CN104274498A

CN104274498A - 一种高效抗肿瘤灵芝提取物及其制备方法

Info

Publication number: CN104274498A
Application number: CN201410476890.3A
Authority: CN
Inventors: 许克勇; 梁晋谊; 谭惠娴; 周杰棠; 周健平; 周敬豪
Original assignee: KAIPING HEALTHWISE HEALTH FOOD CO Ltd
Current assignee: KAIPING HEALTHWISE HEALTH FOOD CO Ltd
Priority date: 2014-09-18
Filing date: 2014-09-18
Publication date: 2015-01-14
Anticipated expiration: 2034-09-18
Also published as: CN104274498B

Abstract

本发明公开了一种高效抗肿瘤灵芝提取物，是以灵芝子实体、灵芝子实体与可食用油脂的混合物、灵芝子实体与富含油脂的可食材料的混合物中的一种为原料进行超临界CO₂萃取；萃取过程中，在超临界状态下，原料中的天然油脂被CO₂萃取带出，天然油脂作为天然夹带剂和载体，将灵芝子实体中的活性物质，特别是三萜类物质夹带提取出来，再经分离釜收集得到。本发明所获得的提取物富集了灵芝子实体中的高效抗肿瘤物质灵芝三萜，且制作工艺简单；本发明通过萃取方法及有效物质载体巧妙的专一性设置，使有效物质的萃取富集过程即为产品的制备过程，一步到位，三萜种类丰富并且总含量高，性状稳定，加工过程无引入二次污染物，食用安全。

Description

一种高效抗肿瘤灵芝提取物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗肿瘤提取物，具体是一种高效抗肿瘤灵芝提取物，属于医药及保健品制备技术领域。

背景技术

灵芝又称瑞草、仙草，性平味甘，为我国传统名贵中药。传统中医学所提及灵芝，是指赤灵芝的子实体部分，故灵芝子实体才是最正宗的灵芝真菌药效部位。灵芝子实体在日常保健、食疗、医药方面的应用在我国历史悠久，使用范例举不胜举，如东汉《神农本草经》列灵芝为“上药”，认为它有“益心气、安惊魄、补肝益气、坚筋骨、好颜色”等功效，“久食，轻身不老，延年神仙”。明朝李时珍所著《本草纲目》记载，灵芝“甘平、无毒益心气、活血、入心充血、助心充脉、补肝气、补中、增智慧、好颜色、利关节、坚筋骨，祛痰、健胃”。古代研究对灵芝从来不乏赞美之词，认为灵芝是“百利而无一害”。

现代研究进一步验证了灵芝的卓越功效，认为灵芝能提高机体免疫力，保肝护肝，镇定安神，促进损伤细胞修复，抑制肿瘤生长，提高机体抗氧化酶类的含量等，配合其他药物应用时更是具有增效减毒的作用，对机体无毒副不良反应。

鉴于灵芝的强大功效作用，医学临床上多浓缩灵芝有效成分制备灵芝提取物，并将其应用于肿瘤、癌症的辅助放化疗，能减轻放化疗毒副作用，提高患者对放化疗的耐受性，增强放化疗对肿瘤、癌症细胞的杀伤作用，并降低患者手术或放化疗后的转移、复发率。其中令人振奋欣喜的是，研究表明灵芝中的重要活性成分——灵芝三萜类物质能通过多种有效途径直接抑制或杀伤肿瘤、癌症细胞。

可见考察灵芝提取物的质量，其中一个重要的参考因素即为其灵芝三萜类物质的含量。大量研究已经证明，灵芝子实体所含三萜远远高于灵芝孢子，以灵芝子实体为提取原材料更有利于富集灵芝三萜类物质。另外目前所有研究均表明灵芝三萜制品的浓度或使用量与抗肿瘤效果存在剂量效应，两者为正相关关系，故可认为高效富集灵芝三萜的产品，相对应就有高效抗肿瘤的效果。

