CN109457009A - 一种小分子黄芪螯合肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种小分子黄芪螯合肽的制备方法，包括以下步骤：将黄芪粉碎，加水煎煮；然后加入果胶酶和α‑L‑鼠李糖苷酶，搅拌酶解；再加入罗汉果蛋白酶、植酸酶和漆酶，继续酶解；将酶解液酶灭活，分离纯化，加入大豆肽，升温至45‑50℃，搅拌30‑45min，得螯合液，将所述螯合液浓缩，干燥，得小分子黄芪螯合肽。本发明制备的黄芪螯合肽产品的纯度高，肽分子量为180～500道尔顿的肽含量可达到99％以上，通过复合酶的酶解，不但降解了黄芪中的过敏源，而且还降解了黄芪中人体难以消化和利用的物质，有效避免了长期服用黄芪加重肠胃负担问题的出现，可广泛应用于食品、保健品、药品等领域。

Description

一种小分子黄芪螯合肽的制备方法

技术领域

本发明涉及生物肽分离技术领域，尤其涉及一种小分子黄芪螯合肽的制备方法。

背景技术

多种氨基酸和多种矿物质元素是人体所必需的营养素，这些营养素主要从食物摄取。食物进入人体经胃和小肠消化后，蛋白质水解为氨基酸和部分小分子短肽，小肽和游离氨基酸的吸收是两个独立的转运系统，与游离氨基酸相比，小肽具有吸收速度快、耗能低、不易饱和，且各种肽之间的转运无竞争性与抑制性等特点。最新研究表明，小肽可提高矿物元素的吸收利用率，即小肽可与Ca、Zn、Cu、Fe等矿物质元素形成螯合物，增加其可溶性，以利于机体吸收。小分子短肽螯合物，既能以中性分子配合物(螯合物)形式在生物体内不受阻碍地转运，又能被小肠整体吸收，这就显示出小分子短肽的许多优势：可加快蛋白质的合成、提高矿物质元素的吸收利用率、提高动物机体的免疫力、具有生理调节作用等。

黄芪是百姓经常食用的纯天然品，被誉为补气诸药之最，民间流传着“常喝黄芪汤，防病保健康”的说法，至今已有2000多年的药用历史。其主要含皂甙、多糖、氨基酸、叶酸及硒、锌、铜、钙等多种微量元素。现代医学研究表明，黄芪有增强机体免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗应激、降压和较广泛的抗菌作用。采用传统的煎煮方法存在有效成分煎煮不完全，造成有效成分的流失的缺陷，而且煎煮过程温度高容易破坏其热敏性成分，导致黄芪的功效不能充分发挥出来，造成黄芪资源的浪费。

发明内容

针对现有黄芪提取工艺中有效成分提取不完全以及热敏性成分容易破坏，导致黄芪功效不能充分发挥的问题，本发明提供一种小分子黄芪螯合肽的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：

一种小分子黄芪螯合肽的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、将黄芪粉碎，加入纯化水，搅拌均匀，煎煮，得煎煮混合物；

步骤二、将所述煎煮混合物降温至55-58℃，加入果胶酶和α-L-鼠李糖苷酶，搅拌酶解，得第一酶解液；

步骤三、向所述第一酶解液中加入罗汉果蛋白酶、植酸酶和漆酶，搅拌均匀，升温至55-58℃，搅拌酶解，得第二酶解液；

步骤四、将所述第二酶解液加热升温进行酶灭活，分离纯化，得黄芪提取液；

步骤五、向所述黄芪提取液中加入大豆肽，升温至45-50℃，搅拌30-45min，得螯合液，将所述螯合液浓缩，干燥，得小分子黄芪螯合肽。

相对于现有技术，本发明提供的小分子黄芪螯合肽的制备方法，首先通过复合酶分步酶解法对黄芪进行提取，使得黄芪中的黄芪皂甙、低聚糖、维生素以及铁、硒、钙等活性成分被充分提取出来，通过选用特定的酶对黄芪蛋白进行切割，制备具有高螯合活性的多肽，使得制备的黄芪多肽能够高效螯合低聚糖以及铁、钙、硒等微量元素；通过添加大豆肽，有利于黄芪多肽螯合物的形成，使螯合反应进行的更彻底，提高螯合效率，并且更重要的是，还能提高螯合物的稳定性，同时还能弥补一般中草药提取物中蛋白质酶解后肽含量低的缺点。

本发明制备的小分子螯合肽产品中除了黄芪皂苷、维生素等活性物质，还含有黄芪小分子肽、黄芪糖肽、黄芪肽螯合铁、钙、硒等矿物质元素的螯合物以及黄芪糖肽螯合铁、钙、硒等矿物质元素的螯合物。小分子短肽螯合物可提高氨基酸在体内的吸收速率，减少氨基酸之间的拮抗作用，还可减少Ca、Zn、Cu、Fe等矿物质元素或者其他微量元素之间的拮抗作用，使黄芪中的功效成分能够更好地被吸收，提高生物利用度。

