JPWO2016152907A1

JPWO2016152907A1 - 胆管癌治療剤

Info

Publication number: JPWO2016152907A1
Application number: JP2017508383A
Authority: JP
Inventors: 龍弘柴田; 康仁新井; 野本　研一; 研一野本; 富雄中村; 鶴岡　明彦; 明彦鶴岡; 沙里宮野
Original assignee: Eisai R&D Management Co Ltd; National Cancer Center Japan
Current assignee: Eisai R&D Management Co Ltd; National Cancer Center Japan
Priority date: 2015-03-25
Filing date: 2016-03-23
Publication date: 2018-01-18
Anticipated expiration: 2036-03-23
Also published as: KR102537152B1; CN107205996A; US20190111043A1; AU2016237222B2; KR20170126443A; RU2712222C2; EP3275442A1; CN114984013A; IL253701A0; MX2017009892A; ES2887148T3; IL253701B; SG11201706143SA; CA2974937C; RU2017127135A3; BR112017016392B1; JP6503450B2; CA2974937A1; RU2017127135A; US20180015079A1

Abstract

本発明は、５−（（２−（４−（１−（２−ヒドロキシエチル）ピペリジン−４−イル）ベンズアミド）ピリジン−４−イル）オキシ）−６−（２−メトキシエトキシ）−Ｎ−メチル−１Ｈ−インドール−１−カルボキサミドまたはその薬理学的に許容される塩を含む、胆管癌治療剤を提供する。

Description

本発明は、ＦＧＦＲ阻害作用を有する単環ピリジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩を含有する、胆管癌治療剤に関する。

式（Ｉ）で表される化合物は、５−（（２−（４−（１−（２−ヒドロキシエチル）ピペリジン−４−イル）ベンズアミド）ピリジン−４−イル）オキシ）−６−（２−メトキシエトキシ）−Ｎ−メチル−１Ｈ−インドール−１−カルボキサミドとして知られる。式（Ｉ）で表される化合物は、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）１、２および３に対する阻害作用を有し、胃癌、肺癌、膀胱癌および子宮内膜癌の細胞増殖抑制作用を有することが報告されている（特許文献１）。

胆管癌は、その発生率は低いものの、予後の悪い腫瘍として知られている。胆管癌の主な治療方法は、外科手術による胆管の摘出であるが、癌細胞を完全に摘出しきれない場合も多い。このような場合には、手術後にゲムシタビンとシスプラチンの併用投与が行われている（非特許文献１）。

米国特許出願公開第２０１４−２３５６１４号明細書

Celina Ang,"Role of the fibroblast growth factor receptor axis incholangiocarcinoma", Journal of Gastroenterology and Hepatology, vol.30,p.1116-1122, 2015.

しかしながら、これまでに報告されている胆管癌治療剤では、十分な治療効果が得られない。

このような状況に鑑み、本発明者らは鋭意検討を行った結果、式（Ｉ）で表される化合物が胆管癌の治療に有効であることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は以下の［１］〜［１２］を提供する。
［１］式（Ｉ）で表される５−（（２−（４−（１−（２−ヒドロキシエチル）ピペリジン−４−イル）ベンズアミド）ピリジン−４−イル）オキシ）−６−（２−メトキシエトキシ）−Ｎ−メチル−１Ｈ−インドール−１−カルボキサミドまたはその薬剤学的に許容される塩を含有する胆管癌治療剤。