然而采用一般的溶剂提取方法所得的灵芝浸膏，三萜含量并不高，主要是因为其中所含杂质性成分多，且灵芝三萜为热敏性物质，传统的加热提取、浓缩方法容易导致其失活变性。因三萜类物质为脂溶性成分，且灵芝子实体中脂溶性成分很少，除去占干重绝大部分的几丁质、纤维素等不溶性物质外，剩余大部分是糖类、蛋白质等水溶性物质，故利用适合脂溶性物质提取的低温超临界CO₂萃取技术理论上能达到高效、专一的富集提取灵芝子实体中三萜类物质的效果。然而，实际应用中往往是收率过低，或根本收集不到产物，原因是灵芝子实体中的脂溶性物质实在是太少了，从萃取釜中提取出来后全部粘附到设备系统管道当中，难以收集得到最终产物。一般是采用加水、酒精、乙酸乙酯等人工夹带剂的方法对灵芝子实体进行夹带提取，以克服上述的不足，但提取所得的物质含不可食用甚至有毒的夹带剂，又要另外设置浓缩或干燥工序以减少无用溶剂、去除有毒溶剂，此反复加工的方法容易造成灵芝三萜类物质的受热损耗和延长工艺路线所造成的过程损耗，且一般引入的夹带剂极性较高，改变了超临界CO₂萃取原本的特性，损耗了其萃取的专一性。尤其是在进行灵芝的萃取时，引入水、酒精、甘油等夹带剂使大量极性较强的杂质进入到产物中，影响了目标功效物质灵芝三萜的富集效果，并且如此破坏萃取的专一性后无法得到性状均一的产物，长期存放中会出现分层、凝絮、乳化、沉淀析出等产品不稳定的情况，需要进一步对超临界提取产物进行复杂的后续分离纯化处理。另外引入极性夹带剂往往容易导致原料中的重金属被富集转移到产物中，使超临界萃取原本在杜绝产物重金属污染方面的技术优势无法得到体现，产物的重金属超标将严重影响到人的食用安全性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效抗肿瘤灵芝提取物及其制备方法，该提取物是以灵芝子实体、灵芝子实体与可食用油脂的混合物、灵芝子实体与富含油脂的可食材料的混合物中的一种为原料进行超临界CO₂萃取，萃取过程中，在超临界状态下，原料中的天然油脂被CO₂萃取带出，天然油脂作为灵芝子实体的天然夹带剂和载体，将灵芝子实体中的天然活性物质，特别是三萜类物质夹带提取出来，经分离釜收集得到；所获得的提取物富集了灵芝子实体中的高效抗肿瘤物质灵芝三萜，备方法简单，本发明的制备方法通过萃取方法及有效物质载体巧妙的专一性设置，使有效物质的萃取富集过程即为产品的制备过程，一步到位，产品中三萜种类丰富并且总含量高，性状稳定，加工过程无二次污染物引入，食用安全。

本发明的另一目的在于提供上述一种高效抗肿瘤灵芝提取物的制备方法。

本发明技术方案如下：一种高效抗肿瘤灵芝提取物，是以灵芝子实体、灵芝子实体与可食用油脂的混合物、灵芝子实体与富含油脂的可食材料的混合物中的一种为原料进行超临界CO₂萃取，萃取过程中，在超临界状态下，原料中的天然油脂被CO₂萃取带出，天然油脂作为天然夹带剂和载体，将灵芝子实体中的灵芝三萜类物质转移富集到天然油脂中，再通过分离釜收集获得；其制备方法包括如下步骤：

（1）将灵芝子实体投入萃取釜、可食用油脂作为夹带剂泵入，或将灵芝子实体混合可食用油脂直接投入萃取釜，或将灵芝子实体混合富含油脂的可食材料直接投入萃取釜，进行超临界CO₂萃取；

