尼(Osimertinib)等都表现出了良好的临床效果，但是癌细胞对于Gefitinib、Osimertinib都已经表现出耐药性，尤其是对T790M和C797S基因突变引起的耐药性。

Wnt是遗传学领域的首字母缩写，代表“Wingless/Integrated”。研究表明：Wnt信号通路是一个进化上非常保守的蛋白质作用网络，该通路最先在胚胎发育中发现，通路的异常抑制或激活将导致胚胎发育缺陷；Wnt信号通路不仅与肿瘤侵袭转移的相关事件如癌细胞的迁移黏附、细胞外基质的降解及肿瘤的血管生成密切相关，而且在调节肿瘤干细胞的自我更新、增殖与分化中发挥重要作用；此外，有研究证实Wnt/β-catenin信号通路与化疗耐药性有关。现在已有大量证据证实Wnt信号通路的异常激活和癌症尤其是大肠癌的发生和发展高度相关。由于Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)信号通路在大肠癌发生中的关键作用，过去20多年来世界上有众多研究机构和制药公司致力于Wnt抑制剂的开发研究。不过，迄今为止尚无靶向Wnt/β-catenin信号通路的药物应用于临床。

尤其是，目前还没有对EGFR信号通路和Wnt信号通路均具有抑制作用的双靶向药物的相关报道。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种具有EGFR和Wnt双重抑制作用的化合物及其制备方法和其在抗肿瘤药物中的应用，为癌症治疗提供新途径。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种具有EGFR和Wnt双重抑制作用的化合物，具有式Ⅰ所示的化学结构：

一种制备所述具有EGFR和Wnt双重抑制作用的化合物的方法，包括如下合成路线中的步骤b或步骤a～步骤b：

所述的步骤a是由式Ⅱ化合物在碱性条件下与叠氮化物进行重氮转移反应得到式Ⅲ化合物；所述的步骤b是由式Ⅲ化合物与式Ⅳ化合物在催化剂的作用下进行点击反应(click reaction)得到式Ⅰ化合物(命名为：4-(4-(4-(3-(6,7-双(2-甲氧乙氧基)-喹唑啉-4-胺基)苯基)-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)-1H-吡唑-1-基)-1-叔丁氧羰基-哌啶，简记为JK11)。

一种实施方案，步骤a中，所用的碱为碳酸氢钾，所用的叠氮化物为氟磺酰叠氮(即FSO₂N₃)。

一种实施方案，步骤a中，式Ⅱ化合物与叠氮化物的摩尔比为1:1～2:3。

一种实施方案，步骤b中，所述的催化剂为硫酸铜与抗坏血酸钠的复配物。

一种优选方案，硫酸铜与抗坏血酸钠以摩尔比为1:(5～25)形成复配物。

一种优选方案，所述方法包括如下操作步骤：

1)室温下，先将式Ⅱ化合物溶于有机溶剂中，然后加入碱和叠氮化物，使反应体系混合均匀后于室温下反应；

2)反应结束后，向反应体系中加入抗坏血酸钠水溶液以淬灭反应，得到含有式Ⅲ化合物的反应溶液；

3)再向反应溶液中加入式Ⅳ化合物和催化剂，使反应体系混合均匀后于30～50℃下保温搅拌反应；

4)反应结束后，先使用有机溶剂萃取，然后对萃取液进行饱和食盐水洗涤，再对洗涤后的有机相进行干燥、浓缩和柱层析，即得到式Ⅰ化合物。

一种所述的具有EGFR和Wnt双重抑制作用的化合物的应用，是指以所述化合物或其药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体、前体化合物、水合物、溶剂化物中的至少一种作为活性成分用于制备EGFR抑制剂、Wnt抑制剂或EGFR/Wnt双重抑制剂。

一种所述的具有EGFR和Wnt双重抑制作用的化合物的应用，是指以所述化合物或其药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体、前体化合物、水合物、溶剂化物中的至少一种作为活性成分用于制备治疗和/或预防因EGFR过表达或/和Wnt信号通路过度激活所介导的疾病的药物。

进一步说，所述疾病为癌症。

更进一步说，所述癌症包括但不限于非小细胞肺癌、大肠癌、乳腺癌、宫颈癌、肝癌、骨肉瘤、胰腺癌和前列腺癌，优选非小细胞肺癌、大肠癌。

本发明所述的药物可以各种给药途径给予患者，包括但不限于口服、透皮、肌肉、皮下和静脉注射。

本发明所述的药物的剂型不限，只要是能够使活性成分有效地到达体内的剂型都可以，包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂等；优选口服剂型，如：胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等。

本发明所述药物中，除了含有主要活性成分之外，还可含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或药学上可接受的载体以及各种制剂所必要的辅料等。例如，所述药物为口服剂型时，可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。适宜的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂；适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠；适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁；适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。