［２］胆管癌が肝内胆管癌である、［１］に記載の治療剤。
［３］式（Ｉ）で表される５−（（２−（４−（１−（２−ヒドロキシエチル）ピペリジン−４−イル）ベンズアミド）ピリジン−４−イル）オキシ）−６−（２−メトキシエトキシ）−Ｎ−メチル−１Ｈ−インドール−１−カルボキサミドまたはその薬剤学的に許容される塩を有効成分として含有する、胆管癌治療用の医薬組成物。
［４］胆管癌が肝内胆管癌である、［３］に記載の医薬組成物。
［５］式（Ｉ）で表される５−（（２−（４−（１−（２−ヒドロキシエチル）ピペリジン−４−イル）ベンズアミド）ピリジン−４−イル）オキシ）−６−（２−メトキシエトキシ）−Ｎ−メチル−１Ｈ−インドール−１−カルボキサミドまたはその薬剤学的に許容される塩の薬理学的有効量を患者に投与して、胆管癌を治療する方法。
［６］前記患者は、投与前にＦＧＦＲ２融合タンパクをコードする遺伝子を有することが確認されている、［５］に記載の方法。
［７］前記ＦＧＦＲ２融合タンパクをコードする遺伝子が、ＦＧＦＲ２−ＡＨＣＹＬ１、ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１ｔｙｐｅ１、ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１ｔｙｐｅ２、ＦＧＦＲ２−ＴＸＬＮＡ、またはＦＧＦＲ２−ＫＣＴＤ１である、［６］に記載の方法。
［８］胆管癌が肝内胆管癌である、［５］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］胆管癌治療のための、式（Ｉ）で表される５−（（２−（４−（１−（２−ヒドロキシエチル）ピペリジン−４−イル）ベンズアミド）ピリジン−４−イル）オキシ）−６−（２−メトキシエトキシ）−Ｎ−メチル−１Ｈ−インドール−１−カルボキサミドまたはその薬剤学的に許容される塩。
［１０］胆管癌が肝内胆管癌である、［９］に記載の化合物またはその薬剤学的に許容される塩。
［１１］胆管癌治療剤の製造のための、式（Ｉ）で表される５−（（２−（４−（１−（２−ヒドロキシエチル）ピペリジン−４−イル）ベンズアミド）ピリジン−４−イル）オキシ）−６−（２−メトキシエトキシ）−Ｎ−メチル−１Ｈ−インドール−１−カルボキサミドまたはその薬剤学的に許容される塩の使用。
［１２］胆管癌が肝内胆管癌である、［１１］に記載の使用。

本発明によれば、胆管癌の治療に有効である可能性のある治療剤を提供することができる。

ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１ｔｙｐｅ１およびｔｙｐｅ２遺伝子の構造を示す模式図である。各種ＦＧＦＲ２融合遺伝子を導入したマウス線維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３の培養で得られたタンパク質を、ウエスタンブロット解析した結果を示す図である。ＦＧＦＲ２融合遺伝子を導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞株の培養で得られたンパク質を、ウエスタンブロット解析した結果を示す図である。各種ＦＧＦＲ２融合遺伝子を導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞株の培養で得られたタンパク質の分析結果を示す図である。ＦＧＦＲ２融合遺伝子を導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞株の増殖能に対するＦＧＦＲ阻害剤の効果を示す図である。ＦＧＦＲ２融合遺伝子を導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞株の増殖能に対するＦＧＦＲ阻害剤の効果を示す図である。ＦＧＦＲ２融合遺伝子を導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞株の増殖能に対するＦＧＦＲ阻害剤の効果を示す図である。

本発明の一実施形態は、式（Ｉ）で表される５−（（２−（４−（１−（２−ヒドロキシエチル）ピペリジン−４−イル）ベンズアミド）ピリジン−４−イル）オキシ）−６−（２−メトキシエトキシ）−Ｎ−メチル−１Ｈ−インドール−１−カルボキサミドまたはその薬剤学的に許容される塩を含有する胆管癌治療剤である。

本明細書において、薬理学的に許容される塩とは、例えば無機酸との塩、有機酸との塩、または酸性アミノ酸との塩などを挙げることができる。

無機酸との塩の好適な例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などとの塩が挙げることができる。

有機酸との塩の好適な例としては、酢酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、ステアリン酸、安息香酸などのカルボン酸との塩、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などのスルホン酸との塩を挙げることができる。

酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩を挙げることができる。

好ましい薬理学的に許容される塩は、コハク酸塩またはマレイン酸塩であり、より好ましい塩はコハク酸塩である。薬理学的に許容される塩としては、式（Ｉ）で表される化合物に対して、質量基準で１．５倍のコハク酸を含む塩（１．５コハク酸塩）が特に好ましい。

本発明に係る式（Ｉ）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩は、例えば、特許文献１に記載された方法により製造することができる。