通过复合酶的酶解，不但降解了黄芪中的过敏源，而且还降解了黄芪中人体难以消化和利用物质，有效避免了长期服用黄芪加重肠胃负担，诱发消化不良或者腹胀腹痛问题的出现，使产品可以广泛应用在药品、保健品和食品领域中。

可选的，浓缩采用双效浓缩器，浓缩液采用喷雾干燥的方式进行干燥。

优选的，步骤一中，所述纯化水的加入量为黄芪重量的7～8倍。

优选的，步骤一中，所述煎煮的温度为90-95℃，煎煮时间为4-5h。

优选的煎煮步骤，有助于瓦解细胞壁，促使细胞内蛋白的溶出，缩短黄芪蛋白提取和多肽制备的时间。

优选的，步骤二中，所述果胶酶的加入量为黄芪重量的1-1.5％，所述α-L-鼠李糖苷酶的加入量为黄芪重量的0.5-0.8％。

优选的，步骤二中搅拌酶解的时间为20-40min。

优选的，步骤三中，所述罗汉果蛋白酶的加入量为黄芪重量的1-1.5％，所述植酸酶的加入量为黄芪重量的0.5-0.8％，所述漆酶的加入量为黄芪重量的0.4-0.6％。

优选的，步骤三中，搅拌酶解的时间为3-4h。

优选的酶解方法，可充分提取黄芪中的低聚糖、黄芪皂甙、铁、硒、钙等微量元素和维生素，通过上述优选的复合酶分步酶解的方法，可切割出具有高螯合活性的黄芪多肽，使得制备的黄芪多肽与低聚糖、铁、硒、钙等微量元素高效螯合，使黄芪的功效充分发挥出来。同时，上述复合酶制备的酶解物没有苦涩味，产品口感好，充分满足食品和保健品原料的要求。

优选的酶的加入量既保证高效酶解，还能避免蛋白酶的浪费。

优选的，步骤四中，将所述酶解液加热升温至90-95℃，保温10-15分钟进行酶灭活。

优选的，步骤四中，分离纯化的具体步骤为：将灭活后的第二酶解液依次经卧螺离心机和三相离心机离心，收集上清液，然后将所述上清液经孔径为1.0纳米的纳滤膜过滤。

可选的，所述的卧锣离心机的转述为3600r/min，所述三相离心机的转述为18000r/min。

卧螺离心机适合粘稠液体的过滤，比板框过滤机效率更高，通过卧螺离心机初步过滤除去不溶物，然后通过三相离心机除去酶解液中的油脂和其它悬浮物，可以提高过滤效率，提高提取多肽的纯度，通过三相离心机进一步去除酶解液中的不溶物，可提高后续纳滤的效率，解决纳滤膜过滤难的问题。

通过三相离心机分离以后得到的酶解液进一步经过孔径为1.0纳米的纳滤膜过滤，可以除去酶解液中的盐类物质和少量活性较低的大分子蛋白和多肽，进一步提高小分子黄芪提取液的纯度，获得分子量分布范围集中的小分子黄芪螯合肽，使分子量在1000道尔顿以下的肽含量达到99％以上，同时避免由于多肽中由于盐类物质的存在而造成感较差问题的出现。

优选的，步骤五中，所述大豆肽的加入量为黄芪重量的15-20％。

优选的，步骤五中，所述大豆肽的纯度为85-90％，其中分子量小于1000道尔顿的多肽占所含肽总量的93-97％。

大豆肽的加入，有利于肽与低聚糖和铁、硒、钙等矿物质元素螯合物的形成，提高螯合效率，还能提高螯合物的稳定性；通过肽与低聚糖、单糖等糖类物质螯合，使糖类物质充分分散开来，还能解决由于提取物中存在糖类物质而导致的物料易粘附干燥设备，干燥难的问题。

优选的，步骤五中，搅拌速度为36-45r/min。

优选的搅拌速度可以使大豆肽和提取得到的黄芪多肽充分与低聚糖以及矿物质元素进行螯合反应，提高螯合效率。

本发明还提供了一种小分子黄芪螯合肽，由上述的小分子黄芪螯合肽的制备方法制得。

本发明制备的小分子黄芪螯合肽产品可使人体更好的消化吸收黄芪中的有效成分，提高黄芪的生物利用度，且长期服用不会增加肠胃负担，而且口感好，无异味，无苦味，可广泛应用于食品、保健品、药品等领域。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种小分子黄芪螯合肽的制备方法：