（2）原料放入萃取釜后，通入二氧化碳，在压力10~35MPa，温度35~55℃下萃取1~12小时；

（3）控制一级分离釜压力8~10MPa，温度30~50℃，进行分离，萃取完毕后从分离釜出口放出富含灵芝三萜类物质的复方功能油脂，即得所述高效抗肿瘤灵芝提取物；

（4）控制二级分离压力4~6MPa，温度30~50℃，进行分离，萃取完毕后放出少量水。

所述高效抗肿瘤灵芝提取物中的灵芝三萜类物质含量为30~80%。

所述富含油脂的可食材料优选油脂含量为10~50%的可食材料。

所述灵芝子实体与可食用油脂的混合比例、灵芝子实体与富含油脂的可食材料的质量混合比例可以是任意的比例，优选的混合比例为20%~80%:80%~20%。

优选的，制备时，所述灵芝子实体粉碎至20~200目的灵芝子实体粉末或切成0.1~0.5mm厚的灵芝子实体片；所述可食材料粉碎至20~200目的可食材料粉末。

优选的，所述可食用油脂为动物油、植物油、药材油、海藻油、真菌油及其他可食用的油脂中的一种或几种。

进一步优选的，所述可食用油脂为番茄油、南瓜籽油、薏苡仁油或具有抗肿瘤功效的可食用油脂。

优选的，所述富含油脂的可食材料是蛋黄粉、黄豆、花生、紫苏籽、油菜籽、亚麻籽、南瓜籽、薏苡仁、女贞子、五味子、当归、丹参、沙棘籽、葡萄籽、石榴籽、蜂胶、食用真菌孢子粉及其他富含油脂的可食材料的一种或几种。

进一步优选的，所述富含油脂的可食材料为具有抗肿瘤功效的富含油脂的可食材料，如药材五味子、当归、灵芝孢子等，可进一步协同提高产品的抗肿瘤功效。

采用本发明方法制备得到的高效抗肿瘤灵芝提取物可进一步应用于制备治疗或辅助治疗肿瘤、癌症的颗粒剂、片剂、口服液及其他医学上认可的、不同剂型的药物或保健品。

为进一步验证本发明产品中的总灵芝三萜含量与抗肿瘤效果的关系，进行了不同总灵芝三萜浓度的复方功能油脂的抗肿瘤作用研究。

采用本发明方法，以灵芝子实体与可食用油脂橄榄油按照1:1混合，放入萃取釜中，通入CO₂进行超临界萃取，控制萃取压力10MPa，温度45℃，萃取3.5h，从一级分离釜放出所获得的高效抗肿瘤灵芝提取物。测定提取物的灵芝总三萜浓度，设由低至高五个不同浓度组（0.4，0.8，1.6，3.2，6.4mg·mL^-1），以不同灵芝总三萜浓度的提取物进行实验。

实验方法：采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）考察上述不同灵芝总三萜浓度的提取物对人肝癌细胞株QGY7703，大鼠肝癌细胞株CBRH7919，人胃癌细胞株BGC823的增殖抑制作用。

细胞培养：用含有体积分数为10%的胎牛血清的RPMI -1640培养液，细胞在37℃和5% CO2 实验条件下常规培养。细胞于指数生长期用不同浓度的药物处理相应时间后进行检测。

MTT法检测不同灵芝总三萜浓度的提取物对各肿瘤细胞增殖的影响：取指数生长期的细胞加入96孔板中，每孔6 000个细胞，100μL。GLG设由低至高不同浓度组（0.4，0.8，1.6，3.2，6.4mg·mL^-1），阳性药物5-Fu（氟尿嘧啶）采用一般常用剂量：终浓度10μg·mL^-1。每孔设6个平行孔，置37 ℃条件下培养48 h，MTT法检测490 nm波长下每孔的OD值，按下列公式求出生长抑制率：生长抑制率/% =（1－用药组平均OD 值/对照组平均OD 值）×100%。

实验结果：提取物的灵芝总三萜浓度在0.4~6.4 mg/ml的药物浓度范围内，对3种肿瘤细胞株（QGY7703，CBRH7919，BGC823）均具有明显的增殖抑制效果，且呈现较好的量效依赖关系（见表1）。而阳性药物5-Fu对3种细胞株的抑制率分别为60.7 %，62.4 %，66.5 %。

