CN109453394A - 基于介孔纳米碳球掺杂金纳米颗粒材料的探针及其制备 - Google Patents

基于介孔纳米碳球掺杂金纳米颗粒材料的探针及其制备 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于介孔纳米碳球掺杂金纳米颗粒材料的探针及其制备方法，探针包括介孔碳纳米球、生长在介孔碳纳米球内部孔道壁上的金纳米颗粒、负载在介孔碳纳米球孔道中的有机荧光物以及通过化学键连接在介孔碳纳米球表面的靶向分子。与现有技术相比，本发明既可以实现诊断监测，又可以作为治疗探针，具有良好的靶向性和基于PTT、PDT实现的优异的治疗效果。最终，合成的探针成功的消融了肿瘤(MGC‑803细胞的荷瘤小鼠的肿瘤)，而且进行了体内和体外的荧光成像。另外，位于介孔碳纳米球内部的金颗粒，不仅仅很好的被保护起来，而且充分发挥了纳米酶的催化的作用。

Description

基于介孔纳米碳球掺杂金纳米颗粒材料的探针及其制备
技术领域
本发明涉及癌细胞诊疗探针技术领域，具体涉及一种基于介孔纳米碳球掺杂金纳米颗粒材料的探针及其制备。
背景技术
众所周知，癌症是全国乃至全球发病率和致死率较高的重大疾病，给人类生活和健康安全带来了极大的威胁。癌症是威胁人类生命健康的一大杀手，也是医学领域的一大难题。癌症的早期诊断对于肿瘤的治疗具有重要的意义，早期的精准治疗能够实现肿瘤的良好的治疗效果。目前临床上的诊断技术尚有不足，早起的诊断效果并不理想。早期诊断手段的缺乏导致肿瘤患者的诊疗不理想，所以找到一种能够精准进行早期诊断的技术对于肿瘤治疗有不可磨灭的重大意义。现今，医学上传统的成像手段是磁共振成像技术，正电子成像技术，计算机断层扫描，超声技术和X射线等等。但是，这些成像技术的精准性，灵敏性和特异性比较低，不能够实现早期的诊断的目的。同时，某些诊断方法存在一定的辐射性，对患者和诊断学者都产生一定的负面作用，对身体的健康存在一定的危害。现如今，靶向性治疗和早期的诊断技术的研究得到了广泛的研究，激起了医学研究者的极大关注。常见的分子影像技术主要包括MRI,CT,PET,超声成像,近红外荧光成像等等，这些技术广泛的运用于医学诊断之中，为医学诊疗做出了不可磨灭的贡献。
PTT主要是吸收近红外光之后，基于近红外光的良好的穿透性，能够将吸收的近红外光转化为热，从而造成肿瘤部位的凋亡，并且产生很小的副作用。这种治疗手段，需要光热试剂的配合使用。另外，光动力治疗是基于使用的光敏剂，在对应吸收的光的作用下，能够产生大量的单线氧，从而造成肿瘤细胞的凋亡和死亡。除此之外，大多数光敏剂和光热试剂能够在外部的光激发下，产生一定的荧光，可以进行近红外呈现，从而对肿瘤部位进行成像诊断的效果。近红外光成像具有灵敏度高，成本比较低，无创无辐射，并能实时监测体内生物信息等优良特性，因此广泛的运用于医学领域。
用于肿瘤的靶向成像的近红外荧光探针往往需要具备以下的条件：(1)优良的光学性质，吸收发射波长的斯托克斯位移比较大、较高的消光系数和良好的稳定性。(2)生物相容性好和水溶性优良。(3)生物毒性小，能够适用于生物体内成像。(4)具有优良的肿瘤靶向能力。近红外的荧光探针主要包括无机的纳米材料和有机的染料分子。无机材料常见是量子点和一些其他的荧光染料，但是这类分子往往不易代谢从而产生一定的肝毒性，限制了其在体内的使用。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种基于介孔纳米碳球掺杂金纳米颗粒材料的探针及其制备。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种基于介孔纳米碳球掺杂金纳米颗粒材料的探针，该探针包括介孔碳纳米球、生长在介孔碳纳米球内部孔道壁上的金纳米颗粒、负载在介孔碳纳米球孔道中的有机荧光物以及通过化学键连接在介孔碳纳米球表面的靶向分子，所述的靶向分子为牛血清白蛋白与叶酸的复合分子，所述牛血清白蛋白通过化学键与接在介孔碳纳米球表面。