本明細書において、胆管（ｂｉｌｉａｒｙｄｕｃｔ）という用語を、胆道（ｂｉｌｉａｒｙｔｒａｃｔ）と同義のものとして扱う。すなわち、胆管癌とは、肝内胆管癌、肝外胆管癌、胆嚢管癌、胆嚢癌または十二指腸乳頭部癌を意味する。また、これらの癌が胆管以外の部位に転移したものも含まれる。本発明の胆管癌治療剤は、肝内胆管癌に対して特に有効である。

本発明の胆管癌治療剤は、錠剤、顆粒剤、細粒剤、粉剤、カプセル剤等の固形製剤または液剤、ゼリー剤、シロップ剤等の経口投与用製剤であってもよい。また、本発明の胆管癌治療剤は注射剤、坐剤、軟膏剤、パップ剤等の非経口投与用製剤であってもよい。

経口投与用製剤を製造する場合には、式（Ｉ）で表される化合物またはその薬剤学的に許容される塩に、必要に応じて、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤等の薬剤学的に許容される担体を添加してもよい。また、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等は、必要に応じて、コーティングを施してもよい。

注射剤（静脈内投与用、筋肉内投与用、皮下投与用、腹腔内投与用等）を製造する場合には、式（Ｉ）で表される化合物またはその薬剤学的に許容される塩に、必要に応じて、ｐＨ調整剤、緩衝剤、懸濁化剤、溶解補助剤、抗酸化剤、保存剤（防腐剤）、等張化剤等の薬剤学的に許容される担体を添加し、常法により注射剤を製造することができる。また、凍結乾燥して、用時溶解型の凍結乾燥製剤としてもよい。

外用剤を製造する場合には、式（Ｉ）で表される化合物またはその薬剤学的に許容される塩に、基剤原料を添加し、必要に応じて、前記の例えば、保存剤、安定剤、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、着色剤等の薬剤学的に許容される担体を加えて、常法により、例えば、経皮吸収製剤（軟膏剤、貼付剤等）、点眼剤、点鼻剤、坐剤等を製造することができる。

使用する基剤原料としては、例えば、医薬品、医薬部外品、化粧品等に通常使用される各種原料を用いることが可能である。

本発明の胆管癌治療剤は、式（Ｉ）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を用いて、第十六改正日本薬局方に記載された方法で製造することができる。

本発明の胆管癌治療剤における、式（Ｉ）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩の投与量は、症状の程度、患者の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与時期、投与間隔、医薬製剤の種類等に応じて、適宜選択することができる。本発明の胆管癌治療剤を経口投与する場合、式（Ｉ）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩の投与量が成人（体重６０ｋｇ）に対して、１日あたり１００μｇ〜１０ｇ、好ましくは５００μｇ〜１０ｇ、さらに好ましくは１ｍｇ〜５ｇとなるように投与してもよい。本発明の胆管癌治療剤は、１日１〜３回に分けて投与することができる。

本発明によれば、式（Ｉ）で表される化合物またはその薬剤学的に許容される塩を患者に投与して、胆管癌を治療する方法を提供することができる。投与する対象は、胆管癌患者であることが好ましく、肝内胆管癌患者であることがより好ましく、ＦＧＦＲ２融合タンパクをコードする遺伝子（ＦＧＦＲ融合遺伝子）を有する胆管癌患者であることが特に好ましい。

ＦＧＦＲ２融合遺伝子とは、ＦＧＦＲ２遺伝子と特定の他の遺伝子とが融合した遺伝子を意味し、例えば、ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１ｔｙｐｅ１、ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１ｔｙｐｅ２（配列番号５）、ＦＧＦＲ２−ＴＸＬＮＡ（配列番号１）、ＦＧＦＲ２−ＡＨＣＹＬ１、ＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ６、ＦＧＦＲ２−ＫＣＴＤ１（配列番号３）、ＦＧＦＲ２−ＭＧＥＡ５、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ３、ＦＧＦＲ２−ＰＰＨＬＮ１、ＦＧＦＲ２−ＫＩＡＡ１５９８、ＦＧＦＲ２−ＣＣＡＲ１、ＦＧＦＲ２−ＮＯＬ４、ＦＧＦＲ２−ＰＡＲＫ２等が挙げられる。ここで、図１に示すように、ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１ｔｙｐｅ１は、ＢＩＣＣ１遺伝子のＫＨＫＨ配列の５’末端側でＦＧＦＲ２と融合した遺伝子を指し、ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１ｔｙｐｅ２は、ＢＩＣＣ１遺伝子のＳＡＭ領域（ステライル（ｓｔｅｒｉｌｅ）αモチーフ）の５’末端側でＦＧＦＲ２と融合した遺伝子を指す。ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１ｔｙｐｅ１は、１５７４個のアミノ酸からなるペプチドをコードするのに対し、ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１ｔｙｐｅ２は、８３５個のアミノ酸からなるペプチド（配列番号６）をコードする。なお、ＢＩＣＣ１ｔｙｐｅ１は、ＢＩＣＣ１ｔｙｐｅ２が発見されるまでＢＩＣＣ１とも呼ばれていた。