表1 不同灵芝总三萜浓度的提取物对肿瘤细胞生长抑制率（%）

注: 与阳性药5-Fu作用48h对细胞增殖抑制率比较：p<0.05。

本发明相对于现有技术的有益效果在于：在进行灵芝子实体的超临界萃取过程中，无需引入水、酒精、乙酸乙酯、甘油等人工夹带剂，而是在超临界状态中，CO₂的作用下将原料灵芝子实体、可食用油脂、可食材料中的天然油脂萃取带出，进而使天然油脂作为灵芝子实体的天然夹带剂和载体，将灵芝子实体中的活性有效成分萃取出来。本发明制备工艺简单，萃取过程即为产品制备过程，通过萃取方法及有效物质载体巧妙的专一性设置，使产品生产一步到位，采用本发明方法获得的抗肿瘤灵芝提取物中三萜种类丰富并且总含量高，具有高效的抗肿瘤作用，产品性状稳定，加工过程无二次污染物引入，食用安全。

附图说明

图1为实施例2中以灵芝子实体和灵芝孢子粉为原料采用本发明方法制备得到的高效抗肿瘤灵芝提取物在三萜类物质吸收波长下检测所得的高效液相色谱图；图2为普通灵芝孢子油在三萜类物质吸收波长下检测所得的高效液相色谱图。

具体实施方式

实施例1 以灵芝子实体和富含油脂的可食材料亚麻籽为原料，采用如下方法制备：

（1）取粉碎成80目的灵芝子实体粉2kg和粉碎成80目的亚麻籽粉3kg按照2:3的质量比混合，投入萃取釜中；

（2）通入超临界CO₂进行萃取，控制萃取压力35MPa，温度35℃，萃取5h，萃取结束，控制一级分离釜压力9MPa，温度40℃，二级分离压力5MPa，温度30℃，进行分离，从一级分离釜放出高效抗肿瘤灵芝提取物868g，出油率为17.36%，取样检测总三萜含量为37.30%，萃取完毕后从二级分离釜放出少量水。

提取物中的总三萜含量的测定采用如下步骤：

（1）样品测定：准确称取提取物样品0.01g于100mL容量瓶中，加入无水乙醇80mL，超声溶解；用无水乙醇定容至刻度，过滤，取滤液作为供试液；取1mL供试液于具塞试管，在100℃水浴上蒸干溶剂；分别加入0.4mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和1.0mL高氯酸，摇匀，于60℃水浴加热15min，移入冰水浴中冷却，取出后加入5mL冰乙酸，摇匀后置于室温，用紫外分光光度计在548nm处以试剂空白溶液为参比测其吸光度；

（2）标准曲线的绘制：精密称取熊果酸对照品5mg，用甲醇溶解，置于50mL容量瓶中，并定容至刻度，配制成0.1mg/ml的熊果酸标准溶液；分别吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml标准溶液于具塞试管，在100℃水浴上蒸干溶剂；分别加入0.4mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和1.0mL高氯酸，摇匀，于60℃水浴加热15min，移入冰水浴中冷却，取出后加入5mL冰乙酸，摇匀后置于室温，用紫外分光光度计在548nm处以试剂空白溶液为参比测其吸光度；以对照品质量（mg）为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，要求回归方程的r值在0.9990以上；

（3）结果计算：根据熊果酸标准曲线计算供试液中总三萜的质量m，采用以下公式计算样品中的总三萜含量

，

式中，X为样品总三萜含量，% ；m为样品液中的三萜质量，mg；V₁为样品稀释体积，mL；V₂为样品液测定用体积，mL；M为样品质量，mg，检测结果表示到小数点后两位。

实施例2 以灵芝子实体和具有抗肿瘤功效的、富含油脂的可食材料灵芝孢子粉为原料，采用如下方法制备：

（1）取2kg粉碎成150目的灵芝子实体粉末和4kg粉碎成150目的破壁灵芝孢子粉按照1:2混合，放入萃取釜中，通入超临界CO₂进行萃取；

（2）控制萃取压力20MPa，温度45℃，萃取3h，萃取结束，控制一级分离釜压力10MPa，温度38℃，二级分离压力5.5MPa，温度40℃，进行分离，从一级分离釜放出高效抗肿瘤灵芝提取物824g，出油率为16.48%，按实施例1中总三萜含量的测定方法测得提取物中总三萜的含量为45.30%，萃取完毕后从二级分离釜放出少量水。

