CN109394690B - 一种天然右旋龙脑纳米粒子及其制备方法与应用 - Google Patents

一种天然右旋龙脑纳米粒子及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109394690B
CN109394690B CN201811375381.6A CN201811375381A CN109394690B CN 109394690 B CN109394690 B CN 109394690B CN 201811375381 A CN201811375381 A CN 201811375381A CN 109394690 B CN109394690 B CN 109394690B
Authority
CN
China
Prior art keywords
borneol
natural
nanoparticles
nbnps
gefitinib
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811375381.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109394690A (zh
Inventor
陈填烽
袁日明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jinan University
Original Assignee
Jinan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jinan University filed Critical Jinan University
Priority to CN201811375381.6A priority Critical patent/CN109394690B/zh
Publication of CN109394690A publication Critical patent/CN109394690A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109394690B publication Critical patent/CN109394690B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种天然右旋龙脑纳米粒子及其制备方法与应用。本发明通过将天然右旋龙脑和有机溶剂混合搅拌，使天然右旋龙脑完全溶解；然后加入表面活性剂、油脂和水，搅拌均匀后得到水包油型乳液；均质，得到天然右旋龙脑纳米粒。本发明提供的天然右旋龙脑纳米粒子的粒径小，粒度分散均匀，稳定性高，相比于单独天然右旋龙脑，天然右旋龙脑纳米粒子具有明显的抗肿瘤活性，且具有良好的靶向性，与抗肿瘤药物具有协同增效作用，实现明显高效的抗肿瘤效果。

Description

一种天然右旋龙脑纳米粒子及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种天然右旋龙脑纳米粒子及其制备方法与应用
背景技术
龙脑，又名冰片，分子式为C10H18O，是无色半透明或白色半透明萜类化合物。龙脑易溶于乙醇和乙醚等有机溶剂，几乎不溶于水。根据来源的差异可将龙脑划分为以下3类：合成龙脑，俗称“合成冰片”，是由松节油等经过化学方法合成；左旋龙脑，俗称“艾片”，由菊科草本植物的茎叶经过蒸馏提取结晶而得；天然右旋龙脑(Natural Borneol,NB)，俗称“天然冰片”，从樟科植物樟的枝叶中提取加工而得。据史料记载，冰片具有“消肿止痛”、“清热明目”、治疗“喉痹口疮”等临床功效。然而，由于合成龙脑和左旋龙脑毒性较大，容易对机体造成肝毒性，因此应用受到了限制。而NB在我国有着非常悠久的应用历史，通常作为名贵珍稀药材、高级香料、食品添加剂和重要的化工原料。近年来，研究人员开始关注NB的抗炎抑菌作用。此外，研究表明，NB可促进药物透皮吸收，从而可提高其它药物的血药浓度和生物利用度，因此，NB作为抗肿瘤药物增敏剂的研究备受关注。但是NB水溶极差及其在体内分布不稳定的缺点限制了NB对药物的增敏作用。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种天然右旋龙脑纳米粒子的制备方法。
