CN109432079A - 一种化合物在制备用于痛风的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种化合物在制备用于痛风的药物中的应用，该化合物具有式I结构。本发明通过实验表明，该化合物能够抑制URAT1，阻断尿酸重吸收，并可以可促进大鼠尿酸排出，降低血清尿酸水平，还能明显抑制尿酸钠诱导的THP‑1细胞IL‑1β、TNF‑α分泌，并减轻尿酸钠致大鼠踝关节肿胀程度，降低炎症反应，缓解关节疼痛。这表明该化合物具有治疗高尿酸血症和/或痛风疾病的作用和应用价值。

Description

一种化合物在制备用于痛风的药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及橙酮的用途。

背景技术

痛风是一种常见的慢性炎症性代谢病或风湿病。由嘌呤代谢紊乱、尿酸排泄减少所引起的一种尿酸盐沉积所致的晶体相关性关节炎。急性痛风性关节炎(Acute goutyarthritis，AGA)是痛风的特征性症状，是尿酸盐结晶沉着于关节及周围结缔组织而引起的特征性急性炎症反应。常在夜间突发，可因疼痛而醒并且彻夜不能入睡，病情反复发作，可发展为多关节炎，或游走性关节炎，受累关节红、肿、热、痛，活动受限。急性痛风性关节炎患者因疼痛反复发作，在就诊的痛风患者中所占比例最大，如不积极治疗极易致残、致畸形，影响关节功能。

高尿酸血症(HUA)是指血液中的尿酸浓度超出正常范围的一种机体状态，常与传统的代谢性心血管危险因素高血压、高脂血症、2型糖尿病、肥胖、胰岛素抵抗等伴发。目前基础研究、流行病学研究均提示，尿酸是血管疾病的独立危险因素。痛风的病理学基础主要为嘌呤代谢紊乱和(或)高尿酸血症，还与炎症小体的激活有关。国内外研究表明痛风出现的炎症发病机制与TLRS/MyD88信号转导通路密切相关，MSU晶体作为一种危险信号被细胞表面和胞质Toll受体2(TLR2)、Toll受体4(TLR4)等分子所识别，进而活化髓样分化因子88(MyD88)，激活核转录因子kappaB(NF-κB)，促进白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎症因子的释放。

有90％的原发性高尿酸血症是由于肾脏尿酸清除过低引起的。尿酸的清除主要通过肾小管重吸收和分泌控制。其中重吸收是维持血中尿酸浓度的主要因素。URAT1是肾小管上皮细胞最主要的尿酸重吸收转运体。其通过与多种单价的有机阴离子和少数的无机阴离子交换完成对尿酸的重吸收，主要参与尿酸在近端小管的重吸收。研究表明，抑制URAT1将大大减少尿酸重吸收而促进尿酸排泄。因而URAT1抑制剂又被称为促尿酸排泄药。由于URAT1强大的尿酸重吸收能力,以其作为靶点开发新型降尿酸药物成为新药开发的热点。

痛风或高尿酸血症的发病前期无症状，却可能引起关节永久性损伤。减少尿酸盐结晶的沉积是治疗的主要终点，而维持尿酸长期处于正常水平同样关键。我们国内减少尿酸重吸收以促进尿酸排泄的药物主要为丙磺舒和苯溴马隆。丙磺舒除了对URAT1有抑制作用外，同时也阻断OAT1和OAT3，而OAT1和OAT3在肾脏对尿酸盐进行转运，负责尿液中尿酸的分泌，使其促尿酸排泄作用减弱，而苯溴马隆被认为对URAT1选择性较高，比苯磺舒降尿酸的作用更强，但苯溴马隆具有潜在的肝毒性，因而丙磺舒、苯溴马隆的临床应用受到限制。

近年来，中药治疗痛风的研究逐渐引起人们的关注，而且由于很多中药组分属于天然提取药物，具有副作用小等优点。因此，开发一种基于中药组分的能治疗痛风的药物具有重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种化合物在制备用于痛风的药物中的应用。