ＦＧＦＲ２融合タンパクを有する胆管癌患者としては、ＦＧＦＲ２−ＡＨＣＹＬ１、ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１ｔｙｐｅ１、ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１ｔｙｐｅ２、ＦＧＦＲ２−ＴＸＬＮＡまたはＦＧＦＲ２−ＫＣＴＤ１を有する患者が好ましく、ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１ｔｙｐｅ２、ＦＧＦＲ２−ＴＸＬＮＡまたはＦＧＦＲ２−ＫＣＴＤ１を有する患者がより好ましく、ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１ｔｙｐｅ２を有する患者が特に好ましい。

本発明の胆管癌治療剤を投与する前に、投与される対象が、ＦＧＦＲ２融合遺伝子を有するかどうかを診断してもよい。ＦＧＦＲ２融合遺伝子の有無の診断方法は、一般的に使用される遺伝子診断方法であってもよい。

以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明する。

製造例１
５−（（２−（４−（１−（２−ヒドロキシエチル）ピペリジン−４−イル）ベンズアミド）ピリジン−４−イル）オキシ）−６−（２−メトキシエトキシ）−Ｎ−メチル−１Ｈ−インドール−１−カルボキサミド１．５コハク酸塩（以下、化合物Ａと表記する場合がある）の製造

５−（（２−（４−（１−（２−ヒドロキシエチル）ピペリジン−４−イル）ベンズアミド）ピリジン−４−イル）オキシ）−６−（２−メトキシエトキシ）−Ｎ−メチル−１Ｈ−インドール−１−カルボキサミド２．９３ｇをナスフラスコに量り取り、６０ｍＬのエタノールを加え、攪拌しながらオイルバスで７０℃に加熱し、溶解させた。コハク酸（１．２３ｇ）を加えた後、オイルバスの加熱を止め、徐冷した。室温で約２時間攪拌した後、さらに５℃で１時間攪拌した。生じた固体をろ取して、化合物Ａを得た（３．７０ｇ）。
¹H-NMR Spectrum(600MHz, CD₃OD) δ(ppm): 1.96-2.10 (4H, m), 2.52 (6H, s), 2.93 (1H, m), 2.96 (3H, s),3.01 (2H, m), 3.16 (2H, t, J=5.4 Hz), 3.22 (3H, s), 3.56 (2H, t, J=4.7 Hz),3.61 (2H, m), 3.87 (2H, t, J=5.4 Hz), 4.14 (2H, t, J=4.6 Hz), 6.61 (1H, d, J=3.6Hz), 6.68 (1H, dd, J=5.8, 2.3 Hz), 7.37 (1H, s), 7.42 (2H, d, J=8.3 Hz), 7.58(1H, d, J=3.6 Hz), 7.73 (1H, d, J=2.2 Hz), 7.88 (2H, d, J=8.3 Hz), 8.08 (1H,s), 8.15 (1H, d, J=5.8 Hz).
¹³C-NMRSpectrum (100MHz, solid state) δ(ppm): 27.1, 28.3, 29.7, 34.8, 38.0, 41.3, 54.0, 57.3, 59.7, 60.9,72.1, 72.5, 103.3, 104.2, 108.5, 116.9, 126.9, 128.6, 134.5, 136.7, 140.7,149.4, 151.3, 155.1, 169.5, 170.1, 175.6, 179.9, 183.7.