本发明另一目的在于提供通过上述方法制备得到的天然右旋龙脑纳米粒子。
本发明再一目的在于提供上述天然右旋龙脑纳米粒子在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种天然右旋龙脑纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
(1)将天然右旋龙脑和有机溶剂混合搅拌，使天然右旋龙脑完全溶解，得到混合溶液；
(2)向步骤(1)得到的混合溶液中加入表面活性剂、油脂和水，搅拌均匀，得到水包油(O/W)型乳液；
(3)将步骤(2)所得的水包油(O/W)型乳液均质，得到天然右旋龙脑纳米粒子(NBNPs)。
步骤(1)中所述的有机溶剂优选为无水乙醇、乙醚和氯仿中的一种或至少两种，更优选为无水乙醇。
步骤(1)中所述的有机溶剂的用量优选为按天然右旋龙脑：有机溶剂＝30～800mg：9mL配比计算。
步骤(2)中所述的表面活性剂优选为吐温80和泊洛沙姆188中的一种或两种；更优选为吐温80。
步骤(2)中所述的表面活性剂的用量优选为按天然右旋龙脑：表面活性剂＝30～800mg：18mL配比计算。
步骤(2)中所述的油脂为植物油，优选为大豆油、橄榄油和玉米油中的至少一种；更优选为橄榄油。
步骤(2)中所述的油脂的用量优选为按天然右旋龙脑：油脂＝30～800mg：15mL配比计算。
步骤(2)中所述的水优选为超纯水。
步骤(2)中所述的水包油型乳液中组成溶剂的各成分按体积百分比计，如下：水58％～86％、有机溶剂3～9％、表面活性剂6～18％、油脂5～15％。
步骤(2)中所述的搅拌的转速优选为400～600rpm；更优选为500rpm。
步骤(3)中所述的均质的压力优选为60MPa～150MPa；更优选为60MPa～120MPa；最优选为120MPa。
步骤(3)中所述的均质的时间优选为2～10min；更优选为2min。
步骤(3)中所述的天然右旋龙脑纳米粒子为乳白色，呈圆球形，分散均匀，粒径优选为16nm～80nm；
一种天然右旋龙脑纳米粒子，通过上述制备方法得到。
所述的天然右旋龙脑纳米粒子在制备抗肿瘤药物中的应用；
所述肿瘤优选为肺癌、乳腺癌、宫颈癌、恶性黑色素瘤、肝癌或结肠癌肺癌；更优选为肺癌。
一种抗肿瘤药物，包括吉非替尼(Gefitinib)和上述天然右旋龙脑纳米粒子。
本发明的机理为：
1.天然右旋龙脑纳米粒子具有抗肿瘤活性是通过提高人非小细胞肺癌细胞A549内的活性氧水平而诱导细胞凋亡来实现的。
2.天然右旋龙脑纳米粒子联合吉非替尼具有协同增敏的抗肿瘤作用是通过提高人非小细胞肺癌细胞A549内的活性氧水平，可有效引起A549细胞内DNA损伤，从而导致细胞凋亡来实现的。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
1.本发明提供的天然右旋龙脑纳米粒子的制备方法，选择低毒的非离子型表面活性剂吐温80为乳化剂，橄榄油为油相，通过高压均质的方法制备得到水包油的天然右旋龙脑纳米粒子。一方面，橄榄油包裹了易升华的天然右旋龙脑，提高了天然右旋龙脑在生物体内的稳定性；另一方面，水包油的天然右旋龙脑纳米粒子外层是水相，具有良好的生物相容性和水溶性。
2.本发明制备得到的天然右旋龙脑纳米粒子粒径小，粒度分散均匀，稳定性高。本发明首先在搅拌条件下制得含有天然右旋龙脑的水包油乳液，再通过简单高效的高压均质方法将其均质，从而得到粒径小且粒度分散均匀的纳米粒子，有利于生物体对药物的吸收。
3.本发明制备的天然右旋龙脑纳米粒子工艺简单，易于操作，从而减少了人力物力的投入，节约制备成本和时间。
4.本发明制备的天然右旋龙脑纳米粒子，相比于单独天然右旋龙脑，天然右旋龙脑纳米粒子具有明显的抗肿瘤活性，且具有良好的靶向性。
5.本发明制备的天然右旋龙脑纳米粒子，与抗肿瘤药物具有协同增效作用，实现明显高效的抗肿瘤效果。
附图说明
图1为实施例1制备得到的天然右旋龙脑纳米粒子a的表征结果图；其中，图A为透射电镜照片图，图B为粒度测量结果图。