将制备得到的高效抗肿瘤灵芝提取物与普通灵芝孢子油在相同的高效液相色谱条件下进行测定，在三萜类物质吸收波长下，高效抗肿瘤灵芝提取物与普通灵芝孢子油的高效液相色谱图分别如图1、图2所示。由图1和图2对比可以看出，采用本发明制备得到的高效抗肿瘤灵芝提取物，其三萜类物质种类丰富，且每种三萜物质的峰值高，故总三萜含量大幅提高，这表明提取物对灵芝子实体中三萜物质的富集转移效果好，有利于提高提取物的抗肿瘤效果。

实施例3 以灵芝子实体和富含油脂的可食材料薏苡仁为原料，采用如下方法制备：

（1）取粉碎成150目的灵芝子实体粉2kg和粉碎成200目的薏苡仁粉3kg按照2:3的质量比混合，投入萃取釜中；

（2）通入超临界CO₂进行萃取，控制萃取压力28MPa，温度45℃，萃取3h，萃取结束，控制一级分离釜压力8MPa，温度45℃，二级分离压力4MPa，温度35℃，进行分离，从一级分离釜放出高效抗肿瘤灵芝提取物162g，出油率为3.24%，按实施例1中总三萜含量的测定方法测得提取物中总三萜的含量为62.60%，萃取完毕后从二级分离釜放出少量水。

实施例4 以灵芝子实体和富含油脂的可食材料当归为原料，采用如下方法制备：

（1）取1kg切成0.1~0.5mm厚的灵芝子实体片和4kg粉碎成80目的当归粉按照1:4的比例混合，投入萃取釜中；

（2）通入超临界CO₂进行萃取，控制萃取压力28MPa，温度45℃，萃取3h，萃取结束，控制一级分离釜压力10MPa，温度30℃，二级分离压力6MPa，温度30℃，进行分离，从一级分离釜放出高效抗肿瘤灵芝提取物164g，出油率为3.28%，按实施例1中总三萜含量的测定方法测得提取物中总三萜的含量为53.27%，萃取完毕后从二级分离釜放出少量水。

实施例5 以灵芝子实体为原料，灵芝孢子油作为夹带剂，采用如下方法制备：

（1）取2kg切成0.1~0.5mm厚的灵芝子实体片放入萃取釜中，通入超临界CO₂，夹带剂泵打入1kg灵芝孢子油进行萃取；

（2）控制萃取压力28MPa，温度55℃，萃取1h，萃取结束，控制一级分离釜压力8MPa，温度35℃，二级分离压力5.5MPa，温度45℃，进行分离，从一级分离釜放出高效抗肿瘤灵芝提取物987g，出油率为49%，按实施例1中总三萜含量的测定方法测得提取物中总三萜的含量为42.93%，萃取完毕后从二级分离釜放出少量水。

实施例6 以灵芝子实体和可食用油脂橄榄油为原料，采用如下方法制备：

（1）取2kg粉碎成20目的灵芝子实体粉末和2kg橄榄油按照1:1混合，放入萃取釜中，通入超临界CO₂进行萃取；

（2）控制萃取压力10MPa，温度45℃，萃取3.5h，萃取结束，控制一级分离釜压力9MPa，温度50℃，二级分离压力5.5MPa，温度50℃，进行分离，从一级分离釜放出高效抗肿瘤灵芝提取物1976g，出油率为49%，按实施例1中总三萜含量的测定方法测得提取物中总三萜的含量为35.21%，萃取完毕后从二级分离釜放出少量水。

实施例7 以灵芝子实体和富含油脂的可食材料五味子为原料，采用如下方法制备：

（1）取4kg粉碎成60目的灵芝子实体粉末和1kg粉碎成40目的五味子粉按照4:1混合，放入萃取釜中，通入超临界CO₂进行萃取;

（2）控制萃取压力15MPa，温度45℃，萃取3h，萃取结束，控制一级分离釜压力10MPa，温度40℃，二级分离压力5.5MPa，温度45℃，进行分离，从一级分离釜放出高效抗肿瘤灵芝提取物212g，出油率为4.24%，按实施例1中总三萜含量的测定方法测得提取物中总三萜的含量为68.09%，萃取完毕后从二级分离釜放出少量水。