本发明中所用的介孔碳球能够作为载体，负载靶分子和荧光小分子IR780。在合成探求的过程中，我们直接在碳球内部掺杂很小的金纳米颗粒，原位合成的金纳米颗粒可以作为纳米酶，催化肿瘤细胞内部的双氧水产生活性氧的物质，帮助治疗肿瘤。之后，我们活化碳纳米球的表面，修饰一层羧基，并化学修饰牛血清白蛋白与叶酸的复合分子，牛血清蛋白分子能够提高材料的生物相容性，而靶分子叶酸有效的帮助复合材料特异性靶向肿瘤部位，提高了复合材料到达肿瘤部位的量。利用碳球内部大的介孔结构，能够直接负载的IR780荧光小分子。负载的荧光小分子IR780既能够做光热剂，又能够作为荧光分子协同肿瘤成像，实时监控材料子达到肿瘤内部的情况。
优选的，所述的有机荧光物为IR780。
优选的，所述的金纳米颗粒、有机荧光物和靶向分子的质量比为(1～2)：(1～2)：(0.5～1)。
一种如上所述基于介孔纳米碳球掺杂金纳米颗粒材料的探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料的制备：将苯酚、甲醛加入至氢氧化钠溶液中，搅拌并加热，然后加入聚醚F127的水溶液，搅拌并加热，然后加入3-巯基丙基三甲氧基硅烷、HAuCl4及纯水，反应直至有沉淀物生成，然后加入纯水得到稀释溶液，将稀释溶液进行水热反应，得到的水热产物进行抽滤、洗涤、干燥和煅烧，得到介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料；
(2)介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料的表面羧基化处理：将介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料置于浓硫酸和浓硝酸的混酸中，超声、水洗、干燥得到表面羧基化的介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料；
(3)牛血清白蛋白与叶酸的复合分子的制备：将叶酸溶解于DMSO中，加入EDC和NHS，活化后对沉淀物进行洗涤，然后冷冻干燥，得到活化叶酸；在牛血清白蛋白中加入硼氢化钠，得到还原型牛血清白蛋白，然后将还原型牛血清白蛋白与活化叶酸混合，搅拌得到牛血清白蛋白与叶酸的复合分子；
(4)将EDC、NHS和步骤(2)制备得到的表面羧基化的介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料溶解于PBS中，然后加入步骤(3)制备得到牛血清白蛋白与叶酸的复合分子，摇床反应、离心、洗涤得到表面连接靶向分子的介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料；
(5)将有机荧光物溶于DMSO中，然后加入步骤(4)制备得到的表面连接靶向分子的介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料，摇床反应、离心、洗涤，即可得到所述基于介孔纳米碳球掺杂金纳米颗粒材料的探针。
优选的，在步骤(1)中：
苯酚、甲醛和氢氧化钠的质量比为(0.5～1)：(1～2)：(5～10)，苯酚、甲醛和氢氧化钠混合的温度为65～75℃，搅拌的时间为20～40min；
加入的聚醚F127的水溶液中，聚醚F127的质量与苯酚的质量之比为(1.5～2.5)：(0.5～1)，且加入聚醚F127的水溶液时的温度为60～70℃，搅拌时间为2～4h；
加入的3-巯基丙基三甲氧基硅烷、HAuCl4、纯水的质量与苯酚的质量比为(60～65):(4～6):(20～30)；
所述反应的温度为65～70℃，所述反应时间为12～18h；
所述水热反应的温度为120～150℃，反应时间为20～30h；
所述洗涤采用乙醇和纯净水交替洗涤，洗涤次数大于3次；
所述干燥的温度为50～80℃，干燥时间为8～12h；