图2为实施例1制备得到的天然右旋龙脑纳米粒子b的表征结果图；其中，图A为透射电镜照片图，图B为粒度测量结果图。
图3为实施例1制备得到的天然右旋龙脑纳米粒子c的表征结果图；其中，图A为透射电镜照片图，图B为粒度测量结果图。
图4为实施例1制备得到的天然右旋龙脑纳米粒子d的表征结果图；其中，图A为透射电镜照片图，图B为粒度测量结果图。
图5为实施例1制备得到的天然右旋龙脑纳米粒子a～d分别在水溶液中的粒径随时间变化的检测结果图。
图6为实施例2制备得到的天然右旋龙脑纳米粒子e～h在不同浓度下抑制A549细胞生长的存活率结果图。
图7为实施例3制备得到的NBNPs自身及其与Gefitinib联合应用的体外抗肿瘤活性的检测结果图；其中，图A为NBNPs和NB在不同浓度下抑制A549细胞生长的存活率图；图B为NBNPs和NB在不同浓度下抑制WI38细胞生长的存活率图；图C为NBNPs和NB联合Gefitinib抑制A549细胞生长的存活率图；图D为NBNPs和NB联合Gefitinib抑制WI38细胞生长的存活率图。
图8为实施例3制备得到的NBNPs联合Gefitinib作用A549细胞的机理探索结果图；其中，图A为NBNPs和NB联合Gefitinib处理A549细胞后的活性氧水平随时间的变化图；图B为NBNPs联合Gefitinib引起A549细胞周期的变化图。
图9为实施例3制备的NBNPs和NB分别与Gefitinib以不同的处理方法对裸鼠体重和肿瘤的影响图；其中，图A为裸鼠的体重变化影响图；图B为肿瘤的体积变化影响图；图C为肿瘤重量的影响图。
图10为实施例3制备的NBNPs和NB分别与Gefitinib以不同方式处理后裸鼠主要器官后的H&E染色切片图。
图11为实施例3制备的NBNPs和NB分别与Gefitinib以不同方式处理后裸鼠的血液指标检测结果图；其中，图A为BUN(尿素氮)的检测结果图；图B为ALT(谷丙转氨酶)的检测结果图；图C为AST(谷草转氨酶)的检测结果图；图D为CHOL(总胆固醇)的检测结果图；图E为LDH(乳酸脱氢酶)的检测结果图；图F为CK(肌酸激酶)的检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。
细胞株均从美国模式培养物集存库ATCC购买；雌性BALB/c裸鼠均从北京维通利华生物科技股份有限公司购买。
实施例1天然右旋龙脑纳米粒子的制备
分别称取四组天然右旋龙脑10mg，在下用3mL无水乙醇充分溶解，得到A、B、C、D四种溶液，其中：A、B两组边搅拌边滴加6mL吐温80(Sigma公司)、5mL橄榄油和86mL超纯水；C、D两组边搅拌边滴加6mL质量分数为10％的泊洛沙姆188(Sigma公司)、5mL橄榄油和86mL超纯水，得到的混合溶液中天然右旋龙脑的浓度为0.1mg/mL。将四组混合溶液在磁力搅拌器上以500rpm的速率搅拌均匀后得到水包油(O/W)型乳液。将A、C组乳液以60MPa的均质压力进行高压均质，B、D组乳液以120MPa的均质压力进行高压均质，均质时间为2min，得到的四种纳米粒子，分别命名为天然右旋龙脑纳米粒子a、b、c、d。
通过透射电子显微镜(Hitachi H-7650)及Nano-ZS纳米粒度仪(英国Malvern公司)对所制备的四组右旋龙脑纳米粒子进行形态表征和粒度分布测试。结果如图1～4所示：图1～4分别为天然右旋龙脑纳米粒子a、b、c、d在比例尺50nm下的照片图以及粒度测量结果图，可知，天然右旋龙脑纳米粒子a呈圆球形，平均粒径接近50nm，粒度分散不均一；天然右旋龙脑纳米粒子b呈圆球形，平均粒径接近30nm，且粒度均一，分散均匀；天然右旋龙脑纳米粒子c呈不规则形状，平均粒径接近30nm，粒度分散不均一；天然右旋龙脑纳米粒子d呈圆球形，平均粒径接近30nm，粒度分散不均一，结果说明制备条件为表面活性剂类型为吐温80，均质压力为120MPa所得到的天然右旋龙脑纳米粒子粒度最均匀，分散最好，更有利于生物的应用。