实施例8 以灵芝子实体和富含油脂的可食材料石榴籽、亚麻籽、蜂胶、丹参为原料，采用如下方法制备：

（1）取1.5kg粉碎成40目的灵芝子实体粉末、1kg粉碎成40目的石榴籽粉、1kg粉碎成40目的亚麻籽粉、1kg粉碎成200目的蜂胶及二氧化硅混合粉、0.5kg粉碎成40目的丹参粉混合，放入萃取釜中，通入超临界CO₂进行萃取；

（2）控制萃取压力25MPa，温度40℃，萃取12h，萃取结束，控制一级分离釜压力9MPa，温度50℃，二级分离压力5.5MPa，温度35℃，进行分离，从一级分离釜放出高效抗肿瘤灵芝提取物550g，出油率为11.00%，按实施例1中总三萜含量的测定方法测得提取物中总三萜的含量为39.64%，萃取完毕后从二级分离釜放出少量水。

Claims

1.一种高效抗肿瘤灵芝提取物，其特征在于：是以灵芝子实体、灵芝子实体与可食用油脂的混合物、灵芝子实体与富含油脂的可食材料的混合物中的一种为原料进行超临界CO₂萃取，在超临界状态下，原料中的天然油脂被CO₂萃取带出，天然油脂作为天然夹带剂和载体，将灵芝子实体中的灵芝三萜类物质转移富集到天然油脂中，再通过分离釜收集获得；其制备方法包括如下步骤：

（3）控制一级分离釜压力8~10MPa，温度30~50℃，进行分离，萃取完毕后从分离釜出口放出富含灵芝三萜类物质的复方功能油脂，即为所述高效抗肿瘤灵芝提取物；

2.根据权利要求1所述的高效抗肿瘤灵芝提取物，其特征在于：所述高效抗肿瘤灵芝提取物中的灵芝三萜类物质含量为30~80%。

3.根据权利要求1所述的高效抗肿瘤灵芝提取物，其特征在于：所述富含油脂的可食材料中，可食材料的油脂含量为10~50%。

4.根据权利要求1所述的高效抗肿瘤灵芝提取物，其特征在于：所述灵芝子实体与可食用油脂的混合比例、灵芝子实体与富含油脂的可食材料的混合比例为20%~80%:80%~20%。

5.根据权利要求1所述的高效抗肿瘤灵芝提取物，其特征在于：所述灵芝子实体为粉碎至20~200目的灵芝子实体粉末或切成0.1~0.5mm厚的灵芝子实体片；所述可食材料为粉碎至20~200目的可食材料粉末。

6.根据权利要求1所述的高效抗肿瘤灵芝提取物，其特征在于：所述可食用油脂为动物油、植物油、药材油、海藻油、真菌油及其他可食用的油脂中的一种或几种。

7.根据权利要求1或6所述的高效抗肿瘤灵芝提取物，其特征在于：所述可食用油脂为番茄油、南瓜籽油、薏苡仁油或具有抗肿瘤功效的可食用油脂。

8.根据权利要求1所述的高效抗肿瘤灵芝提取物，其特征在于：所述富含油脂的可食材料是蛋黄粉、黄豆、花生、紫苏籽、油菜籽、亚麻籽、南瓜籽、薏苡仁、女贞子、五味子、当归、丹参、沙棘籽、葡萄籽、石榴籽、蜂胶、食用真菌孢子粉及其他富含油脂的可食材料的一种或几种。

9.根据权利要求1或3或8所述的高效抗肿瘤灵芝提取物，其特征在于：所述富含油脂的可食材料为具有抗肿瘤功效的富含油脂的可食材料。

10.根据权利要求1所述的高效抗肿瘤灵芝提取物，其特征在于：所述高效抗肿瘤灵芝提取物用于制备治疗或辅助治疗肿瘤、癌症的颗粒剂、片剂、口服液及其他医学上认可的、不同剂型的药物或保健品。