步骤一、选取干黄芪100g，粉碎，加入700ml纯化水搅拌均匀，在90℃条件下，煎煮5h，得煎煮混合物；

步骤二、将所述煎煮混合物降温至55℃，加入1g的果胶酶和0.5g的α-L-鼠李糖苷酶，以75r/min的转速搅拌酶解20min，得第一酶解液；

步骤三、向所述第一酶解液中加入1g罗汉果蛋白酶、0.5g植酸酶和0.4g漆酶，搅拌均匀，升温至55℃，以75r/min的转速搅拌酶解4h，得第二酶解液；

步骤四、将所述第二酶解液升温至90℃，灭酶15分钟；灭酶后用卧锣离心机过滤去除酶解残渣，卧螺离心机的转速为3600r/min；再用三相离心机过滤纯化，三相离心机的转速为18000r/min，去除不溶物，得离心液，将所述离心液经纳滤膜为1.0nm的纳滤机过滤，得黄芪提取液；

步骤四、向所述黄芪提取液中加入15g大豆肽，升温至45℃，以36r/min的转速搅拌45min，得螯合液；将所述螯合液用双效浓缩器进一步浓缩；浓缩液喷雾干燥后，得到小分子黄芪螯合肽产品。

其中，步骤五中，所述大豆肽的纯度为85％，其中分子量小于1000道尔顿的多肽占所含肽总量的93％。

本实施例黄芪蛋白的提取率为95％，蛋白质降解为多肽的转化率为90％，黄芪皂苷提取率为9.23％，第二酶解液中相对分子量在1000道尔顿以下的小分子肽占提取多肽含量的90.1％，制备得到的小分子螯合肽产品中相对分子质量在1000道尔顿以下的小分子螯合肽含量为99.4％。

实施例2

一种小分子黄芪螯合肽的制备方法：

步骤一、选取干黄芪10Kg，粉碎，加入75L纯化水搅拌均匀，在92℃条件下，煎煮4.5h，得煎煮混合物；

步骤二、将所述煎煮混合物降温至56℃，加入120g的果胶酶和60g的α-L-鼠李糖苷酶，以75r/min的转速搅拌酶解25min，得第一酶解液；

步骤三、向所述第一酶解液中加入120g罗汉果蛋白酶、60g植酸酶和50g漆酶，搅拌均匀，升温至56℃，以75r/min的转速搅拌酶解3.5h，得第二酶解液；

步骤四、将所述第二酶解液升温至92℃，灭酶12分钟；灭酶后用卧锣离心机过滤去除酶解残渣，卧螺离心机的转速为3600r/min；再用三相离心机过滤纯化，三相离心机的转速为18000r/min，去除不溶物，得离心液，将所述离心液经纳滤膜为1.0nm的纳滤机过滤，得黄芪提取液；

步骤四、向所述黄芪提取液中加入1.8Kg大豆肽，升温至46℃，以40r/min的转速搅拌35min，得螯合液；将所述螯合液用双效浓缩器进一步浓缩；浓缩液喷雾干燥后，得到小分子黄芪螯合肽产品。

其中，步骤五中，所述大豆肽的纯度为88％，其中分子量小于1000道尔顿的多肽占所含肽总量的95％。

本实施例黄芪蛋白的提取率为93％，蛋白质降解为多肽的转化率为92％，黄芪皂苷提取率为9.35％，第二酶解液中相对分子量在1000道尔顿以下的小分子肽占提取多肽含量的89.5％，制备得到的小分子螯合肽产品中相对分子质量在1000道尔顿以下的小分子螯合肽含量为99.2％。

实施例3

一种小分子黄芪螯合肽的制备方法：

步骤一、选取干黄芪100Kg，粉碎，加入800L纯化水搅拌均匀，在95℃条件下，煎煮4h，得煎煮混合物；

步骤二、将所述煎煮混合物降温至58℃，加入1.5Kg的果胶酶和800g的α-L-鼠李糖苷酶，以75r/min的转速搅拌酶解20min，得第一酶解液；

步骤三、向所述第一酶解液中加入1.5Kg罗汉果蛋白酶、800g植酸酶和600g漆酶，搅拌均匀，升温至58℃，以75r/min的转速搅拌酶解3h，得第二酶解液；

步骤四、将所述第二酶解液升温至95℃，灭酶10分钟；灭酶后用卧锣离心机过滤去除酶解残渣，卧螺离心机的转速为3600r/min；再用三相离心机过滤纯化，三相离心机的转速为18000r/min，去除不溶物，得离心液，将所述离心液经纳滤膜为1.0nm的纳滤机过滤，得黄芪提取液；

步骤四、向所述黄芪提取液中加入20Kg大豆肽，升温至50℃，以45r/min的转速搅拌30min，得螯合液；将所述螯合液用双效浓缩器进一步浓缩；浓缩液喷雾干燥后，得到小分子黄芪螯合肽产品。