ＦＧＦＲ２融合遺伝子の作製
胆道がん患者由来のがん組織より、３種のＦＧＦＲ２融合遺伝子（ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１ｔｙｐｅ２（配列番号５）、ＦＧＦＲ２−ＴＸＬＮＡ（配列番号１）、ＦＧＦＲ２−ＫＣＴＤ１（配列番号３））のｃＤＮＡをそれぞれ調製した。得られた各ＦＧＦＲ２融合遺伝子ｃＤＮＡのアミノ基側末端にＦＬＡＧエピトープタグをコードする塩基配列を翻訳の読み枠に合わせて連結し、ｐＭＸｓレトロウイルスベクターにクローニングして、レトロウイルスを作製した。ここで、上記連結されたＦＧＦＲ２融合遺伝子を「野生型ＦＧＦＲ２融合遺伝子」ともいう。なお、ＦＬＡＧエピトープタグのペプチド配列は、Ｈ_２Ｎ−ＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＣＯＯＨ（分子量：１０１２Ｄａ）である。
ここで、ＦＧＦＲ２、ＴＸＬＮＡ及びＫＣＴＤ１の各ｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号７、９、１１に対応し、ＦＧＦＲ２、ＴＸＬＮＡ及びＫＣＴＤ１がコードするペプチドの配列は、それぞれ配列番号８、１０、１２に対応する。

次に、野生型ＦＧＦＲ２融合遺伝子におけるＦＧＦＲ２キナーゼをコードする部位内の２つのアミノ酸をさらに変異させたレトロウイルスを作製した。変異とは、５６８番目の残基であるチロシンをフェニルアラニンに置換（Ｙ５６８Ｆ）し、５６９番目の残基であるチロシンをフェニルアラニンに置換（Ｙ５６９Ｆ）したことを意味する。ここで、野生型ＦＧＦＲ２融合遺伝子に対して上記変異を加えた遺伝子を、「ＫＤ変異型ＦＧＦＲ２融合遺伝子」ともいう。

これらのレトロウイルスをそれぞれ、マウス不死化繊維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３細胞に感染させて、野生型ＦＧＦＲ２融合遺伝子またはＫＤ変異型ＦＧＦＲ２融合遺伝子を導入し、それぞれがコードするタンパクを安定的に発現する細胞株を得た。
cDNA cloning:
pMXs vector (CellBiolabs), Plat-Eretrovirus packaging cell (CellBiolabs)

試験例１：Immunoblotanalysis
まず、マウス線維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３にレトロウイルスを用いて、野生型ＦＧＦＲ２融合遺伝子またはＫＤ変異型ＦＧＦＲ２融合遺伝子を導入し、得られた細胞株を液体培地で培養した。培養した細胞株を血清飢餓処理した後に、ＦＧＦＲ阻害剤を含有する培地で処理してから総タンパク質を抽出した。ここで、ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１ｔｙｐｅ２がコードするタンパク、ＦＧＦＲ２−ＴＸＬＮＡがコードするタンパク、ＦＧＦＲ２−ＫＣＴＤ１がコードするタンパクは、それぞれ配列番号６、２、４に示すとおりである。

得られた総タンパク質について、各種抗体を用いたウエスタンブロット解析を行うことにより、融合遺伝子の下流シグナルの解析を行った。
装置：
WesternBreeze chemilumiscentimmunodetection kit (Lifetechnologies)
ＦＧＦＲ阻害剤：
BGJ398 (S2183, Selleck chemicals), 10mMDMSO溶液で保管
PD173074 (S1264, Selleck chemicals), 10mMDMSO溶液で保管
化合物Ａ (20mM DMSO溶液で保管)
抗体：
FLAG (#635691, Clontech Laboratories, Inc.)
phospho FGFR-Y653/654 (#3476, Cellsignaling technologyジャパン株式会社)
phospho AKT1-S473 (#4060, Cell signalingtechnologyジャパン株式会社)
AKT-pan (#4691, Cell signaling technologyジャパン株式会社)
phospho STAT3-Y705 (#9145, Cell signalingtechnologyジャパン株式会社)
STAT3 (#610189, Becton Dickinson andCompany)
phospho MAPK-T202/Y204 (#9106, Cellsignaling technologyジャパン株式会社)
MAPK (#4695, Cell signaling technologyジャパン株式会社)
beta-actin (#A5441, Sigma-Aldrich Co. LLC.)
抗体アレイ：
PathScan RTK signaling antibody array(Chemiluminescent Readout) (#7982, Cell signaling technologyジャパン株式会社)