具体地，本发明涉及一种化合物，其能够治疗或预防痛风，该化合物(橙酮)是从中药植物中提取的类黄酮成分，具有式I结构：

进一步地，所述化合物在制备用于降尿酸的药物中的应用。

进一步地，所述化合物在制备URAT抑制剂中的应用。

具体地，所述用于痛风的药物由式I所述化合物和药学上可接受的辅料制备而来。

进一步地，所述用于痛风的药物选自口服给药剂型、注射给药剂型、或外用给药制剂。

具体地，所述口服给药剂型选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂。所述注射给药剂型为注射液剂或注射用粉针剂。所述外用给药制剂为栓剂、贴剂或凝胶剂。

优选地，所述注射给药剂型包括橙酮、大豆磷脂、甘油。其制备方法为：将80-150g橙酮和10-20g注射用大豆磷脂、20-40g注射用甘油，注射用水定容至1000mL，按照常规方法制成注射剂。

优选地，所述片剂中包括：橙酮、淀粉、羧甲基淀粉钠、滑石粉、糊精、硬脂酸镁和淀粉浆。

优选地，所述胶囊剂的内容物中包括：橙酮、淀粉、低取代羟丙基纤维素、微粉硅胶、硬脂酸镁和淀粉浆。

优选地，所述颗粒剂中包括：橙酮、蔗糖和糊精。

本发明还提出了一种如前述式I所述化合物在制备用于高尿酸血症的药物中的应用。

本发明还提出了一种如前述式I所述化合物在制备用于痛风性关节炎的药物中的应用。

本发明通过实验表明，橙酮能够抑制URAT1，阻断尿酸重吸收，并可以可促进大鼠尿酸排出，降低血清尿酸水平。橙酮还能明显抑制尿酸钠诱导的THP-1细胞IL-1β、TNF-α分泌；并减轻尿酸钠致大鼠踝关节肿胀程度，降低炎症反应，缓解关节疼痛。这提示橙酮作为URAT1抑制剂，可以抑制尿酸在肾近曲小管的重吸收，从而促进尿酸的排泄，降低血清尿酸水平，改善关节尿酸盐沉积，从而减轻痛风发作的炎症和疼痛，对急性痛风性关节炎和高尿酸均表现出明显有益的结果。

附图说明

图1为本发明橙酮对尿酸吸收的影响(***P<0.001，与模型组比较)图；其中，橙酮1组、橙酮2组、橙酮3组、橙酮4组、橙酮5组的终浓度分别为32、16、8、4、1μg/mL。

具体实施方式

本发明提供了橙酮的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

除特别强调，本发明采用的药品、生物材料或仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1胶囊剂

将300g橙酮和31g淀粉、5g低取代羟丙基纤维素、4.3g微粉硅胶、1.6g硬脂酸镁、及适量10％淀粉浆混合，装入胶囊，得到胶囊制剂1000粒。

实施例2颗粒剂

将300g橙酮和1000g蔗糖及500g糊精混合，按照常规方法制成1000包颗粒剂。

实施例3片剂

将300g橙酮和50g淀粉、7.4g羧甲基淀粉钠、0.9g滑石粉、50g糊精、0.8g硬脂酸镁及适量10％淀粉浆适混合，按照常规方法制成片剂1000片。

实施例4丸剂

将300g橙酮和14g聚乙二醇-6000、78.4g聚山梨酯-80、适量液状石蜡混合，按照常规方法制成丸剂1000粒。

实施例5注射剂

将100g橙酮和15g注射用大豆磷脂、30g注射用甘油，注射用水定容至1000mL，按照常规方法制成注射剂1000支。

实施例6橙酮对URAT1稳转株尿酸吸收的影响

1、材料

仓鼠卵巢细胞株(CHO-K1)，由中国科学院上海细胞库提供；Pcdna3.1-URAT1plasmid，由Vigene Biosciences生产；Lipofectamine 2000Reagent,Invitrogen公司生产；G418Disulfate(美国Thermo Fisher公司)；^[14C]尿酸(美国ARC公司)、苯溴马隆、DMSO，美国Sigma公司；橙酮，纯度为99％，由江苏康缘药业股份有限公司提供。橙酮配制成100mM DMSO储存液，-20℃保存。

2、实验方法

取对数生长期的CHO-K1细胞，24孔板加入1×10⁵个/孔细胞200μL，按照Lipofectamine 2000说明书加入Pcdna3.1-URAT1plasmid，Lipofectamine2000Reagent(使其终浓度分别为500ng/孔、1.5μL/孔)进行转染，6h后加入含800μg/ml DisulfateG418的培养基进行筛选，并挑选具有URAT1稳定遗传的单克隆细胞株。

将URAT1稳转株细胞/空转细胞以1×10⁵cells/well浓度接种到24孔板，分为空白对照组、模型组、苯溴马隆组(4μg/mL)、橙酮组(1、4、8、16、32μg/mL)，各组设3个空白对照组。24h后，每孔加入0.5mL尿酸吸收缓冲液(葡萄糖酸钠125mmol/L，葡萄糖酸钾4.8mmol/L，葡萄糖酸钙1.3mmol/L，硫酸镁1.2mmol/L，磷酸二氢钾1.2mmol/L，HEPES 25mmol/L，葡萄糖5.6mmol/L，pH 7.4)洗两次，随后每孔加入0.5mL尿酸吸收缓冲液，37℃孵育10min。吸去孔内液体，加入0.2mL含^[14C]尿酸25μmol/L，与含或不含药物的尿酸吸收缓冲液(空白对照孔加入等体积缓冲液)开始进行尿酸吸收，吸收时间均为5min，后迅速吸去孔内液体并用0.5mL冰冷DPBS洗一次，再用1mL冰冷DPBS洗两次。每孔加入0.25mL0.1mol/L NaOH以裂解细胞，室温裂解20min后吹匀孔内细胞裂解液，转移至闪烁瓶，各孔再用0.25mL 0.1mol/LNaOH洗两遍,洗后液体并入闪烁瓶，每个闪烁瓶加入4mL闪烁液，混匀后用液闪仪进行测定。

3、实验结果

URAT1稳转细胞株与空载体稳转细胞株在25μmol/L[14C]尿酸下吸收5min的尿酸吸收情况如图1所示，稳转目的基因后的细胞株吸收尿酸的能力明显增强。苯溴马隆及橙酮各组均能明显抑制尿酸的吸收，与模型比较有显著性差异(P<0.001)。结果表明，橙酮可通过URAT1抑制尿酸的重吸收。

实施例7橙酮对高尿酸血症大鼠尿酸代谢的影响

1、材料与方法

1.1材料

SD大鼠，80只，雄性，体重180～220g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供；橙酮，纯度为99％，按照实施例5的方法制备成注射剂(使用时用注射用生理盐水进行稀释)，由江苏康缘药业股份有限公司提供；次黄嘌呤，sigma进口分装；氧嗪酸钾，aldrich进口分装；苯溴马隆片，德国赫曼大药厂；别嘌醇片，世贸天阶制药有限责任公司；；尿酸试剂盒、南京建成。

1.2方法

SD大鼠80只，随机分为7组，正常对照组、模型对照组、别嘌醇组(10mg/kg)、苯溴马隆组(10mg/kg)、橙酮1组(30mg/kg)、橙酮2组(10mg/kg)、橙酮3组(3mg/kg)。除空白组外，其他各组分别灌胃给予次黄嘌呤500mg/kg，体积为2ml/kg,皮下注射氧嗪酸钾200mg/kg，体积为1ml/kg，12h后再次灌胃给予次黄嘌呤500mg/kg,连续4d。每次给予次黄嘌呤后除正常对照组和模型对照组给与等容积的溶媒外，其余各组分别立即腹腔注射给予相应的治疗药物，给药容积为2ml/kg，第4天给药后，将大鼠放入代谢笼，过夜，收集12h尿液，期间禁食不禁水，将收集的尿液测量体积并记录，后冷藏待进行指标检测，检测时水浴至50℃，震荡混匀。

第5天，大鼠灌胃给予次黄嘌呤500mg/kg，皮下注射氧嗪酸钾200mg/kg，并给与相应药物后3h，眼眶取血2ml，室温下自然凝血30min，分离得到血清(4000rpm，15min)；按试剂盒说明书测定血清尿酸(serum uric acid，SUA)和尿液尿酸(urinaryuric acid，UUA)，并计算大鼠12h尿酸排泄量。

12h尿酸排泄量(mg)＝UUA(mg/ml)×12h尿量(ml)

2、实验结果

2.1橙酮对大鼠持续性高尿酸模型血清尿酸水平的影响

给予次黄嘌呤和氧嗪酸钾联合造模后，大鼠SUA水平明显升高，别嘌醇组及苯溴马隆片组SUA水平明显低于模型组(P＜0.01，P＜0.05)；橙酮各剂量组大鼠SUA水平也明显降低，与模型组比较有显著性差异(P＜0.01，P＜0.05)。实验结果见表1，结果表明橙酮有降低血清尿酸的作用。

表1橙酮对大鼠持续性高尿酸模型SUA的影响(n＝10)

注：**P<0.01，*P<0.05，与模型组比较

2.2橙酮对大鼠持续性高尿酸模型尿尿酸水平的影响

造模后，除正常组外，各组大鼠UUA浓度及12h尿酸排泄量明显升高，苯溴马隆组尿酸排泄水平明显高于模型组(P＜0.01)；橙酮各剂量组大鼠UUA浓度、12h尿酸排泄量均明显增加，与模型组比较有显著性差异(P＜0.01，P＜0.05)。实验结果见表2，结果表明橙酮有促进尿酸排泄的作用。

表2橙酮对大鼠持续性高尿酸模型UUA的影响(n＝10)

注：**P<0.01，*P<0.05，与模型组比较

实施例8橙酮对尿酸钠(MSU)诱导的THP-1细胞痛风性关节炎模型的影响

1、实验材料

1.1试剂

人单核细胞株(THP-1)，由中国科学院上海细胞库提供；尿酸钠、秋水仙碱、DMSO，美国Sigma公司；RPMI-1640培养基，美国Gibco公司；胎牛血清，杭州四季清公司；Human IL-1βElisa试剂盒、Human TNF-αElisa试剂盒，ebioscience生产；橙酮，纯度为99％，由江苏康缘药业股份有限公司提供。

1.2仪器

酶标仪(molecular devices,spectraMax M2e)，移液枪(eppendorf)，微量震荡仪(国华ZW-A)，电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏DHG-9023)，-70℃冰箱(Haier DW-86L286型)，-20℃冰箱(SIMENS,BCD-254)，pH计(Mettler Toledo,FE20型)，天平(MettlerToledo,AL104)，多管架自动平衡离心机(上海卢湘仪,D5A-WS)，手掌型离心机(Qilinbeier,LX-100)，涡旋仪(Qilinbeier,VORTEX-5)。

1.3试剂配制

样品配制：橙酮配制成100mM DMSO储存液，-20℃保存。

2、实验方法

2.1实验分组实验设：空白对照组(C)，阴性对照组(M)，阳性药对照组，橙酮组。

2.2细胞培养及分组

将THP-1细胞复苏后，取对数生长期的THP-1细胞加入5mL含10％胎牛血清的RPMI1640培养基，将细胞轻轻吹打混匀后，转入10mL培养皿，补充培养基至8mL，5％CO₂，37℃培养箱连续培养，3～5d传代1次，以1∶2～1∶3传代，取对数生长期细胞备用。将对数生长期的THP-1细胞分为正常对照组、模型组、秋水仙碱组(2μg/mL)、橙酮组(1、4、8、16、32μg/mL)、将细胞浓度调整为5×10⁵/mL，接种于6孔板中，2mL/孔，每组3个平行，5％CO₂，37℃培养箱培养24h后，给药组给予相应的药物，正常对照组和模型组用DMSO补齐；2h后，除正常对照组所有组给予终浓度为100μg/mL的MSU，正常对照组用PBS补齐；5％CO₂，37℃培养24h后，将细胞转移至干净的试管内，1000r/min离心5min，收集上清，使用Elisa试剂盒检测细胞上清液中IL-1β和TNF-α的含量。

3、实验结果

实验结果见表3，与正常对照组比较，模型组细胞上清液IL-1β、TNF-α含量显著升高(P＜0.01)。与模型组比较，各给药组细胞上清液IL-1β、TNF-α含量显著降低(P＜0.01)。

表3橙酮对THP-1细胞痛风性炎症模型IL-1β、TNF-α含量的影响(n＝9)