所述煅烧在氮气氛围中进行，煅烧温度为650～750℃，有效的将前驱体进行碳化，煅烧时间为2～4h。
优选的，在步骤(2)中：
所述浓硫酸的质量分数为98％，浓硝酸的质量分数为70％，所述浓硫酸和浓硝酸的体积比为(2～5):1，所述超声在室温下进行，帮助表面有效的进行氧化反应，生成一层氧化层，超声时间为4～6h；
所述水洗的次数至少为3次，所述干燥的温度为50～80℃，所述干燥的时间为8～12h。
优选的，在步骤(3)中：
所述叶酸、EDC和NHS的质量比为(1～3):(4～7):(4～7)，所述叶酸活化的温度为20～30℃，活化的时间为10～15h，洗涤采用丙酮和乙醚的混合液，其中，丙酮和乙醚的体积比为(2～4)：(6～8)，洗涤次数在3次以上，所述冷冻干燥的温度为-70～-40℃，冷冻干燥的时间为8～12h；
所述牛血清白蛋白与硼氢化钠的质量比为(2～5):(1～2)；
所述还原型牛血清白蛋白与活化叶酸的质量比为(1～2):(1～2)，所述混合的温度为20～30℃，混合时间为2～8h。
优选的，在步骤(4)中：
所述EDC、NHS和表面羧基化的介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料的质量比为(1～2):(1～2):(1～2)，所述PBS的pH为7～8，所述表面羧基化的介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料与牛血清白蛋白与叶酸的复合分子的质量比为(1～2):(1～2)，所述摇床反应的振动频率为100～150rpm/min，摇床反应的温度为30～40℃，摇床反应的时间为2～8h。
优选的，在步骤(5)中：
所述有机荧光物和表面连接靶向分子的介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料的质量比为(1～3):(3～4)，所述摇床反应在室温下进行，摇床反应的振动频率为100～150rpm/min，摇床反应的时间为5～10h，离心洗涤采用纯水，次数在3次以上。
最终合成的复合探针OMCAPs@rBSA-FA@IR780既可以实现诊断监测，又可以作为治疗探针，具有良好的靶向性和基于PTT、PDT实现的优异的治疗效果。最终，合成的探针成功的消融了肿瘤(MGC-803细胞的荷瘤小鼠的肿瘤)，而且进行了体内和体外的荧光成像。有趣的是，位于介孔碳纳米球内部的金颗粒，不仅仅很好的被保护起来，而且充分发挥了纳米酶的催化的作用。在有双氧水的存在下，内部掺杂的金纳米颗粒能够催化双氧水，产生一些活性氧的物质，从而促进了肿瘤细胞的凋亡。该探针的合成为胃癌诊断及其他的癌症的诊断提供了新的方法，对人类生命健康具有重大意义。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在以下几方面：
1.介孔碳纳米球内部直接掺杂金纳米颗粒(MCAPs)，能够将小的金纳米颗粒保护在介孔碳纳米球内部，有效的防止了金纳米颗粒的聚沉。内部掺杂的金纳米颗粒能够作为一种纳米酶，产生一定的活性氧的物质，从而达到治疗肿瘤的效果。
2.合成的介孔碳纳米球是一个孔道结构，不是简单的表面形成的孔状结构。利用强酸活化的MCAPs(OMCAPs)，表面有效的负载一层含氧官能团羧基(-COOH)，并且保留了孔状形貌，增加了该材料的水溶性。
3.在OMCAPs表面，化学键合上一层rBSA-FA，提高该材料的生物相容性和靶向性(OMCAPs@rBSA-FA)。
4.向OMCAPs@rBSA-FA内部负载有机荧光小分子IR780，成功合成诊疗探针OMCAPs@rBSA-FA@IR780，实现诊断和治疗一体化，对于保护人类健康具有什么重要的现实意义。
附图说明
图1为实施例1中制得的表面羧基化的介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料的电镜扫描结果示意图；