通过Nano-ZS纳米粒度仪(英国Malvern公司)测量天然右旋龙脑纳米粒子a～d的动态变化。首先，取上述的制备得到的天然右旋龙脑纳米粒子a～d各50μL与超纯水950μL混合均匀于不同的粒度皿中，测量不同粒子的在不同时间下的粒径变化。结果如图5所示，制备条件为表面活性剂类型为吐温80，均质压力为120MPa所得到的天然右旋龙脑纳米粒子b在水溶液中的粒径在7日内保持稳定，平均水合粒径接近150nm，而其余三种天然右旋龙脑纳米粒子的粒径均有不同程度的波动，说明以吐温80作为表面活性剂，均质压力为120MPa时所制得的天然右旋龙脑纳米粒子性质最稳定。
由以上结果可知，均质压力为120MPa，表面活性剂类型为吐温80的制备条件可获得粒度均匀、最稳定的右旋龙脑纳米体系，因此可能比其他体系更容易被细胞吸收。
实施例2天然右旋龙脑纳米粒子体外抗肿瘤活性的比较
分别称取四组天然右旋龙脑800mg，在下用9mL无水乙醇充分溶解，得到E、F、G、H四种溶液，其中：E、F两组边搅拌边滴加18mL吐温80(Sigma公司)、15mL橄榄油和58mL超纯水；G、H两组边搅拌边滴加18mL质量分数为10％泊洛沙姆188(Sigma公司)、15mL橄榄油和58mL超纯水，得到的混合溶液中天然右旋龙脑的浓度为8mg/mL。将四组混合溶液在磁力搅拌器上以500rpm的速率搅拌均匀后得到水包油(O/W)型乳液。将E、G组乳液以60MPa的均质压力进行高压均质，F、H组乳液以120MPa的均质压力进行高压均质，均质时间为2min，得到的四种纳米粒子，分别命名为天然右旋龙脑纳米粒子e、f、g、h。
随后，取对数生长的人非小细胞肺癌细胞A549细胞以2×104个细胞/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL。待细胞贴壁后，加入不同浓度的天然右旋龙脑纳米粒子e、f、g、h。加药48h后每孔加入30μL 5mg/mL MTT避光孵育3.5h，弃去含有MTT的上清液，每孔加入150μL DMSO，恒温震荡15min，利用多功能荧光酶标仪(ELX800，美国Bio-Tek公司)测试波长为570nm处吸光值并计算存活率。由图6可知，表面活性剂为吐温80，均质压力为120MPa条件下制备的天然右旋龙脑纳米粒子对A549细胞的抑制增长作用最明显，说明该体系具有明显的抗肿瘤活性。
实施例3NBNPs体外抗肿瘤活性测试
首先，称取天然右旋龙脑800mg，在下用9mL无水乙醇充分溶解，边搅拌边向其溶液滴加18mL吐温80(Sigma公司)、15mL橄榄油和58mL超纯水，得到的混合溶液中天然右旋龙脑的浓度为8mg/mL。将混合溶液在磁力搅拌器上以500rpm的速率搅拌均匀后得到水包油(O/W)型乳液。将乳液以120MPa的均质压力进行高压均质，均质时间为2min，得到天然右旋龙脑纳米粒子，并命名为NBNPs。
随后，运用MTT比色法检测本实施例所制备的NBNPs抑制人肺癌细胞A549和人正常肺细胞WI38增殖的能力。取对数生长的A549细胞和WI38细胞以2×104个细胞/mL的密度分别接种于不同的96孔板中，每孔100μL。待细胞贴壁后，每孔加入100μL含有待测药物的DMEM(Sigma公司)，待测药物分别为NBNPs(160μM、80μM、40μM、20μM)，NB(160μM、80μM、40μM、20μM)。加药72h后每孔加入30μL浓度为5mg/mL的MTT溶液避光孵育3.5h，弃去含有MTT的上清液，每孔加入150μL DMSO，恒温震荡15min，利用多功能荧光酶标仪(ELX800，美国Bio-Tek公司)测试波长为570nm处吸光值并计算存活率(结果如如图7A，B所示)。
其次，运用MTT比色法检测本实施例所制备的NBNPs联合Gefitinib抑制人肺癌细胞A549和人正常肺细胞WI38增殖的能力。取对数生长的A549细胞和WI38细胞以2×104个细胞/mL的密度接种于96孔板中，每孔100μL。待细胞贴壁后，每孔加入100μL含有待测药物的DMEM(Sigma公司)，待测药物分别为Gefitinib(20μM)，NBNPs(160μM)，NB(160μM)，NBNPs(160μM)+Gefitinib(20μM)，NB(160μM)+Gefitinib(20μM)。加药72h后每孔加入30μL浓度为5mg/mL的MTT溶液避光孵育3.5h，弃去含有MTT的上清液，每孔加入150μL DMSO，恒温震荡15min，利用多功能荧光酶标仪(ELX800，美国Bio-Tek公司)测试波长为570nm处吸光值并计算存活率(结果如如图7C，D所示)。