其中，步骤五中，所述大豆肽的纯度为90％，其中分子量小于1000道尔顿的多肽占所含肽总量的97％。

本实施例黄芪蛋白的提取率为96％，蛋白质降解为多肽的转化率为91％，黄芪皂苷提取率为9.12％，第二酶解液中相对分子量在1000道尔顿以下的小分子肽占提取多肽含量的91.3％，制备得到的小分子螯合肽产品中相对分子质量在1000道尔顿以下的小分子螯合肽含量为99.2％。

对比例1

本对比例提供一种小分子黄芪螯合肽的制备方法，制备方法与实施例4相同，不同的是步骤三为：向所述第一酶解液中加入1.5Kg罗汉果蛋白酶、800g木瓜蛋白酶和600g漆酶，搅拌均匀，升温至58℃，以75r/min的转速搅拌酶解3h，得第二酶解液。

本对比例中黄芪蛋白的提取率为82％，蛋白质降解为多肽的转化率为80％，黄芪皂苷提取率为7.98％，第二酶解液中相对分子量在1000道尔顿以下的小分子肽占提取多肽含量的83.7％，制备得到的小分子螯合肽产品中相对分子质量在1000道尔顿以下的小分子螯合肽含量为92.4％。

综上所述，本发明采用复合酶分步酶解的方法，充分提取黄芪中的有效成分，通过选择特定的对黄芪蛋白进行酶解，使得蛋白质降解为多肽的转化率可达90％以上，黄芪总皂苷的提取率可达9％以上，通过本发明选择的复合酶可制备分子量较为集中的小分子肽，而且还可切割出具有高螯合活性的多肽；通过添加大豆肽，可使螯合反应进行的更彻底，提高螯合物的稳定性，更有利于人体吸收，且长期服用不会增加肠胃负担。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种小分子黄芪螯合肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、将黄芪粉碎，加入纯化水，搅拌均匀，煎煮，得煎煮混合物；

步骤二、将所述煎煮混合物降温至55-58℃，加入果胶酶和α-L-鼠李糖苷酶，搅拌酶解，得第一酶解液；

步骤三、向所述第一酶解液中加入罗汉果蛋白酶、植酸酶和漆酶，搅拌均匀，升温至55-58℃，搅拌酶解，得第二酶解液；

步骤四、将所述第二酶解液加热升温进行酶灭活，分离纯化，得黄芪提取液；

步骤五、向所述黄芪提取液中加入大豆肽，升温至45-50℃，搅拌30-45min，得螯合液，将所述螯合液浓缩，干燥，得小分子黄芪螯合肽。

2.如权利要求1所述的小分子黄芪螯合肽的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述纯化水的加入量为黄芪重量的7～8倍；和/或

所述煎煮的温度为90-95℃，煎煮时间为4-5h。

3.如权利要求1所述的小分子黄芪螯合肽的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述果胶酶的加入量为黄芪重量的1-1.5％，所述α-L-鼠李糖苷酶的加入量为黄芪重量的0.5-0.8％；和/或

步骤二中搅拌酶解的时间为20-40min。

4.如权利要求1所述的小分子黄芪螯合肽的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述罗汉果蛋白酶的加入量为黄芪重量的1-1.5％，所述植酸酶的加入量为黄芪重量的0.5-0.8％，所述漆酶的加入量为黄芪重量的0.4-0.6％。

5.如权利要求1所述的小分子黄芪螯合肽的制备方法，其特征在于，步骤三中，搅拌酶解的时间为3-4h。

6.如权利要求1所述的小分子黄芪螯合肽的制备方法，其特征在于，步骤四中，将所述酶解液加热升温至90-95℃，保温10-15分钟进行酶灭活。

7.如权利要求1所述的小分子黄芪螯合肽的制备方法，其特征在于，步骤四中，分离纯化的具体步骤为：将灭活后的第二酶解液依次经卧螺离心机和三相离心机离心，收集上清液，然后将所述上清液经孔径为1.0纳米的纳滤膜过滤。

8.如权利要求1所述的小分子黄芪螯合肽的制备方法，其特征在于，步骤五中，所述大豆肽的加入量为黄芪重量的15-20％。

9.如权利要求1或8所述的小分子黄芪螯合肽的制备方法，其特征在于，步骤五中，所述大豆肽的纯度为85-90％，其中分子量小于1000道尔顿的多肽占所含肽总量的93-97％；和/或

步骤五中，搅拌速度为36-45r/min。

10.一种小分子黄芪螯合肽，其特征在于，所述小分子黄芪螯合肽由权利要求1-9任一项所述的小分子黄芪螯合肽的制备方法制得。