本发明中所述术语的定义如下：

术语“药学上可接受的盐”是指所述化合物与药学上可接受的无机酸或有机酸所形成的盐，所述的无机酸包括但不限于：盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸；所述的有机酸包括但不限于：甲酸、乙酸、丙酸、丁二酸、1,5-萘二磺酸、亚细亚酸、草酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、庚二酸、己二酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯丙酸、葡糖酸、抗坏血酸、烟酸、异烟酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸，以及氨基酸；所述“药学上可接受的”是指适用于人而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。

术语“互变异构体”是指因分子中某一原子在两个位置迅速移动而产生的官能团异构体，例如：烯醇与相应的酮。

术语“立体异构体”是指由分子中原子在空间上排列方式不同所产生的异构体，例如：顺反异构体、对映异构体、构象异构体等。

术语“前体化合物”是指在体外无活性，但能够在生物体内进行代谢或化学反应转化为本发明的活性成分，从而发挥其药理作用的化合物。

与现有技术相比，本发明具有如下显著性有益效果：

本发明的研究结果显示：本发明所述的式Ⅰ化合物对EGFR和Wnt信号通路均表现出显著的靶向抑制作用，可望用于制备EGFR抑制剂、Wnt抑制剂或EGFR/Wnt双重抑制剂，尤其是，所述化合物可望用于制备治疗和/或预防因EGFR过表达或/和Wnt信号通路过度激活所介导的癌症的药物，具有药用前景；另外，本发明制备方法简单，无需特殊设备和苛刻条件，易于实现规模化生产，具有极强的实用价值。

附图说明

图1显示了式I化合物抑制Wnt/β-catenin通路且抑制大肠癌细胞增殖的作用；其中：图1A显示了式I化合物(10μM)可以抑制细胞内β-catenin介导的转录活性；图1B显示了在携带有7TGC载体的EPT2细胞中，荧光显微成像证实式I化合物抑制GSK3抑制剂6BIO激活的Wnt信号通路(GFP表达)；图1C显示了斑马鱼胚胎“眼缺失”实验的结果，在斑马鱼胚胎6hpf时给予Wnt/β-catenin通路激活剂(6BIO)同时给予式I所示化合物(2.5、5、10μM)和相同体积的DMSO处理24小时的结果；图1D显示了在斑马鱼胚胎6hpf时给予Wnt/β-catenin通路激活剂(6BIO)同时给予式I化合物(10μM)和相同体积的DMSO处理24小时的结果(放大倍数：40)；图1E显示了式I化合物对大肠癌HCT116和SW480细胞克隆形成的影响；

图2显示了式I化合物具有抑制EGFR作用且抑制肺癌细胞增殖的作用；其中：图2A显示了式1化合物对EGFR激酶表现了抑制活性，其IC50为1057.09nM；图2B显示了式1化合物对在H1975细胞中可以抑制EGFR磷酸化，进而抑制EGFR信号通路；图2C显示了式I化合物对肺癌A549和H1975细胞克隆形成的影响；

图3显示了式I化合物对肺癌细胞(H1975)皮下移植瘤的影响；其中：图3A显示了式I化合物对肿瘤增殖的抑制作用；图3B显示了给药14天后，式I化合物对肿瘤体积的影响；图3C显示了移植瘤取材后的图片；图3D显示了式I化合物对裸鼠皮下异体移植瘤瘤重的抑制情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：式I化合物(简记为JK11)的制备：

室温下，先将式Ⅱ化合物(4-(4-氨基-1H-吡唑-1-基)-1-叔丁氧羰基-哌啶，53.3mg，0.2mmol)溶于DMF(5ml)中，然后加入碳酸氢钾水溶液(3mol/L，0.53ml，1.6mmol)和FSO₂N₃(氟磺酰叠氮)的甲基叔丁基醚溶液(0.4mol/L，2.2ml，0.44mmol)，使反应体系混合均匀后于室温下搅拌反应1小时；

结束反应，向反应体系中加入0.25ml抗坏血酸钠水溶液(0.5mol/L，0.125mmol)以淬灭反应，得到含有式Ⅲ化合物的反应溶液；

然后向反应溶液中加入式Ⅳ化合物(N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧乙氧基)-喹唑啉-4-胺盐酸盐，77.4mg，0.18mmol)及由0.2ml CuSO4水溶液(0.1mol/L,0.02mmol)与0.2ml抗坏血酸钠水溶液(2mol/L，0.4mmol)复配形成的催化剂，使反应体系混合均匀后于40℃下保温搅拌反应6小时；