图2是不同浓℃的IR780，OMCAPs@rBSA-FA和OMCAPs@rBSA-FA@IR780纳米探针在有光照和无光照的条件下的细胞存活率；
图3为MGC-803细胞分别对靶向纳米探针(probe)和游离的IR780摄取的流式细胞图；
图4为荷瘤小鼠通过尾静脉注射探针24小时之后，用激光照射后获得的红外成像图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
一、试剂
在本实施例中，所用的化学试剂均为分析纯及以上。氯金酸(HAuCl4·4H2O),甲醛(37wt.％)和苯酚购自于上海泰坦科技有限公司。F127(Mw＝12,600,PEO106PPO70PEO106)购买于Acros公司。盐酸(HCl,37％),浓硫酸(H2SO4,98％),浓硝酸(HNO3,≥97.2％),叶酸(FA),二甲基亚砜(DMSO)和硼氢化钠(NaBH4)均购买于国药有限公司。N-羟基丁二酰亚胺(NHS),牛血清蛋白(BSA,99.9％)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)均购买于阿拉丁有限公司。细胞凋亡检测试剂盒,4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI),CCK-8试剂盒(CCK-8)和Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒均购买于翊圣有限公司。胎牛血清蛋白(FBS),细胞培养液(DMEM),胰酶消化液购买于Gibco公司。实验中所用的去离子水均由Millipore-Q超纯水系统(Millipore公司，美国)实时制备，且电导率不低于18.2MΩcm。
二、介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料(MAPs)的制备
首先，在70℃的条件，将0.6g苯酚，2.1毫升的甲醛溶液37％加入到含有15毫升的0.1M氢氧化钠溶液圆底烧瓶中，持续搅拌加热30分钟。之后，将16.2g的F127水溶液(7.4wt.％,)加入到上述混合溶液中，加热温℃更改为66℃，搅拌加热3小时。3小时之后，将0.128g的3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPTMS,98wt.％)，150μL HAuCl4(242.81mM)以及50mL纯水和上述的混合溶液进行混合。在上述温℃下，继续反应约12-18小时，直到有沉淀产物生成。之后将得到的沉淀溶液冷却到室温，并溶于纯水中，按照比例177/560(v/v)。将最终得到的稀释溶液进行水热反应，水热温℃为130℃，反应时间为24h。反应结束之后，将得到的黄色水热产物进行抽滤，并乙醇和纯净水交替洗涤，除去杂质。将烘干的黄色固体，在氮气氛围下进行煅烧，以除去F127和炭化树脂，从而得到黑色产物内部掺杂金纳米颗粒的介孔碳纳米球。
三、MCAPs表面羧基化(OMCAPs)过程
由于高温煅烧的原因，碳球表面的含氧冠能团大量流失，导致碳球的水溶性差。为了提高介孔碳球的水溶性，我们利用强酸对碳纳米球进行处理。简而言之，我们将40毫克的碳纳米球放入H2SO4(18mL,98％)和HNO3(6mL,70％)混酸中，室温条件下超声4小时。之后，将酸化好的介孔碳球(OMCAPs)进行水洗，除去多余的酸，最终离心得到的碳纳米球60℃干燥过夜。对得到的表面羧基化的介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料(OMCAPs)进行电镜表征，结果如图1所示，发现OMCAPs大小均一，仍然保持孔状结构。
四、rBSA-FA的复合小分子的合成