得られた結果を図２に示す。図２に示すように、ＦＧＦＲ２キナーゼ活性依存的にＭＡＰＫ遺伝子のリン酸化（ＭＡＰＫ遺伝子の活性化）が生じることがわかった。すなわち、ＦＧＦＲ２融合遺伝子を導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞は、足場非依存性増殖能を有していた。なお、図２中、「Ｗｉｌｄ」は、野生型ＦＧＦＲ２融合遺伝子を意味し、「ＫＤ」は、ＫＤ変異型ＦＧＦＲ２融合遺伝子を意味する。

次に、ＦＧＦＲ２融合遺伝子を導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞株を、ＦＧＦＲ阻害剤を添加し（ＦＧＦＲ阻害剤の最終濃度：０．２μＭまたは０．５μＭ）、同様に総タンパク質を抽出した後、ウエスタンブロット解析を行った。

得られた結果を図３に示す。図３に示すように、ＦＧＦＲ阻害剤で処理することにより、ＦＧＦＲのリン酸化が抑制されるとともに、ＭＡＰＫのリン酸化も顕著に抑制された。なお、図３中、「ＢＧ」はＢＧＪ３９８を意味し、「ＰＤ」はＰＤ１７３０７４を意味し、「Ｅ９」は化合物Ａを意味する。具体的には、例えば、「ＢＧ−０．２」は、ＢＧＪ３９８を最終濃度が０．２μＭになるように添加したことを意味する。

さらに、ＦＧＦＲ２融合遺伝子を導入していないＮＩＨ３Ｔ３細胞株、ならびに、ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１ｔｙｐｅ２、ＦＧＦＲ２−ＴＸＬＮＡまたはＦＧＦＲ２−ＫＣＴＤ１を導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞株から同様に、総タンパク質を抽出した。抽出した総タンパク質９０μｇを用いて、ＰａｔｈＳｃａｎ（登録商標）アレイを用いて、発現しているタンパクについて分析した。

図４に示すように、リン酸化されたＡｋｔ（ｐＡｋｔ−Ｓ４７３）、リン酸化されたＭＡＰＫ（ｐＭＡＰＫ−Ｔ２０２／Ｙ２０４）およびリン酸化されたＳ６リボソームタンパク（ｐＳ６−Ｓ２３５／２３６）が検出された。

試験例２：Colonyformation assay
以下の装置を用いて、ＦＧＦＲ２融合ポリペプチドの形質転換能に対するＦＧＦＲ阻害剤の効果を評価した。すなわち、ＦＧＦＲ２融合遺伝子を導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞株を、ソフトアガー培地（培地中のアガー濃度：４ｍｇ／ｍＬ）に播種し、当該培地中にＦＧＦＲ阻害剤を添加して（ＦＧＦＲ阻害剤の最終濃度：０．２μＭ）、足場非依存性コロニー形成能を評価した。
装置：
CytoSelect 96-Well Cell TransformationAssay kit (CBA-130, CellBiolabs)
ＦＧＦＲ阻害剤：
BGJ398 (S2183, Selleck chemicals), 10mMDMSO溶液で保管
PD173074 (S1264, Selleck chemicals), 10mMDMSO溶液で保管
化合物Ａ (20mM DMSO溶液で保管)

得られた結果を図５および図６に示す。図５および図６に示すように、ＦＧＦＲ２融合遺伝子のうち、ＦＧＦＲ２−ＴＸＬＮＡおよびＦＧＦＲ２−ＫＣＴＤ１を導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞の足場非依存性増殖は、ＦＧＦＲ阻害剤の添加により顕著に抑制された。一方、ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１ｔｙｐｅ２を導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞の足場非依存性増殖は、ＢＧＪ３９８またはＰＤ１７３０７４をＦＧＦＲ阻害剤として使用した場合に、ほとんど抑制されないのに対し、化合物ＡをＦＧＦＲ阻害剤として使用した場合に、顕著に抑制された。なお、図５および図６中、「ＢＧ」はＢＧＪ３９８を意味し、「ＰＤ」はＰＤ１７３０７４を意味し、「Ｅ９」は化合物Ａを意味する。