结束反应，先使用乙酸乙酯萃取，然后对萃取液进行饱和食盐水洗涤，再对洗涤后的有机相进行无水硫酸钠干燥、浓缩和柱层析，即得到式Ⅰ化合物(126.4mg，产率92％)。

经测试：

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)9.57(s,1H),8.98(s,1H),8.52(s,1H),8.46(s,1H),8.29(t,J＝2.0Hz,1H),8.01(s,1H),7.93-7.87(m,2H),7.56(dt,J＝8.0Hz,J＝2.0Hz,1H),7.49-7.43(m,1H),7.20(s,1H),4.48-4.38(m,1H),4.32-4.22(m,4H),4.08-3.97(m,2H),3.79-3.68(m,4H),3.34(s,3H),3.32(s,3H),2.98-2.84(m,2H),2.08-2.00(m,2H),1.86-1.73(m,2H),1.39(s,9H)；ESI-MS(m/z):686.40[M+H]⁺。

实施例2：式I化合物对Wnt/β-catenin通路的抑制作用

实验材料：293FT细胞购自中国科学院细胞库；稳定整合TGC报告系统的EPT2细胞来自挪威卑尔根大学；HCT116细胞购自中国科学院细胞库；SW480细胞购自ATCC；AB系斑马鱼购自国家斑马鱼资源中心。

TOP/Flash实验步骤：293FT细胞接种96孔白板(20000个/孔)，种板24小时后给予转染TOP/Flash质粒及Renilla质粒，6小时后给予JK11(10μM)，处理24小时后，检测荧光素酶的活性。

EPT2-TGC细胞验证步骤：在96孔板中接种稳定整合的TGC报告系统的EPT2细胞，12小时后给予1μM 6-溴靛玉红-3’-肟(6-Bronoindirubin-3’-oxime，6BIO)及DMSO/式I化合物，24小时后利用高内涵细胞成像系统分析GFP和mCherry荧光图像。

斑马鱼胚胎“眼缺失”实验步骤：AB系斑马鱼胚胎6hpf时，根据不同给药组进行分组同时给予相应化合物，其中，模型组给予6BIO(1μM)，式I化合物组在给予6BIO(1μM)的同时给予式I化合物(10μM)；随后在30hpf时观察胚胎状态。

肿瘤细胞克隆形成实验步骤：大肠癌HCT116和SW480细胞接种6孔板(1500个/孔)，温育24小时后给予式I化合物(0、2.5、5、10、20、40μM)，处理14天后，PBS清洗细胞3遍，4％多聚甲醛固定细胞10分钟，弃去多聚甲醛，PBS清洗细胞3遍，结晶紫染色10分钟，PBS清洗3遍，观察克隆情况。

实验结果如图1所示。

图1显示了式I化合物抑制Wnt/β-catenin通路且抑制大肠癌细胞增殖的作用；其中：图1A显示，式I化合物(10μM)可以抑制细胞内β-catenin介导的转录活性；图1B显示，式I化合物对6BIO激活的Wnt信号通路具有抑制作用；图1C和图1D显示，在斑马鱼胚胎发育初期Wnt/β-catenin通路被异常激活会出现“眼缺失现象”，当给予式I化合物后，“眼缺失现象”被救援，表明式I化合物具有Wnt/β-catenin信号通路抑制作用；图1E显示式I化合物对大肠癌HCT116和SW480细胞克隆均具有抑制作用。

本实施例的结果表明：式I化合物对Wnt信号通路具有抑制作用，可望用于制备Wnt抑制剂，尤其是可望用于制备治疗和/或预防因Wnt信号通路过度激活所介导的癌症的靶向药物。

实施例3：式I化合物对EGFR的抑制作用

实验材料：A549细胞购自中国科学院细胞库；A549细胞购自中国科学院细胞库；P-EGFR，EGFR和GAPDH抗体购自CST；对照药厄洛替尼(Erlotinib)购自Sigma。

EGFR激酶检测：采用LANCE Ultra酶活性评价法进行了EGFR激酶抑制活性测试。按照布置每孔加入2.5μL激酶溶液，对照孔加入2.5μL反应液，按照布置每孔加入2.5μL化合物(JK11或阳性对照物))溶液，对照孔加入2.5μL反应液，按照布置每孔中加5μL基底溶液，每孔加入10μL Eu-anti-phospho-4E-BP1和EDTA反应试剂，离心以便混匀，室温下放置平衡60分钟，Eu-anti-phospho-4E-BP1抗体终浓度是2nM，EDTA终浓度是8mM，Envision读取荧光数值。

收集H1975细胞蛋白步骤：将H1975细胞接种于6孔板中，12小时后换新鲜培养基每孔1mL后，将配置好的终浓度的各个药物按每孔1μL加入。设置DMSO阴性对照，6孔板置37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养，24小时后RIPA提取细胞蛋白，BSA蛋白定量，置-20℃保存。