结果如图7所示：图7A为NBNPs和NB在不同浓度下抑制A549细胞生长的存活率图，结果显示，NBNPs较单独NB能显著抑制A549细胞的增殖，说明右旋龙脑纳米化后具有抗肿瘤良好的活性；图7B为NBNPs和NB在不同浓度下抑制WI38细胞生长的存活率图，结果显示，经过不同浓度NBNPs处理后，WI38仍具有较高的存活率，即NBNPs对正常细胞WI38伤害较小，说明了NBNPs对A549肿瘤细胞和WI38正常细胞具有良好的选择性；图7C为NBNPs和NB(160μM)联合Gefitinib(20μM)抑制A549细胞生长的存活率图，结果显示，单独NBNPs治疗A549细胞后，其存活率为42.3％，联合Gefitinib后，其将为存活率为9.1％，说明NBNPs和Gefitinib抑制肿瘤生长具有协同增敏作用；图7D为NBNPs和NB(160μM)联合抑制Gefitinib(20μM)抑制WI38细胞生长的存活率图，如图所示，单独Gefitinib处理WI38细胞后，其存活率为73％，而联合NBNPs后，其存活率为93.2％，说明NBNPs能降低Gefitinib对WI38细胞的毒害作用。
实施例4NBNPs与抗肿瘤药物协同增敏效果评价
本实施例所用NBNPs采用实施例3方法制备得到
取对数生长A549细胞以2×105个细胞/mL的密度接种于不同的96孔板中，每孔100μL。待细胞贴壁后，每孔加入100μL浓度为800μM的NB或NBNPs(每孔NB或NBNPs的终浓度为400μM)孵育1.5h后，加入10μM DCFH-DA探针避光培养30min，于联合组中加入4.5μL 0.4mg/mL Gefitinib(终浓度为20μM)后，利用多功能荧光酶标仪于激发波长为488nm，发射波长为525nm处每5min测量荧光吸收值，连续2h。
图8A为NBNPs和NB与Gefitinib以不同方式处理A549细胞后的活性氧水平随时间的变化图，结果说明，相比于单独NB，NBNPs在120min内能够提高A549细胞内ROS水平，说明天然右旋龙脑纳米化后具有抗肿瘤活性是通过提高A549内的活性氧水平而诱导细胞凋亡来实现的。同样地，相比于单独NBNPs，单独Gefitinib，NBNPs联合Gefitinib处理A549细胞后，更明显地提高了细胞内ROS水平，NBNPs与Gefitinib协同增敏的抗肿瘤作用是通过提高在肺癌细胞A549内的活性氧水平，可有效引起A549细胞内DNA损伤，从而导致细胞凋亡来实现的。
周期阻滞和细胞凋亡是抗肿瘤药物诱导细胞死亡的两种重要方式。因此，本发明利用Beckman流式细胞仪分析了NBNPs联合Gefinitib引起A549细胞死亡的方式。取对数生长A549细胞以2×104个细胞/mL的密度接种于不同的6cm皿中，每个皿加入5mL。待细胞贴壁后，处理组加入终浓度为200μM NB或NBNPs，并在联合组加入终浓度为20μM的Gefitinib。64h后，收集细胞，用预冷的70％乙醇于-20℃冰箱中固定24h，1500rpm离心10min后用300μL碘化丙啶(Sigma公司)避光染色30min，用flowjo V10软件分析细胞周期。
图8B为NBNPs联合Gefitinib引起A549细胞周期的变化图。如图所示，单独NB的凋亡峰(Sub-G1)为9.03％，NBNPs处理A549细胞后Sub-G1为19.9％。显然，相比于单独NB，天然右旋龙脑纳米化后发挥显著的抗肿瘤活性是通过诱导细胞凋亡的方式来实现的。此外，相比于单独NBNPs的Sub-G1(19.9％)和单独Gefitinib的Sub-G1(9.6％)，NBNPs联合Gefitinib组的Sub-G1为48.3％，说明NBNPs联合Gefitinib是通过诱导细胞凋亡的方式来显著抑制A549肺癌细胞的增殖。
实施例5NBNPs联合Gefitinib的体内抗肿瘤活性评价
对实施例3制得的天然右旋龙脑纳米粒子(NBNPs)进行体内抗肿瘤活性评价，具体实施步骤如下：