如此同时，我们还合成了rBSA-FA的复合小分子。合成方式如下：首先将1g叶酸(FA)溶解于50毫升DMSO中，并加入1.05gEDC和0.632g NHS，对叶酸表面的羧酸进行活化12h，反应完成之后，利用丙酮和乙醚的混合液(v/v＝3/7)进行水洗成沉淀，直至除去所有的副产物和没有反应的物质，冷冻干燥活化好的叶酸。之后，利用强还原剂硼氢化钠(1MNaBH4，250μL)对牛血清蛋白(BSA)(20mL,2mg/mL)进行还原，打算表面的二硫键，得到还原后的牛血清蛋白(rBSA)，冷冻干燥。向还原好的rBSA溶液中，加入40mg上述合成好的叶酸，并持续搅拌2小时，然后将合成好的复合材料超滤除去未反应的小分子。
五、OMCAPs@rBSA-FA的合成
为了提高所合成的碳球载体的生物相容性和肿瘤靶向性。我们在合成好的2mg的OMCAPs表面化学键合上一层事先合成好的复合材料rBSA-FA。首先，将2mg EDC,2mg NHS和2mg的OMCAPs溶解于pH值为7.4的PBS中，然后加入2mg rBSA-FA，摇床反应4小时。然后，进行离心水洗，除去没有反应的反应物。最终将得到的OMCAPs@rBSA-FA冷冻干燥。
六、OMCAPs@rBSA-FA@IR780的合成
为了得到最终的诊疗探针，我们将近红外荧光小分子IR780负载于上述合成好的OMCAPs@rBSA-FA上(OMCAPs@rBSA-FA@IR780)。合成方法如下：首先取1.5mg的IR780溶解于DMSO中，之后将上述的IR780溶液加入到上述得到的1mL的3mg/mL的OMCAPs@rBSA-FA溶液中。在室温下，摇床反应6小时，最终将得到的OMCAPs@rBSA-FA@IR780诊疗探针。将得到的探针进行离心洗涤三次，最后重新溶解于1mL的PBS备用。
七、OMCAPs@rBSA-FA@IR780细胞毒性和治疗效果的评价
为了研究诊疗探针OMCAPs@rBSA-FA@IR780对于细胞的毒性以及光照下的治疗效果。我们以MGC-803细胞作为研究对象，用CCK-8试剂盒测试细胞在有光照和无光照条件下的存活率。所有细胞存活率以对照组细胞(无药无光照)存活率为100％作归一化处理。图2是不同浓℃的IR780，OMCAPs@rBSA-FA和OMCAPs@rBSA-FA@IR780纳米探针在有光照和无光照的条件下的细胞存活率，可以直接反映最终合成的纳米探针的治疗结果。在光照组(用808nm激光器照射5min(1W cm-2)。如图2中可见，当没有激光照射的时候，所合成的OMCAPs@rBSA-FA和OMCAPs@rBSA-FA@IR780均表现出优良的生物相容性和无毒性。然而，当有808激光照射时，细胞呈现明显的凋亡现象。说明，在激光的作用下，我们的探针显示了优良的效果。
八、OMCAPs@rBSA-FA@IR780的靶向性测试
我们利用流式细胞定量分析技术分析了合成的探针OMCAPs@rBSA-FA@IR780(简称为probe)对胃癌MGC-803细胞的靶向效率。如图3所示，相同时间内，含有FA的探针OMCAPs@rBSA-FA@IR780荧光更强，说明进入细胞内部的材料更多。另外，随着时间的推移，材料被细胞内吞的越来越多。在共同孵育12小时候，胃癌细胞MGC-803对探针OMCAPs@rBSA-FA@IR780和游离态的IR780两种材料的吞噬亮差异更加显著，说明了FA的存在，能够提高胃癌细胞对于材料的摄取。
九、OMCAPs@rBSA-FA@IR780的体内光热效果测试
为了检测OMCAPs@rBSA-FA@IR780在荷瘤鼠肿瘤部位的光热效果，我们利用红外热成像仪相机对照射后的肿瘤部位的温℃进行了监测。将合成的探针材料尾静脉注射到MGC-803细胞的荷瘤小鼠的体内，24小时之后，利用激光照射(808nm,1.5W/cm2,2min),可以清晰的发现肿瘤部位的温℃上升到50℃左右(图4)。说明材料能够在24小时之后，达到肿瘤部位，并且肿瘤部位的温℃在激光介导的光热治疗中能够达到治疗杀伤肿瘤的温℃，这归功于介孔纳米碳球作为载体可以增加纳米探针在肿瘤部位的聚集和肿瘤部位的滞留时间，消除了小分子容易代谢的缺点。