肿瘤细胞克隆形成实验步骤：肺癌A549和H1975细胞接种6孔板(1500个/孔)，温育24h后给予式I所示化合物(0、2.5、5、10、20、40μM)，处理14天后，PBS清洗细胞3遍，4％多聚甲醛固定细胞10分钟，弃去多聚甲醛，PBS清洗细胞3遍，结晶紫染色10分钟，PBS清洗3遍，观察克隆情况。

实验结果如图2所示。

图2显示了式I化合物具有抑制EGFR作用且抑制肺癌细胞增殖的作用；其中：图2A显示式1化合物对EGFR激酶表现了抑制活性，其IC50为1057.09nM；图2B显示式1化合物对在H1975细胞中可以抑制EGFR磷酸化，进而抑制EGFR信号通路；图2C显示了式I化合物对肺癌A549和H1975细胞克隆形成均有抑制作用。

本实施例的结果表明：式I化合物对EGFR具有抑制作用，可望用于制备EGFR抑制剂，尤其是可望用于制备治疗和/或预防因EGFR过表达所介导的癌症的靶向药物。

实施例4：式I所示化合物对肺癌细胞(H1975)皮下移植瘤的影响

实验材料：BALB/c裸鼠(四周龄)，雄性，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。BALB/c裸鼠在SPF级条件下饲养。

溶液配制：水作为溶媒，将式I化合物溶解配制成混悬液。

细胞培养：每日观察H1975细胞状态，当细胞状态良好，即对数生长期时，可消化收集细胞，加入1mL PBS，小心清洗两遍细胞沉淀，将细胞沉淀重悬于PBS中，将细胞密度调整至为5×10⁵个/mL。

裸鼠皮下注射：取待接种的裸鼠，用酒精棉擦拭裸鼠注射部位(右肩胛)，再次吹打细胞悬液防止细胞聚集，用1mL医用注射器将H1975细胞悬液注射入裸鼠皮下，每只注射1×10⁵个/0.2mL，并且需要特别注意每次注射前均需重悬细胞，避免因细胞不匀而造成成瘤情况出现偏差，并缓慢注入右肩胛皮下，经常观察并记录成瘤情况，瘤体积＝1/2×长度×宽度²。

实验分组：在第7天，皮下移植瘤生长至可触及时，按照肿瘤体积随机分为正常对照组和式I化合物组(50mg·kg^-1)，每组10只。

除对照组外，每日灌胃式I化合物(50mg·kg^-1)，正常对照组每日灌胃等量水，连续给药14天后处死小鼠，测量肿瘤体积并称取肿瘤重量，在给药期间每周称重3次。

实验结果如图3所示。

图3显示了式I化合物对肺癌细胞(H1975)皮下移植瘤的影响；由图3可见：通过口服给药式I化合物可显著降低小鼠皮下移植瘤体积及瘤重，而各给药组小鼠体重未见明显差异，说明式I化合物具有抗癌作用，可望用于制备治疗和/或预防癌症药物，尤其是用于制备治疗和/或预防肺癌的药物。

最后需要在此指出的是：以上仅是本发明的部分优选实施例，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种具有EGFR和Wnt双重抑制作用的化合物，其特征在于，所述化合物具有式Ⅰ所示的化学结构：

2.一种制备权利要求1所述化合物的方法，其特征在于，包括如下合成路线中的步骤b或步骤a～步骤b：

所述的步骤a是由式Ⅱ化合物在碱性条件下与叠氮化物进行重氮转移反应得到式Ⅲ化合物；所述的步骤b是由式Ⅲ化合物与式Ⅳ化合物在催化剂的作用下进行点击反应得到式Ⅰ化合物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤a中，所用的碱为碳酸氢钾，所用的叠氮化物为氟磺酰叠氮。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤b中，所述的催化剂为硫酸铜与抗坏血酸钠的复配物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：硫酸铜与抗坏血酸钠以摩尔比为1:(5～25)形成复配物。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下操作步骤：

7.一种权利要求1所述化合物的应用，其特征在于：以所述化合物或其药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体、前体化合物、水合物、溶剂化物中的至少一种作为活性成分用于制备EGFR抑制剂、Wnt抑制剂或EGFR/Wnt双重抑制剂。

8.一种权利要求1所述化合物的应用，其特征在于：以所述化合物或其药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体、前体化合物、水合物、溶剂化物中的至少一种作为活性成分用于制备治疗和/或预防因EGFR过表达或/和Wnt信号通路过度激活所介导的疾病的药物。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述疾病为癌症。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述癌症包括但不限于非小细胞肺癌、大肠癌、乳腺癌、宫颈癌、肝癌、骨肉瘤、胰腺癌和前列腺癌。