なお、図７に示すように、ＢＧＪ３９８またはＰＤ１７３０７４を最終濃度が１．０μＭとなるように増加させると、当該足場非依存性増殖は抑制された。なお、図７中、「ＢＧ」はＢＧＪ３９８を意味し、「ＰＤ」はＰＤ１７３０７４を意味する。

試験例３：Colonyformation assayによるIC_５０値算出
１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシン（和光純薬工業）を含むＤ−ＭＥＭ（和光純薬工業）培地を用い、５％ＣＯ_２インキュベーター中（３７℃）で、ＦＧＦＲ２融合遺伝子を導入した各種ＮＩＨ３Ｔ３細胞株の培養維持をおこなった。９６ウェルプレート（住友ベークライト）の各ウェルに、０．６６％アガー培地（ＤＩＦＣＯＡｇａｒＮｏｂｌｅ、日本ベクトンディッキンソン）を含むＤ−ＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ）（１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む）を５０μＬずつ加えた。細胞数が４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製した細胞懸濁液（ＦＧＦＲ２−ＴＸＬＮＡ発現細胞の細胞数は８×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製された）と、０．６６％アガー培地液を等量ずつ混ぜ、５０μＬずつ重層し４℃で３０分程度冷やし固めた。プレートを室温に戻した後、０．６６％アガー培地液をさらに５０μＬずつ重層した。１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地にて希釈した化合物Ａを、各ウェルに５０μＬずつ添加し、５％ＣＯ_２インキュベーター中（３７℃）で１４日間培養した。細胞数測定キット（ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ−８、同仁化学研究所）１０μＬを各ウェルに添加し、５％ＣＯ_２インキュベーター中（３７℃）で１−２時間培養し発色させた。マルチラベルリーダー（ＡＲＶＯ、パーキンエルマー社）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。化合物Ａを添加していない場合の吸光度を１００％、細胞が存在していないウェルの吸光度を０％として、化合物Ａ存在下での吸光度率を求めた。細胞増殖を５０％阻害するのに必要な化合物Ａの濃度（ＩＣ_５０値）を求め、表１に示した。

試験例４：皮下移植モデルマウスにおける抗腫瘍効果
（１）皮下移植モデルマウスの作製
各ＦＧＦＲ２融合遺伝子（ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１ｔｙｐｅ２、ＦＧＦＲ２−ＫＣＴＤ１、ＦＧＦＲ２−ＴＸＬＮＡ）を導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞株を、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培養液で培養した。
１×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、得られた培養液にＤ−ＰＢＳ（−）（和光純薬工業）を加えて、細胞懸濁液をそれぞれ調製した。
これらの細胞懸濁液を、７週齢のヌードマウス（系統：ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕ／ｎｕ、雌、日本クレア株式会社）の右脇腹皮下部に、１００μＬの投与量で移植し、ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１ｔｙｐｅ２移植モデルマウス、ＦＧＦＲ２−ＫＣＴＤ１移植モデルマウスおよびＦＧＦＲ２−ＴＸＬＮＡ移植モデルマウスを作製した。移植から６日後に、デジタルノギス（商品名：デジマチック^ＴＭキャリパ、株式会社ミツトヨ）を用いて、腫瘍の短径、長径を計測した。腫瘍の短径および長径に基づき、以下の計算式で腫瘍体積を算出した。
腫瘍体積（ｍｍ^３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）／２
（２）化合物Ａ溶液の調製
化合物Ａを注射用水にて溶解し、投与直前まで４℃にて遮光条件で保存した。マウスに２０ｍＬ／ｋｇの用量で投与した場合に、化合物Ａの投与量が６．２５、１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇとなるように調製した。
（３）薬液の投与
投与初日の腫瘍体積に基づき、各群の腫瘍体積の平均値がほぼ等しくなるように、マウスを群分けした。１群あたりのマウスの数は５匹とした。化合物Ａ投与群のマウスには、化合物Ａ溶液を２０ｍＬ／ｋｇの投与量で、１日１回連続経口投与した。一方、コントロール群のマウスには、溶媒のみ（注射用水）を同様に投与した。ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１ｔｙｐｅ２またはＦＧＦＲ２−ＫＣＴＤ１移植モデルマウスには７日間、ＦＧＦＲ２−ＴＸＬＮＡ移植モデルマウスには１１日間、投与を行った。
投与初日と投与最終日に、コントロール群、化合物Ａ投与群それぞれのマウスの体重を測定した。初日の体重に対する最終日の体重比（ｒｅｌａｔｉｖｅｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔ：ＲＢＷ）を算出した。化合物Ａ投与群のＲＢＷ／コントロール群のＲＢＷが、０．９以上だった場合に、安全な投与量と判定した。これに該当する投与量は、６．２５、１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇであった。
また、投与最終日に、腫瘍体積を測定した。コントロール群のマウスの腫瘍体積に対する化合物Ａ投与群のマウスの腫瘍体積の割合（Ｔ／Ｃ）（％）を算出した。