(1)A549人非小细胞肺癌荷瘤裸鼠模型建立：30只雌性BALB/c裸鼠(4周龄，体重20g，从北京维通利华生物科技股份有限公司购买)，通过10天的检疫期后，收集体外培养的A549人非小细胞肺癌细胞以1×107个细胞/mL的密度接种于裸鼠的右侧腋窝皮下，每只100μL。待肿瘤细胞移植9天后，接种处可见微小肿瘤形成。将动物随机分组，每组5只，一共6组。分别为：对照组、NB组(50mg/kg)、NB(50mg/kg)+Gefitinib(20mg/kg)组、NBNPs组(50mg/kg)、NBNPs(50mg/kg)+Gefitinib(20mg/kg)组和Gefitinib(20mg/kg)组。
(2)药物处理方式：各实验组以隔天灌胃的方式给药并持续21天，对照组以纯水进行灌胃，分别以肿瘤体积、裸鼠体重为测试指标，记录肿瘤体积、体重随时间的变化，绘制变化曲线。第21天后对各组裸鼠处死，手术剥取瘤块称重。肿瘤体积(Tumor volume,TV)的计算公式为：TV＝1/2×a×b2(a、b分别表示长和宽)。
图9为实施例3制备的NBNPs和NB与Gefitinib以不同的处理方法对裸鼠和肿瘤的影响图；其中图A为裸鼠的体重变化影响图；图B为肿瘤的体积变化影响图；图C为肿瘤重量的影响图。如图9A所示，NBNPs联合Gefitinib组对裸鼠的体重无明显影响，说明NBNPs与Gefitinib的联合作用对机体无明显毒性。由图9B和9C可知，与单独NB组的体积(570mm3)和重量(1.0g)相比，NBNPs组的体积和重量显著降低，分别为326.7mm3和0.6g，说明天然右旋龙脑纳米化后抗肿瘤活性显著提高。此外，与单独NB组、NBNPs组、Gefitinib组、NB+Gefitinib组相比，NBNPs+Gefitinib组的肿瘤体积增长最缓慢，说明天然右旋龙脑纳米化后能显著提高增敏效果并且能显著抑制A549肺癌生长。
图10为实施例3制备的NBNPs和NB与Gefitinib以不同的方法处理裸鼠主要器官后的H&E染色切片的图。如图所示，单独Gefitinib组引起了肿瘤肾小管上皮细胞水肿，但NBNPs联合Gefitinib治疗能降低Gefitinib对肾的损伤。与对照组相比，NBNPs组与NBNPs联合Gefitinib治疗组并没有引起机体心、肝、脾、肺的病变。由此可知，NBNPs有效地增强Gefitinib在肿瘤细胞内的治疗效果的同时对机体的毒性非常小，整体实现了高效、低毒的目标。图11为NBNPs和NB与Gefitinib以不同方式处理后裸鼠的血液指标分析图，如图所示，LDH(乳酸脱氢酶)和CK(肌酸激酶)显示NBNPs与Gefitinib联合作用能够缓解肿瘤生长引起的心脏损伤，BUN(尿素氮)结果显示能够缓解肾损伤，ALT(谷丙转氨酶)、AST(谷草转氨酶)和CHOL(总胆固醇)结果显示能够缓解肝损伤。此外，单独Gefitinib组的CK和AST值甚至高于对照组的，联合NBNPs作用后，CK和AST值恢复接近于健康裸鼠的CK和AST值，说明NBNPs能够阻止Gefitinib对机体心脏和肝脏的损伤。
综上所述，NBNPs能有效提高肺癌药物Gefitinib的肿瘤生长抑制作用，同时降低Gefitinib带来的机体毒副作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种抗肿瘤药物，其特征在于：包括吉非替尼和天然右旋龙脑纳米粒子；
所述天然右旋龙脑纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
（1）将天然右旋龙脑和有机溶剂混合搅拌，使天然右旋龙脑完全溶解，得到混合溶液；
（2）向步骤（1）得到的混合溶液中加入表面活性剂、油脂和水，搅拌均匀后，得到水包油型乳液；
（3）将步骤（2）所得的水包油型乳液均质，得到天然右旋龙脑纳米粒子；
步骤（2）所述表面活性剂为吐温80；步骤（3）中所述的均质的压力为60 MPa～150 MPa。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤药物，其特征在于：
步骤（1）中所述的有机溶剂为无水乙醇、乙醚、氯仿中的一种或至少两种；