实施例2
采用与实施例1相同的制备步骤，不同之处在于：
(1)在制备介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料时：苯酚、甲醛和氢氧化钠的质量比为0.5：2：5，苯酚、甲醛和氢氧化钠混合的温度为65℃，搅拌的时间为40min；加入的聚醚F127的水溶液中，聚醚F127的质量与苯酚的质量之比为1.5：1，且加入聚醚F127的水溶液时的温度为60℃，搅拌时间为4h；加入的3-巯基丙基三甲氧基硅烷、HAuCl4、纯水的质量与苯酚的质量比为60 6:20；反应的温度为65℃，反应时间为18h；水热反应的温度为120℃，反应时间为30h；洗涤采用乙醇和纯净水交替洗涤，洗涤次数大于3次；干燥的温度50℃，干燥时间为12h；煅烧在氮气氛围中进行，煅烧温度为650℃，煅烧时间为4h。
(2)在表面羧基化过程中：浓硫酸的质量分数为98％，浓硝酸的质量分数为70％，浓硫酸和浓硝酸的体积比为2:1，超声在室温下进行，超声时间为4h；水洗的次数至少为3次，干燥的温度为50℃，干燥的时间为12h。
(3)在制备牛血清白蛋白与叶酸的复合分子时：叶酸、EDC和NHS的摩尔比为1:7:4，叶酸活化的温度为20℃，活化的时间为15h，洗涤采用丙酮和乙醚的混合液，其中，丙酮和乙醚的体积比为2：8，洗涤次数在3次以上，冷冻干燥的温度为-70℃，冷冻干燥的时间为12h；牛血清白蛋白与硼氢化钠的质量比为2:2；还原型牛血清白蛋白与活化叶酸的质量比为1:2，混合的温度为20℃，混合时间为8h。
(4)在连接靶向分子时：EDC、NHS和表面羧基化的介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料的质量比为1:2:1，PBS的pH为7～8，表面羧基化的介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料与牛血清白蛋白与叶酸的复合分子的质量比为1:2，摇床反应的振动频率为1000rpm/min，摇床反应的温度为30℃，摇床反应的时间为8h。
(5)在连接IR780时：有机荧光物和表面连接靶向分子的介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料的质量比为1:4，摇床反应在室温下进行，摇床反应的振动频率为100rpm/min，摇床反应的时间为10h，离心洗涤采用纯水，次数在3次以上。
经检测，本实施例制备得到的探针对癌细胞具有良好的靶向杀死作用。
实施例3
采用与实施例1相同的制备步骤，不同之处在于：
(1)在制备介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料时：苯酚、甲醛和氢氧化钠的质量比为1：1：10，苯酚、甲醛和氢氧化钠混合的温度为75℃，搅拌的时间为20min；加入的聚醚F127的水溶液中，聚醚F127的质量与苯酚的质量之比为2.5：0.5，且加入聚醚F127的水溶液时的温度为70℃，搅拌时间为2h；加入的3-巯基丙基三甲氧基硅烷、HAuCl4、纯水的质量与苯酚的质量比为65:4：30；反应的温度为70℃，反应时间为12h；水热反应的温度为150℃，反应时间为20h；洗涤采用乙醇和纯净水交替洗涤，洗涤次数大于3次；干燥的温度80℃，干燥时间为8h；煅烧在氮气氛围中进行，煅烧温度为750℃，煅烧时间为2h。
(2)在表面羧基化过程中：浓硫酸的质量分数为98％，浓硝酸的质量分数为70％，浓硫酸和浓硝酸的体积比为5:1，超声在室温下进行，超声时间为6h；水洗的次数至少为3次，干燥的温度为80℃，干燥的时间为8h。
(3)在制备牛血清白蛋白与叶酸的复合分子时：叶酸、EDC和NHS的摩尔比为3:4:7，叶酸活化的温度为30℃，活化的时间为10h，洗涤采用丙酮和乙醚的混合液，其中，丙酮和乙醚的体积比为4:6，洗涤次数在3次以上，冷冻干燥的温度为-40℃，冷冻干燥的时间为8h；牛血清白蛋白与硼氢化钠的质量比为5:1；还原型牛血清白蛋白与活化叶酸的质量比为2:1，混合的温度为30℃，混合时间为2h。
(4)在连接靶向分子时：EDC、NHS和表面羧基化的介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料的质量比为2:1:2，PBS的pH为7～8，表面羧基化的介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料与牛血清白蛋白与叶酸的复合分子的质量比为2:1，摇床反应的振动频率为150rpm/min，摇床反应的温度为40℃，摇床反应的时间为2h。
(5)在连接IR780时：有机荧光物和表面连接靶向分子的介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料的质量比为3:3，摇床反应在室温下进行，摇床反应的振动频率为150rpm/min，摇床反应的时间为5h，离心洗涤采用纯水，次数在3次以上。
经检测，本实施例制备得到的探针对癌细胞具有良好的靶向杀死作用。

Claims (9)

1.一种基于介孔纳米碳球掺杂金纳米颗粒材料的探针，其特征在于，该探针包括介孔碳纳米球、生长在介孔碳纳米球内部孔道壁上的金纳米颗粒、负载在介孔碳纳米球孔道中的有机荧光物以及通过化学键连接在介孔碳纳米球表面的靶向分子，所述的靶向分子为牛血清白蛋白与叶酸的复合分子，所述牛血清白蛋白通过化学键与接在介孔碳纳米球表面。
2.根据权利要求1所述的一种基于介孔纳米碳球掺杂金纳米颗粒材料的探针，其特征在于，所述的有机荧光物为IR780。
3.根据权利要求1所述的一种基于介孔纳米碳球掺杂金纳米颗粒材料的探针，其特征在于，所述的金纳米颗粒、有机荧光物和靶向分子的质量比为(1～2)：(1～2)：(0.5～1)。
4.一种如权利要求1～3任一所述基于介孔纳米碳球掺杂金纳米颗粒材料的探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料的制备：将苯酚、甲醛加入至氢氧化钠溶液中，搅拌并加热，然后加入聚醚F127的水溶液，搅拌并加热，然后加入3-巯基丙基三甲氧基硅烷、HAuCl4及纯水，反应直至有沉淀物生成，然后加入纯水得到稀释溶液，将稀释溶液进行水热反应，得到的水热产物进行抽滤、洗涤、干燥和煅烧，得到介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料；
(2)介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料的表面羧基化处理：将介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料置于浓硫酸和浓硝酸的混酸中，超声、水洗、干燥得到表面羧基化的介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料；
(3)牛血清白蛋白与叶酸的复合分子的制备：将叶酸溶解于DMSO中，加入EDC和NHS，活化后对沉淀物进行洗涤，然后冷冻干燥，得到活化叶酸；在牛血清白蛋白中加入硼氢化钠，得到还原型牛血清白蛋白，然后将还原型牛血清白蛋白与活化叶酸混合，搅拌得到牛血清白蛋白与叶酸的复合分子；
(4)将EDC、NHS和步骤(2)制备得到的表面羧基化的介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料溶解于PBS中，然后加入步骤(3)制备得到牛血清白蛋白与叶酸的复合分子，摇床反应、离心、洗涤得到表面连接靶向分子的介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料；