各移植モデルマウスにおけるＴ／Ｃ（％）の結果を表２〜表４に示した。

Claims

式（Ｉ）で表される５−（（２−（４−（１−（２−ヒドロキシエチル）ピペリジン−４−イル）ベンズアミド）ピリジン−４−イル）オキシ）−６−（２−メトキシエトキシ）−Ｎ−メチル−１Ｈ−インドール−１−カルボキサミドまたはその薬剤学的に許容される塩を含有する胆管癌治療剤。
胆管癌が肝内胆管癌である、請求項１に記載の治療剤。
式（Ｉ）で表される５−（（２−（４−（１−（２−ヒドロキシエチル）ピペリジン−４−イル）ベンズアミド）ピリジン−４−イル）オキシ）−６−（２−メトキシエトキシ）−Ｎ−メチル−１Ｈ−インドール−１−カルボキサミドまたはその薬剤学的に許容される塩を有効成分として含有する、胆管癌治療用の医薬組成物。
胆管癌が肝内胆管癌である、請求項３に記載の医薬組成物。
式（Ｉ）で表される５−（（２−（４−（１−（２−ヒドロキシエチル）ピペリジン−４−イル）ベンズアミド）ピリジン−４−イル）オキシ）−６−（２−メトキシエトキシ）−Ｎ−メチル−１Ｈ−インドール−１−カルボキサミドまたはその薬剤学的に許容される塩の薬理学的有効量を患者に投与して、胆管癌を治療する方法。
前記患者は、投与前にＦＧＦＲ２融合タンパクをコードする遺伝子を有することが確認されていることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
ＦＧＦＲ２融合タンパクをコードする遺伝子が、ＦＧＦＲ２−ＡＨＣＹＬ１、ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１ｔｙｐｅ１、ＦＧＦＲ２−ＢＩＣＣ１ｔｙｐｅ２、ＦＧＦＲ２−ＴＸＬＮＡ、またはＦＧＦＲ２−ＫＣＴＤ１である、請求項６に記載の方法。
胆管癌が肝内胆管癌である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
胆管癌治療のための、式（Ｉ）で表される５−（（２−（４−（１−（２−ヒドロキシエチル）ピペリジン−４−イル）ベンズアミド）ピリジン−４−イル）オキシ）−６−（２−メトキシエトキシ）−Ｎ−メチル−１Ｈ−インドール−１−カルボキサミドまたはその薬剤学的に許容される塩。
胆管癌が肝内胆管癌である、請求項９に記載の化合物またはその薬剤学的に許容される塩。
胆管癌治療剤の製造のための、式（Ｉ）で表される５−（（２−（４−（１−（２−ヒドロキシエチル）ピペリジン−４−イル）ベンズアミド）ピリジン−４−イル）オキシ）−６−（２−メトキシエトキシ）−Ｎ−メチル−１Ｈ−インドール−１−カルボキサミドまたはその薬剤学的に許容される塩の使用。
胆管癌が肝内胆管癌である、請求項１１に記載の使用。