步骤（2）中所述的水为超纯水。
3.根据权利要求1所述的抗肿瘤药物，其特征在于：
步骤（1）中所述的有机溶剂的用量按天然右旋龙脑：有机溶剂=30～800 mg：9 mL配比计算；
步骤（2）中所述的表面活性剂的用量按天然右旋龙脑：表面活性剂=30～800 mg：18 mL配比计算；
步骤（2）中所述的油脂的用量按天然右旋龙脑：油脂=30～800 mg：15 mL配比计算。
4.根据权利要求1所述的抗肿瘤药物，其特征在于：
步骤（2）中所述的水包油型乳液中组成溶剂的各成分按体积百分比计，如下：水58%～86%、有机溶剂3～9%、表面活性剂6～18%、油脂 5～15%。
5.根据权利要求1所述的抗肿瘤药物，其特征在于：步骤（2）中所述的搅拌的转速为400～600 rpm；
步骤（3）中所述的均质的时间为2～10 min。
6.根据权利要求1所述的抗肿瘤药物，其特征在于：步骤（3）中所述的天然右旋龙脑纳米粒子的粒径为16 nm ～ 80 nm。
7.根据权利要求1所述的抗肿瘤药物，其特征在于：所述的肿瘤为肺癌、乳腺癌、宫颈癌、恶性黑色素瘤、肝癌或结肠癌。
CN201811375381.6A 2018-11-19 2018-11-19 一种天然右旋龙脑纳米粒子及其制备方法与应用 Active CN109394690B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811375381.6A CN109394690B (zh) 2018-11-19 2018-11-19 一种天然右旋龙脑纳米粒子及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811375381.6A CN109394690B (zh) 2018-11-19 2018-11-19 一种天然右旋龙脑纳米粒子及其制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109394690A CN109394690A (zh) 2019-03-01
CN109394690B true CN109394690B (zh) 2021-08-27

Family

ID=65473940

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811375381.6A Active CN109394690B (zh) 2018-11-19 2018-11-19 一种天然右旋龙脑纳米粒子及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109394690B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102462660A (zh) * 2010-08-16 2012-05-23 重庆富进生物医药有限公司 冰片的水包油乳液的制备及用途
CN103610711A (zh) * 2013-11-21 2014-03-05 浙江中医药大学 一种冰片鸦胆子油纳米乳及其制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102462660A (zh) * 2010-08-16 2012-05-23 重庆富进生物医药有限公司 冰片的水包油乳液的制备及用途
CN103610711A (zh) * 2013-11-21 2014-03-05 浙江中医药大学 一种冰片鸦胆子油纳米乳及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Natural Borneol, a Monoterpenoid Compound, Potentiates Selenocystine-Induced Apoptosis in Human Hepatocellular Carcinoma Cells by Enhancement of Cellular Uptake and Activation of ROS-Mediated DNA Damage;Jianyu Su et al.;《PLoS One》;20130520;第8卷(第5期);摘要 *