注：**P<0.01，*P<0.05，与模型组比较

实施例9橙酮对尿酸钠致大鼠急性关节炎的影响

1、材料与方法

1.1材料

清洁级SD大鼠72只，雄性，体重180～200g，浙江省实验动物中心提供；橙酮，纯度为99％，按照实施例5的方法配制成注射剂(使用时用注射用生理盐水进行稀释)，由江苏康缘药业股份有限公司提供；尿酸钠，美国Sigma；秋水仙碱片，昆明制药集团股份有限公司提供；生理盐水，南京小营药业集团有限公司提供。

尿酸钠混悬液的配制：250mg尿酸钠结晶加9ml生理盐水，再加1ml吐温80，加热搅拌，配成10ml尿酸钠混悬液。

秋水仙碱溶液配制：无菌条件下将4mg秋水仙碱粉末加入20ml 0.9％的生理盐水中，充分搅拌，使秋水仙碱溶解于生理盐水中，2ml/管进行分装，然后高压灭菌。

1.2方法

1.2.1造模及给药

SD大鼠72只，全雄，体重180～200g，适应性饲养3天后，按照体重随机分为6组，每组12只。即(1)正常对照组：注射生理盐水；(2)模型对照组：注射生理盐水；(3)阳性对照组：腹腔注射秋水仙碱溶液1mg/kg；(4)橙酮1组：腹腔注射橙酮10mg/kg；(5)橙酮2组：腹腔注射橙酮3mg/kg；(6)橙酮3组：腹腔注射橙酮1mg/kg。各组分别腹腔注射给予相应药物，给药容积为2ml/kg，每日一次，连续给药5日。

1.2.2实验方法及观测指标

第3次给药后，各组大鼠立即用软皮尺测定造模前大鼠右后肢小腿踝关节周径，1h后除正常对照组踝关节腔注入生理盐水外，其他各组大鼠用6号注射针在各大鼠右侧踝关节背侧从45°方向插入胫骨肌腱内侧，将0.2ml尿酸钠混悬液注入到踝关节腔。

对大鼠关节肿胀程度影响：模型形成后，测定造模2h、4h、8h、12h、24h、48h后大鼠右踝关节周径，计算肿胀度。

肿胀度(cm)＝造模后踝周径(cm)－造模前踝周径(cm)

对痛阈改变的影响：痛阈测定前2d对各组大鼠进行训练，各组大鼠使用电子压痛仪进行大鼠右踝关节基础痛阈测定，为防止机械损伤，机械压力控制在500g以内。分别测定末次给药前及给药后2h痛阈，计算痛阈降低值及痛阈降低率。

2、结果

2.1本发明组合物对大鼠踝关节肿胀程度的影响

结果见表4，造模后，大鼠右踝关节明显肿胀，24h时肿胀达到高峰，48h时肿胀减轻；橙酮各剂量组大鼠关节肿胀明显减轻，与模型组存在显著差异(P<0.01，P<0.05)。提示橙酮能够明显减轻急性痛风性关节炎大鼠关节肿胀。

表4橙酮对急性痛风性关节炎大鼠右踝关节肿胀度的影响(n＝12)

注：**P<0.01，*P<0.05，与模型组比较

2.2橙酮对痛阈改变的影响

实验结果见表5，造模后大鼠右后肢承受压力明显降低，模型组与正常组存在显著性差异(P<0.01)，阳性对照组及橙酮各剂量组大鼠承受压力未见明显降低，与模型有明显差异(P<0.01)。橙酮能够提高急性痛风性关节炎大鼠痛阈。

表5本发明中药组合物注射液对急性痛风性关节炎大鼠后肢压力的影响(n＝12)

注：**P<0.01，*P<0.05，与模型组比较

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种化合物在制备用于痛风的药物中的应用，该化合物具有式I结构：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述化合物在制备URAT抑制剂中的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述用于痛风的药物由式I所述化合物和药学上可接受的辅料制备而来。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用于痛风的药物选自口服给药剂型、注射给药剂型、或外用给药制剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述口服给药剂型选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述注射给药剂型包括橙酮、大豆磷脂、甘油。

7.式I所述化合物在制备用于高尿酸血症的药物中的应用。

8.式I所述化合物在制备用于痛风性关节炎的药物中的应用。