(5)将有机荧光物溶于DMSO中，然后加入步骤(4)制备得到的表面连接靶向分子的介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料，摇床反应、离心、洗涤，即可得到所述基于介孔纳米碳球掺杂金纳米颗粒材料的探针。
5.根据权利要求4所述的一种基于介孔纳米碳球掺杂金纳米颗粒材料的探针的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中：
苯酚、甲醛和氢氧化钠的质量比为(0.5～1)：(1～2)：(5～10)，苯酚、甲醛和氢氧化钠混合的温度为65～75℃，搅拌的时间为20～40min；
加入的聚醚F127的水溶液中，聚醚F127的质量与苯酚的质量之比为(1.5～2.5)：(0.5～1)，且加入聚醚F127的水溶液时的温度为60～70℃，搅拌时间为2～4h；
加入的3-巯基丙基三甲氧基硅烷、HAuCl4、纯水的质量与苯酚的质量比为(60～65)：(4～6)：(20～30)；
所述反应的温度为65～70℃，所述反应时间为12～18h；
所述水热反应的温度为120～150℃，反应时间为20～30h；
所述洗涤采用乙醇和纯净水交替洗涤，洗涤次数大于3次；
所述干燥的温度为50～80℃，干燥时间为8～12h；
所述煅烧在氮气氛围中进行，煅烧温度为650～750℃，煅烧时间为2～4h。
6.根据权利要求4所述的一种基于介孔纳米碳球掺杂金纳米颗粒材料的探针的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中：
所述浓硫酸的质量分数为98％，浓硝酸的质量分数为70％，所述浓硫酸和浓硝酸的体积比为(2～5):1，所述超声在室温下进行，超声时间为4～6h；
所述水洗的次数至少为3次，所述干燥的温度为50～80℃，所述干燥的时间为8～12h。
7.根据权利要求4所述的一种基于介孔纳米碳球掺杂金纳米颗粒材料的探针的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中：
所述叶酸、EDC和NHS的摩尔为(1～3)：(4～7)：(4～7)，所述叶酸活化的温度为20～30℃，活化的时间为10～15h，洗涤采用丙酮和乙醚的混合液，其中，丙酮和乙醚的体积比为(2～4)：(6～8)，洗涤次数在3次以上，所述冷冻干燥的温度为-70～-40℃，冷冻干燥的时间为8～12h；
所述牛血清白蛋白与硼氢化钠的质量比为(2～5)：(1～2)；
所述还原型牛血清白蛋白与活化叶酸的质量比为(1～2)：(1～2)，所述混合的温度为20～30℃，混合时间为2～8h。
8.根据权利要求4所述的一种基于介孔纳米碳球掺杂金纳米颗粒材料的探针的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中：
所述EDC、NHS和表面羧基化的介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料的质量比为(1～2):(1～2):(1～2)，所述PBS的pH为7～8，所述表面羧基化的介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料与牛血清白蛋白与叶酸的复合分子的质量比为(1～2):(1～2)，所述摇床反应的振动频率为100～150rpm/min，摇床反应的温度为30～40℃，摇床反应的时间为2～8h。
9.根据权利要求4所述的一种基于介孔纳米碳球掺杂金纳米颗粒材料的探针的制备方法，其特征在于，在步骤(5)中：
所述有机荧光物和表面连接靶向分子的介孔碳纳米球内掺杂金纳米颗粒复合材料的质量比为(1～3)：(3～4)，所述摇床反应在室温下进行，摇床反应的振动频率为100～150rpm/min，摇床反应的时间为5～10h，离心洗涤采用纯水，次数在3次以上。
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