Synergistic Apoptosis-Inducing Effects on A375 Human Melanoma Cells of Natural Borneol and Curcumin;Jianping Chen et al.;《PLoS One》;20140627;第9卷(第6期);摘要 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109394690A (zh) 2019-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Barai et al. Green synthesis of Nerium oleander-conjugated gold nanoparticles and study of its in vitro anticancer activity on MCF-7 cell lines and catalytic activity
Gavamukulya et al. Green synthesis and characterization of highly stable silver nanoparticles from ethanolic extracts of fruits of Annona muricata
CN109876023B (zh) 一种灵芝孢子油纳米乳及其制备方法与应用
CN107412196B (zh) 奥利司他纳米微球及其制备方法和在抗肿瘤药物中的应用
CN102614127A (zh) 一种白藜芦醇纳米分散体及其制备方法
CN104274498A (zh) 一种高效抗肿瘤灵芝提取物及其制备方法
CN109394690B (zh) 一种天然右旋龙脑纳米粒子及其制备方法与应用
CN102000133B (zh) 一种中药抗氧化制剂的制备方法
CN101580805A (zh) 布雷菲德菌素a产生菌及发酵法生产布雷菲德菌素a
Liu et al. Dual responsive hybrid nanoparticle for tumor chemotherapy combined with photothermal therapy
CN105670998B (zh) 一种钙化癌细胞的方法
CN104042620A (zh) 罗汉果醇在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的用途
CN1299753C (zh) 一种中药组合物及其制备方法和质量控制方法
Yang et al. Superior reducing carbon dots from proanthocyanidin for free-radical scavenging and for cell imaging
CN104667102B (zh) 高良姜地上部分挥发油的制备方法及用途
CN104922268B (zh) 一种从天然植物中提取活性物质的方法
CN102579402B (zh) 一种负载紫杉醇的囊泡的制备方法
CN106177035B (zh) 具有降血糖、抗癌的月季花有效提取物的制备方法及应用
CN102516385A (zh) 一种神经生长因子-紫杉醇偶联物及其制法和用途
CN104056159A (zh) 艳山姜挥发油滴丸及其制备方法
CN111406948B (zh) 一种蜈蚣藻多糖-纳米硒的制备方法及其应用
CN116041168B (zh) 一种金丝桃素的处理方法及获得的金丝桃素碳点和应用
AU2021105119A4 (en) Drug for treating ovarian cancer, and preparation method and use thereof
CN101933901A (zh) 一种含泰乐菌素的混悬注射液及其制备方法
CN102617526B (zh) 二倍半萜类化合物黑珀萜j及其制备方法和用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant