CN109363059A - 一种利用红曲霉发酵降解白果致敏致毒成分的方法及其制备的产品与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用红曲霉发酵降解白果致敏致毒成分的方法及其制备的产品与应用，包括如下步骤：(1)白果粉的制备；(2)红曲霉种子液的制备；(3)白果粉固态发酵培养基的制备；(4)白果粉红曲霉固态发酵。本发明利用红曲霉作为发酵菌种，发酵白果粉制备白果真菌发酵产品，与发酵前白果粉相比，银杏酚酸、MPN、MPNG含量显著下降，提高了白果粉安全性，发酵产品中除含有白果功能成分银杏黄酮、银杏萜内酯外，还含有红曲霉分泌次级代谢产物Monaconlin K、红曲色素、红曲多糖、γ‑氨基丁酸、麦角固醇，发酵产品可以应用在制备具有调节血脂、血糖和血压、抗氧化、抗辐射、抗肿瘤和抗疲劳的保健食品或药品的原料或配料。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵领域，具体涉及一种利用红曲霉发酵降解白果致敏致毒成分的方法及其制备的产品与应用。
背景技术
银杏树(Ginkgo biloba L.)为银杏科、银杏属落叶乔木中雌雄异株的裸子植物，最早出现在3.45亿年前的石炭纪，是世界上最古老的孑遗植物之一，原产于中国，素有“活化石”之称。银杏树的果实俗称白果，又名鸭脚掌、灵眼，最早记载于元朝《日用本草》，一直延用至今。
白果含有丰富的营养成分和功能成分，除了含有淀粉、蛋白质、脂肪、糖类之外，同时含有一定量的维生素、核黄素、胡萝卜素、黄酮类、萜内酯类、生物碱、多糖类、氨基酸、银杏酸、银杏果酚、脂固醇以及钙、磷、铁、钾、镁等微量元素成分。白果所含的营养成分和功能成分对人体有多方面的医疗保健作用。据《本草纲目》记载：白果“熟食温肺、益气、定喘嗽、缩小便、止白浊；生食降痰、消毒杀虫”。2015版《中国药典》中亦记载：性味甘苦涩，归肺经，具有敛肺定喘，止带缩尿之功效。现代研究也表明白果中的银杏黄酮、银杏萜内酯等成分具有抗氧化、抑制肿瘤、活血化瘀等功能，对脑血栓、老年性痴呆、高血压、高血脂、冠心病、动脉硬化、脑功能减退等疾病还具有特殊的预防和治疗效果。经常食用白果可以滋阴养颜、减缓衰老、舒张微血管、加快血液循环。鉴于白果的营养和药用价值，1992年，我国卫生部将白果列为“药食两用”资源。
白果虽然营养成分丰富，具有较多的保健功能，但是白果致敏中毒，导致死亡的例子常有报道。通过网络搜索中国在2006～2017年新闻报导白果中毒事件，发现白果可以使各个年龄段的人中毒，相对而言儿童在食用大量白果后更容易引起中毒。日本也有大量的白果中毒事例报道。Wada等调查了1930～1996年日本因食用白果而引起的中毒人数和死亡人数：白果中毒人数共有117人，其中有 24人严重至死亡。其中1～3岁的患者比例高达58％，4～6岁患者比例为15.9％， 7～9岁患者比例为8.7％，大于10岁患者比例为17.4％，说明白果更易使儿童中毒。
由于中毒事例报道常发，为了防止不良事件的发生，在日常食用白果时只能采取限量食用，如不能超过6颗或10颗等。这种估量式食用，不仅不能满足人们对这一营养医疗价值俱佳的药食同源食品的食用需求，还大大限制了白果食品加工业的发展，导致白果滞销，果农、白果加工企业经济损失，影响了银杏产业的健康发展。
归纳总结国内外的研究情况，目前认为白果中致敏致毒成分可能为：氰苷类物质、银杏酚酸、4′-O-甲基吡哆醇(4′-O-methylpyridoxine,MPN)及其葡萄糖基衍生物(MPN-5′-glucoside,MPNG)。氰苷，主要指一类α-羟腈的苷，是植物的一类内源性物质，早期认为白果也像苦杏仁一样含有苦杏仁苷及其同系物类的氰苷类物质，这类物质在白果加工或食用后通过水解产生氢氰酸而产生毒性，但是国内外的研究均表明现有的检测方法在白果中未能检测到氰化物的存在。银杏酚酸为漆酚酸类化合物，包括银杏酸、白果酚、白果二酚。白果外种皮、白果果仁中均含有银杏酚酸类化合物。现在的研究表明，银杏酚酸具有强烈的致敏作用。食用白果中毒的症状主要是痉挛、抽搐、失去意识。1985年日本学者Wada等首次从白果中分离出MPN，并猜测其可能是白果引发中毒的物质。1988年日本学者 Wada等采用多步分离结合动物实验，根据分离物引起的中毒症状，最终分离并获得了白果果仁致毒成分，经结构鉴定为MPN。2000年Scott第一次在白果中检测到MPNG。2011年，Kobayashi等研究表明白果果仁中同时存在MPNG，而且MPNG同样也具有致毒作用。可以看出目前的研究已明确白果果仁中的致毒成分主要是MPN和MPNG。
伴随着白果致敏中毒事件的不断出现，怎样降低白果的致敏致毒性也一直是研究的热点，文献中报道的方法主要有：(1)使用一定浓度的碳酸钠或碳酸氢钠溶液泡洗白果以希望除去白果中的氰苷类物质；(2)使用有机溶剂或超临界 CO2萃取结合物理分离方法的使用以希望除去白果中的银杏酚酸类物质，如专利 CN101785559B公开的方法；(3)钱怡云的博士论文(钱怡云，白果复合毒性物质基础及其减毒机制研究，南京中医药大学博士学位论文，2017年)及专利 CN105901476A公开的“基于物理与酶促联合方法解除白果毒性的方法”；(4) 余圆圆硕士论文中研究的微波炮制法、微生物发酵法、碱化学处理法、紫外线照射法和树脂吸附法(余圆圆，白果中的毒性成分及白果对阿尔兹海默病的干预作用研究，江苏大学硕士学位论文，2017年)。方法一并不是以降低银杏酚酸、 MPN、MPNG为目标。方法二需要使用有机溶剂、超临界装备，存在有机溶剂使用量大、难以放大的不足，此外，该方法仅能降低银杏酚酸，未提及可以降低 MPN和MPNG。方法三主要存在以下问题：(1)对白果致敏致毒成分的认识上仍存在缺陷，将氰苷类物质作为脱敏脱毒对象之一，忽略了重要致毒成分MPNG； (2)白果果仁中并不天然存在MPN解毒酶，即使有天然存在的MPN解毒酶，在整果中酶的区室化也难以发挥降解作用；(3)方法的第一、第二步的高温处理，灭活了果中存在的内源糖苷酶，从而阻止了分析测定前的制样过程中MPNG 水解成MPN，所以处理后测定的MPN含量降低，并不是MPN降解了，而是 MPNG不能转化为MPN，实际上MPN和MPNG的总量并没有变化(Daisuke,K. et al.Food Chemistry,2011,126:1198-1202)，所以并没有达到脱除MPN和MPNG 的目的；(4)步骤繁琐，反复高温处理，能耗高，需人工去胚芽，工作效率低。余圆圆的研究显示微波法可以降低银杏酚酸，但是该方法需要专用设备，难以放大，此外对营养与功能成分有或多或少的影响；微生物发酵法不能降低MPN和 MPNG，反而会增加MPN的含量；碱化学处理法和紫外线照射法联用虽然可以降低MPN标准液中的MPN含量，但是不能降低白果提取液中的MPN含量；阳离子树脂吸附法虽然可以降低MPN含量，但是也吸附了一些白果中的营养与功能成分。
红曲霉属于真菌界子囊菌门真子囊菌纲散子囊菌目红曲菌科红曲霉属。红曲霉是公认的益生菌，在中国已经有一千多年的应用历史，是生产红曲米的主要微生物，广泛应用于食品、保健和医学上。红曲霉在生长代谢过程中能分泌产生多种代谢物，包括初级代谢产物如多种酶、有机酸、脂肪酸等，以及次级代谢产物如Monaconlin K、红曲色素、红曲多糖、γ-氨基丁酸、麦角固醇等。红曲霉发酵过程中分泌产生的酶可催化发酵底物中的成分发生多种类型的反应如水解反应、转移反应、氧化还原反应等等，分泌产生的次级代谢产物具有多种生理活性如抗氧化、降血压、降血脂、抗疲劳、刺激细胞增殖、增强细胞免疫、抑菌、降低胆固醇含量、清除自由基、提高免疫力、预防糖尿病等。
发明内容
发明目的：针对当前白果中致敏致毒成分脱除或降解方法的不足，本发明提供一种利用红曲霉发酵降解白果致敏致毒成分的方法，该方法利用红曲霉作为发酵菌种，发酵白果粉制备白果真菌发酵产品，与发酵前白果粉相比，银杏酚酸、 MPN、MPNG含量显著下降，提高了白果粉的安全性，最终发酵产品中除含有白果功能成分银杏黄酮、银杏萜内酯外，还含有红曲霉分泌的次级代谢产物 Monaconlin K、红曲色素、红曲多糖、γ-氨基丁酸、麦角固醇，该发酵产品具有调节血脂、血糖和血压、抗氧化、抗辐射、抗肿瘤和抗疲劳等功效。
本发明的另一个目的是提供了上述方法制备的红曲霉固态发酵白果粉产品及其应用，该固态发酵白果粉可以制备具有调节血脂、血糖和血压、抗氧化、抗辐射、抗肿瘤和抗疲劳的保健食品或药品的原料或配料，制备功能更加强大的白果产品，有望深化白果深加工产业链，增加白果附加值，丰富白果深加工产品类型，促进白果加工产业的健康发展。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一种利用红曲霉发酵降解白果致敏致毒成分的方法，包括如下步骤：
(1)白果粉的制备：将去外种皮的白果干燥后，去骨质中种皮及膜质内种皮，得干燥的白果果仁，粉碎后得白果粉；
(2)红曲霉种子液的制备：取步骤(1)制备的白果粉，配制白果粉葡萄糖琼脂培养基，灭菌后备用；将红曲霉接种到白果粉葡萄糖琼脂固体培养基，连续活化培养；用无菌水将活化的红曲霉斜面孢子洗涤下来转入无菌容器中打散孢子团，制备孢子悬液；配制白果粉葡萄糖液体培养基，灭菌后接入孢子悬液，培养制备红曲霉种子液；
(3)白果粉固态发酵培养基的制备：取α-淀粉酶、糖化酶、木瓜蛋白酶用去离子水配制成混合酶液；取步骤(1)制备的白果粉，向其中加入混合酶液，酶解；取无机盐、无机氮源溶于去离子水中得无机营养液，取无机营养液加入酶解后的白果粉中，混合均匀后灭菌得到白果粉固态发酵培养基；
(4)白果粉红曲霉固态发酵：向步骤(3)制备的白果粉固态发酵培养基中加入步骤(2)制备的红曲霉种子液，进行固态发酵；发酵结束后，发酵物经干燥后得致敏致毒成分含量显著降低的白果粉红曲霉发酵产品。
作为优选，步骤(1)所述白果粉粒径为20-60目。步骤1中(1)所述的干燥可以是晒干、晾干、冷冻干燥、热风干燥、微波干燥、红外干燥中的一种或多种，干燥后白果果仁的含水量小于5％(质量百分比)，
其中，步骤(2)所述白果粉葡萄糖琼脂培养基配方为：白果粉2～3克，葡萄糖1.5～2克，琼脂1.5～2克，去离子水100毫升；所述的白果粉葡萄糖液体培养基配方为：白果粉3～5克，葡萄糖2～3克，去离子水100毫升。灭菌条件为 112～115℃、20～30分钟，连续活化培养3次，培养条件为25～35℃、3～7天。
作为优选，步骤(2)所述的孢子悬液浓度为1～5×108cfu/mL，孢子悬液接种量为白果粉葡萄糖液体培养基体积的5～10％。
作为优选，步骤(3)所述取步骤(1)制备的白果粉为100毫升容器中装入 6-20克白果粉。最优选为，100毫升三角瓶中装入10克的白果粉为最佳摇瓶装料量。
作为优选，步骤(3)所述的混合酶液每毫升中含20～50Uα-淀粉酶、300～700 U糖化酶和6000～14000U木瓜蛋白酶，混合酶液加入量为白果粉重量的 20～40％，酶解温度为25～37℃，酶解时间为30～120分钟。
作为优选，步骤(3)所述的无机盐为硫酸镁、碳酸钙、氯化钠、磷酸二氢钾中的一种或多种，无机氮源为氯化铵、硫酸铵和硝酸钠中的一种或多种，无机营养液中无机盐的浓度为质量分数1.5～5％、无机氮源浓度为质量分数1～3％，无机营养液添加量为白果粉重量的10～20％。最优选为，无机营养液含质量分数 0.5％硫酸镁、1％磷酸二氢钾和3％氯化铵。
作为优选，步骤(3)所述的红曲霉种子液添加量为固态培养基重量的 1～10％，发酵温度25～32℃，发酵时间8～20天。
作为优选，步骤(1)和步骤(4)所述干燥为冷冻干燥、热风干燥、微波干燥、红外干燥中的一种或多种。
本发明发酵结束后，发酵物经干燥后得白果粉红曲霉发酵产品，取样测定银杏酚酸、MPN、MPNG、银杏黄酮、银杏萜内酯、Monaconlin K、红曲色素、红曲多糖、γ-氨基丁酸、麦角固醇的含量，该发酵产品银杏酚酸、MPN、MPNG的含量显著降低，除含有白果功能成分银杏黄酮、银杏萜内酯外，还含有红曲霉分泌的次级代谢产物Monaconlin K、红曲色素、红曲多糖、γ-氨基丁酸、麦角固醇。
本发明所述的红曲霉为：红曲霉(Monascus anka)、紫红曲霉(Monascuspurpureus)、旱生红曲霉(Monascus eremophilus)、红色红曲霉 (Monascus ruber)、阿根廷红曲霉(Monascus argentinensis)、锈色红曲霉 (Monascus rubiginosus)、苍白红曲霉(Monascus pallens)、丛毛红曲霉(Monascus pilosus)、橙色红曲霉(Monascusaurantiacus)、巴斯红曲霉(Monascus paxii)、发白色红曲霉(Monascus albidulus)、高粱红曲霉(Monascus kaoliang)、烟色红曲霉(Monascus fuliginosus)、佛罗里达红曲霉(Monascus floridanus)、巴克红曲霉(Monascus barkeri)、橙色红曲霉(Monascusaurantiacus)中的一种或多种。
本发明所述的红曲霉固态发酵白果粉的方法所制备的致敏致毒成分含量银杏酚酸、MPN、MPNG显著降低的红曲霉固态发酵白果粉。
本发明所述的红曲霉固态发酵白果粉在制备调节血脂、血糖和血压、抗氧化、抗辐射、抗肿瘤和抗疲劳的保健食品或药品的原料或配料中的应用。
本发明以白果粉作为发酵基质，利用红曲霉作为发酵菌种，经固态发酵制备的白果粉真菌发酵产品。一方面，通过红曲霉发酵白果粉，利用红曲霉菌体内强大的酶系统，在发酵过程中降解银杏酚酸、MPN、MPNG，实现低或无银杏酚酸、 MPN、MPNG白果产品制备。另一方面，红曲霉发酵过程中会分泌很多功能性次级代谢产物，通过红曲霉发酵有望制备功能更加强大的白果产品，有望深化白果深加工产业链，增加白果附加值，丰富白果深加工产品类型，促进白果加工产业的健康发展。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点
(1)本发明利用红曲霉体内强大的酶系统降解银杏酚酸、MPN和MPNG 等白果致敏致毒成分，条件温和、靶向性强，发酵产品的致敏致毒性显著降低；
(2)本发明不使用有机溶剂，无需有机溶剂的多步反复萃取，工艺操作安全，产品无有机溶剂残留；
(3)本发明工艺操作简单、能耗低，易于工业化放大
(4)本发明的发酵产品不仅保留了白果中原有的功能性成分，还富含红曲霉分泌的多种次级代谢产物如Monaconlin K、红曲色素、红曲多糖、γ-氨基丁酸、麦角固醇，保健功能更强大，丰富白果的产品类型，促进白果加工产业的健康发展。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步说明。
主要试剂与药品及检测方法：
实施例所用白果原料主要有大果银杏、大梅核、大佛手、大金坠、大圆铃、大佛指、洞庭皇、大马铃等。液相检测用试剂、药品均为色谱纯，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。分析检测用标准品购自上海源叶生物科技有限公司。
本发明实施例中使用紫红曲霉Monascus purpureus CGMCC 3.4577、红色红曲霉Monascus ruber CGMCC 3.5834和红曲霉Monascus anka CGMCC 3.554购自中国普通微生物保藏管理中心，保藏于南京林业大学轻工与食品学院发酵工程实验室，也可以采用常规的其它红曲霉。α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶购自南宁东恒华道生物科技有限责任公司。
主要试剂与药品均由市售可得。
检测方法：
1、MPN和MPNG的HPLC测定
(1)检测条件
a)色谱柱：SinoChrom ODS-BP(5μm，4.6 250mm)；b)流动相A：含5mM 戊烷磺酸钠的5mM磷酸钾溶液(用磷酸调至pH为2.5)，流动相B：乙腈；c)梯度洗脱：0min，流动相比例为A96％，B 4％；0～10min，流动相比例为A 92％， B 8％；10～15min，流动相比例为A 90％，B10％；15～20min，流动相比例为A 92％，B 8％；20～40min，流动相比例为A 96％，B 4％；d)进样量：10μL；e)柱温30℃；f)保留时间：40min；g)流速：1mL/min；h)检测条件：荧光发射波长395nm，激发波长295nm。
(2)标准曲线绘制
MPN标准曲线的绘制
准确称取0.02g MPN标准品，加入少量超纯水溶解后转移到100mL容量瓶中，再继续加超纯水定容到100mL，制备成200mg/L MPN标准液。将标准液稀释成2mg/L，进样体积为：0.1、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、 50.0、100.0(单位：μL)，用HPLC检测各组浓度下的峰面积，根据峰面积与含量的线性关系，绘制标准曲线。
MPNG标准曲线的绘制
将MPNG标准品和MPN标准品(2mg/L)1/1体积比混合，进样体积为：0.1、0.5、 1.0、3.0、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、50.0、100.0(单位：μL)，用HPLC检测各组浓度下的峰面积，根据峰面积与含量的线性关系，计算出标准曲线。
2、银杏酚酸的HPLC测定
以总银杏酸作为对照品进行定性分析，以白果新酸作对照品进行定量分析，计算银杏酚酸含量。
(1)检测条件
a)色谱柱：SinoChrom ODS-BP(5μm，4.6×250mm)；b)流动相：甲醇-1％冰醋酸溶液(90:10，v/v)；c)检测波长：310nm；d)柱温：30℃；e)流速：1.0 mL/min
(2)标准曲线的绘制
白果新酸标准曲线的绘制
准确称取白果新酸标准品适量，用甲醇溶解、定容，配制成0.1、0.2、0.4、 0.6、0.8和1.0mg/mL白果新酸标准溶液，摇匀，过0.22μm的有机滤膜，待测，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。
总银杏酸标准曲线的绘制
称取总银杏酸标准品适量，用甲醇溶解、定容，配制成0.2mg/mL总银杏酸定性对照品溶液，摇匀，过0.22μm的滤膜，待测，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。
3、银杏黄酮的测定
参照刘德汞等(刘德汞,缑星,程方方,等.分光光度法测定银杏叶中的总黄酮.光谱实验室,2012，29(05):3001-3004)的方法并作适当调整。
(1)标准曲线的制作
用芦丁标准品配置成标准液并稀释至相应倍数，浓度梯度分别为0.008、 0.016、0.024、0.032、0.04、0.048、0.056、0.064和0.072mg/ml，显色后检测，并绘制标准曲线。
(2)样品处理
称取2g样品，加入20mL 70％乙醇溶液，65℃，搅拌2h，提取2次，8000 r/min离心10min合并上清，进行黄酮含量测定。
(3)测定及结果计算
检测采用紫外分光光度计芦丁法。取0.5mL待测样品，加入0.3mL5％亚硝酸钠溶液，放置6min，加入10％硝酸铝溶液0.3mL，放置6min，加入4％氢氧化钠溶液4mL，70％乙醇4.5mL，混合均匀后放置20min，在510nm下测定吸光度。根据测定的吸光值，通过标准曲线计算出黄酮含量。
4、银杏萜内酯的测定
参照赵汉辰(赵汉辰.银杏叶中银杏内酯B的提取、分离与纯化研究.北京: 中国矿业大学,2014)的方法并作适当调整。
(1)标准曲线的绘制
准确配制1.42mg/mL银杏内酯A标准溶液10ml，吸取0.0、0.2、0.4、0.6、 0.8和1.0mL分别置于20mL比色管中，显色后检测，并绘制标准曲线。
(2)样品处理
称取2.0g样品，加入20mL 70％乙醇溶液，65℃，搅拌2h，提取2次， 8000r/min离心10min合并上清，进行萜内酯含量检测。
(3)测定及结果计算
取1.0mL待测样品，置于20mL比色管中，加入70％乙醇溶液到1.0mL，然后加入0.4mL碱性羟胺溶液(13.9％盐酸羟胺水溶液+3.5mol/LNaOH溶液(1/2) 混合，现配现用)，反应5min后加入3mol/LHCl溶液0.4mL，6％FeCl3溶液0.2 mL，混合均匀，再加入70％乙醇溶液5mL，摇匀后在波长517nm处测定吸光度。根据测定的吸光值，通过标准曲线计算出萜内酯含量。
5、Monaconlin K的测定
(1)标准曲线的绘制
精密称取2mg Monaconlin K标准品于10mL的容量瓶中，用色谱甲醇定容，超声处理10min使之完全溶解，配制成浓度为0.2mg/mL的标准溶液。分别量取标准溶液1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL置于10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得到浓度分别为0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、 0.05mg/mL、0.06mg/mL的稀释溶液。吸取上述稀释溶液经0.22μm的微孔滤膜过滤注入小瓶中待用，以Monaconlin K浓度为横坐标，峰面积值为纵坐标，绘制Monaconlin K标准曲线。
(2)检测条件
C18色谱柱(型号为：SinoChrom ODS-BP 5μm,4.6mm×250mm)，温度 25℃，流动相为甲醇∶水＝80:20(v/v)，检测波长为238nm，流速1.0mL/min，进样量20μL。
(3)待测样品制备
固体发酵物中Monaconlin K的提取：发酵产物磨粉。称取0.5g粉溶于3mL 甲醇中，超声处理20min，40℃水浴过夜，4000rpm离心10min。上清过0.22μm 膜，待测。
6、红曲色素色价的测定
取样0.5克，再加入75％乙醇4.5mL，静置浸提4h，浸提完毕后用滤纸过滤。滤液再以75％乙醇稀释适当倍数后，以75％乙醇作空白对照，在波长510nm 处测定OD值。将OD值乘以稀释倍数，即为红曲色素色价(单位为U/g)。
7、红曲多糖的测定
参照胡居吾等(胡居吾,范青生,肖小年.粗多糖测定方法的研究.江西食品工业,2005,5(1):16-18)的方法并做适当改变。
(1)标准曲线的绘制
称取葡萄糖标准品10mg于250mL容量瓶中加水，定容，吸取0.6、0.8、 1.0、1.2、1.4、1.6和1.8mL，各以蒸馏水补至2.0mL，各加入5％的苯酚1.0mL，浓硫酸5.0mL，摇匀冷却，室温放置20min后于490nm处测吸光值，以2.0mL 蒸馏水按相同显色操作作为空白，横坐标为多糖含量，纵坐标为吸光值，绘制标准曲线。
(2)样品处理
取1.0g发酵物于50mL的离心管中，加无水乙醇9mL，混匀，于4℃冰箱静置4h，5000rpm离心5min，弃上清，残渣用80％的乙醇溶液洗涤，离心后弃去上清，反复3次，残渣用蒸馏水溶解，定容至10mL。
(3)样品测定
取1mL样品处理液于25mL的比色管中，按标准曲线的绘制过程加入苯酚、浓硫酸和吸光值测定。
(4)结果计算
按标准曲线中的公式，带入吸光值计算多糖含量。
8、麦角固醇和γ-氨基丁酸的测定
参照周立平的硕士学位论文测定(周立平.红曲霉发酵及某些生理活性物质的研究.杭州:浙江工业大学,2004)
实施例1
(1)取200克大佛指，冷冻干燥到水分含量为3.0％，去掉中种皮和内种皮，用固体粉碎机粉碎，用筛子筛分获得50目白果粉、40目白果粉、20目白果粉。
(2)称取2克50目白果粉、1.5克葡萄糖、1.5克琼脂溶于100毫升去离子水中，配制白果粉葡萄糖琼脂培养基，112℃灭菌30分钟，灭菌后倒平板备用。取紫红曲霉接种平板，连续活化三次。用少许无菌水将活化第三次平板上的紫红曲霉孢子洗涤下来转入100毫升无菌三角瓶中，加少许玻璃珠充分振荡打散孢子团，用无菌水稀释使孢子悬液的浓度为1×108cfu/mL。称取1.5克40目白果粉、 1.0克葡萄糖溶于50毫升去离子水中，115℃灭菌20分钟，冷却后接种2.5毫升制备的孢子悬液，在25℃培养7天，得紫红曲霉种子液。
(3)取α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶溶于去离子水中，使最终混合酶溶液中α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶的酶活分别为20U/mL、300U/mL和6000 U/mL。取10克20目白果粉装入100毫升三角瓶中，加入2克制备的混合酶液，在25℃酶解120分钟。取硫酸镁0.5克、磷酸二氢钾1克、氯化铵3克溶于100 毫升去离子水中得无机营养液，向酶解后的白果粉中加入2克制备的无机营养液，混合均匀后在121℃灭菌20分钟，得固态发酵培养基。
(4)向制备的固态发酵培养基中接种400毫克制备的紫红曲霉种子液，在 25℃发酵20天。
发酵结束后发酵物经冷冻干燥后得白果粉红曲霉发酵产品，取样测定银杏酚酸、MPN、MPNG、银杏黄酮、银杏萜内酯、Monaconlin K、红曲色素、红曲多糖、γ-氨基丁酸、麦角固醇的含量，与未发酵白果粉相比，银杏酚酸减少100％， MPNG减少100％，MPN减少96％，发酵产品中含银杏黄酮0.55mg/g、银杏萜内酯1.58mg/g、Monaconlin K 2.55mg/g、红曲色素色价680U/g、红曲多糖65 mg/g、γ-氨基丁酸0.45mg/g、麦角固醇4.21mg/g。
同时动物实验表明该发酵产品具有调节血脂、血糖和血压、抗氧化、抗辐射、抗肿瘤和抗疲劳的功效，可以用作制备具有调节血脂、血糖和血压、抗氧化、抗辐射、抗肿瘤和抗疲劳的保健食品或药品的原料或配料。
实施例2
(1)取200克大佛手，热风干燥到水分含量为4.0％，去掉中种皮和内种皮，用固体粉碎机粉碎，用筛子筛分获得60目白果粉、40目白果粉、20目白果粉。
(2)称取2.5克60目白果粉、1.8克葡萄糖、1.8克琼脂溶于100毫升去离子水中，配制白果粉葡萄糖琼脂培养基，112℃灭菌25分钟，灭菌后倒平板备用。取红曲霉接种平板，连续活化三次。用少许无菌水将活化第三次平板上的红曲霉孢子洗涤下来转入100毫升无菌三角瓶中，加少许玻璃珠充分振荡打散孢子团，用无菌水稀释使孢子悬液的浓度为3×108个/mL。称取2克40目白果粉、1.25 克葡萄糖溶于50毫升去离子水中，112℃灭菌25分钟，冷却后接种3.75毫升制备的孢子悬液，在30℃培养5天，得红曲霉种子液。
(3)取α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶溶于去离子水中，使最终混合酶溶液中α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶的酶活分别为35U/mL、500U/mL和10000 U/mL。取10克20目白果粉装入100毫升三角瓶中，加入3克制备的混合酶液，在32℃酶解60分钟。取硫酸镁1克、磷酸二氢钾2克、氯化铵2克溶于100毫升去离子水中得无机营养液。向酶解后的白果粉中加入1.5克步骤(8)制备的无机营养液，混合均匀后在121℃灭菌25分钟，得固态发酵培养基。
(4)向制备的固态发酵培养基中接种900毫克制备的红曲霉种子液，在 28℃发酵14天。
发酵结束后发酵物经冷冻干燥后得白果粉红曲霉发酵产品，取样测定银杏酚酸、MPN、MPNG、银杏黄酮、银杏萜内酯、Monaconlin K、红曲色素、红曲多糖、γ-氨基丁酸、麦角固醇的含量，与未发酵白果粉相比，银杏酚酸减少97％， MPNG减少96％，MPN减少91％，发酵产品中含银杏黄酮0.57mg/g、银杏萜内酯1.63mg/g、Monaconlin K 2.35mg/g、红曲色素色价650U/g、红曲多糖55 mg/g、γ-氨基丁酸0.41mg/g、麦角固醇4.02mg/g。
动物实验表明该发酵产品具有调节血脂、血糖和血压、抗氧化、抗辐射、抗肿瘤和抗疲劳的功效，可以用作制备具有调节血脂、血糖和血压、抗氧化、抗辐射、抗肿瘤和抗疲劳的保健食品或药品的原料或配料。
实施例3
(1)取200克大马铃，晒干到水分含量为5.0％，去掉中种皮和内种皮，用固体粉碎机粉碎，用筛子筛分获得40目白果粉、30目白果粉、40目白果粉。
(2)称取3克40目白果粉、2克葡萄糖、2克琼脂溶于100毫升去离子水中，115℃灭菌20分钟，灭菌后倒平板备用。取红色红曲霉接种平板，连续活化三次。用少许无菌水将活化第三次平板上的红色红曲霉孢子洗涤下来转入100 毫升无菌三角瓶中，加少许玻璃珠充分振荡打散孢子团，用无菌水稀释使孢子悬液的浓度为5×108个/mL。称取2.5克30目白果粉、1.5克葡萄糖溶于50毫升去离子水中，112℃灭菌30分钟，冷却后接种5毫升制备的孢子悬液，在35℃培养3天，得红色红曲霉种子液。
(3)取α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶溶于去离子水中，使最终混合酶溶液中α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶的酶活分别为50U/mL、700U/mL和14000 U/mL。取10克40目白果粉装入100毫升三角瓶中，加入4克制备的混合酶液，在37℃酶解30分钟。取硫酸镁1.5克、磷酸二氢钾3克、氯化铵3克溶于100 毫升去离子水中得无机营养液。向酶解后的白果粉中加入1克制备的无机营养液，混合均匀后在121℃灭菌30分钟，得固态发酵培养基。
(4)向制备的固态发酵培养基中接种1.5克制备的红色红曲霉种子液，在 32℃发酵8天。
发酵结束后发酵物经冷冻干燥后得白果粉红曲霉发酵产品，取样测定银杏酚酸、MPN、MPNG、银杏黄酮、银杏萜内酯、Monaconlin K、红曲色素、红曲多糖、γ-氨基丁酸、麦角固醇的含量，与未发酵白果粉相比，银杏酚酸减少94％， MPNG减少92％，MPN减少86％，发酵产品中含银杏黄酮0.61mg/g、银杏萜内酯1.73mg/g、Monaconlin K 2.15mg/g、红曲色素色价620U/g、红曲多糖47 mg/g、γ-氨基丁酸0.36mg/g、麦角固醇3.78mg/g。
动物实验表明该发酵产品具有调节血脂、血糖和血压、抗氧化、抗辐射、抗肿瘤和抗疲劳的功效，可以用作制备具有调节血脂、血糖和血压、抗氧化、抗辐射、抗肿瘤和抗疲劳的保健食品或药品的原料或配料。
实施例4
(1)取200克大佛指，冷冻干燥到水分含量为3.0％，去掉中种皮和内种皮，用固体粉碎机粉碎，用筛子筛分获得40目白果粉、30目白果粉、20目白果粉。
(2)称取2克40目白果粉、1.5克葡萄糖、1.5克琼脂溶于100毫升去离子水中，配制白果粉葡萄糖琼脂培养基，112℃灭菌30分钟，灭菌后倒平板备用。取紫红曲霉接种平板，连续活化三次。用少许无菌水将活化第三次平板上的紫红曲霉孢子洗涤下来转入100毫升无菌三角瓶中，加少许玻璃珠充分振荡打散孢子团，用无菌水稀释使孢子悬液的浓度为1×108个/mL。称取1.5克30目白果粉、 1.0克葡萄糖溶于50毫升去离子水中，115℃灭菌20分钟，冷却后接种2.5毫升制备的孢子悬液，在25℃培养7天，得紫红曲霉种子液。
(3)取α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶溶于去离子水中，使最终混合酶溶液中α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶的酶活分别为20U/mL、300U/mL和6000 U/mL。取6克20目白果粉装入100毫升三角瓶中，加入2.4克制备的混合酶液，在25℃酶解120分钟。取碳酸钙1克、氯化钠2克、氯化铵3克溶于100毫升去离子水中得无机营养液，向酶解后的白果粉中加入0.84克制备的无机营养液，混合均匀后在121℃灭菌20分钟，得固态发酵培养基。
(4)向制备的固态发酵培养基中接种100毫克制备的紫红曲霉种子液，在 25℃发酵20天。
发酵结束后发酵物经冷冻干燥后得白果粉红曲霉发酵产品，取样测定银杏酚酸、MPN、MPNG、银杏黄酮、银杏萜内酯、Monaconlin K、红曲色素、红曲多糖、γ-氨基丁酸、麦角固醇的含量，与未发酵白果粉相比，银杏酚酸减少93％， MPNG减少90％，MPN减少85％，发酵产品中含银杏黄酮0.62mg/g、银杏萜内酯1.74mg/g、Monaconlin K 2.13mg/g、红曲色素色价618U/g、红曲多糖45mg/g、γ-氨基丁酸0.32mg/g、麦角固醇3.58mg/g。
动物实验表明该发酵产品具有调节血脂、血糖和血压、抗氧化、抗辐射、抗肿瘤和抗疲劳的功效，可以用作制备具有调节血脂、血糖和血压、抗氧化、抗辐射、抗肿瘤和抗疲劳的保健食品或药品的原料或配料。
实施例5
(1)取200克大佛指，冷冻干燥到水分含量为3.0％，去掉中种皮和内种皮，用固体粉碎机粉碎，用筛子筛分获得60目白果粉、30目白果粉、20目白果粉。
(2)称取2克60目白果粉、1.5克葡萄糖、1.5克琼脂溶于100毫升去离子水中，配制白果粉葡萄糖琼脂培养基，112℃灭菌30分钟，灭菌后倒平板备用。取紫红曲霉接种平板，连续活化三次。用少许无菌水将活化第三次平板上的紫红曲霉孢子洗涤下来转入100毫升无菌三角瓶中，加少许玻璃珠充分振荡打散孢子团，用无菌水稀释使孢子悬液的浓度为1×108个/mL。称取1.5克30目白果粉、 1.0克葡萄糖溶于50毫升去离子水中，115℃灭菌20分钟，冷却后接种2.5毫升制备的孢子悬液，在25℃培养7天，得紫红曲霉种子液。
(3)取α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶溶于去离子水中，使最终混合酶溶液中α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶的酶活分别为20U/mL、300U/mL和6000 U/mL。取20克20目白果粉装入100毫升三角瓶中，加入4克制备的混合酶液，在25℃酶解120分钟。取碳酸钙2克、氯化钠3克、氯化铵3克溶于100毫升去离子水中得无机营养液，向酶解后的白果粉中加入4.8克制备的无机营养液，混合均匀后在121℃灭菌20分钟，得固态发酵培养基。
(4)向制备的固态发酵培养基中接种1克制备的紫红曲霉种子液，在25℃发酵20天。
发酵结束后发酵物经冷冻干燥后得白果粉红曲霉发酵产品，取样测定银杏酚酸、MPN、MPNG、银杏黄酮、银杏萜内酯、Monaconlin K、红曲色素、红曲多糖、γ-氨基丁酸、麦角固醇的含量，与未发酵白果粉相比，银杏酚酸减少95％， MPNG减少94％，MPN减少88％，发酵产品中含银杏黄酮0.64mg/g、银杏萜内酯1.71mg/g、Monaconlin K 2.25mg/g、红曲色素色价621U/g、红曲多糖49 mg/g、γ-氨基丁酸0.363mg/g、麦角固醇3.68mg/g。
动物实验表明该发酵产品具有调节血脂、血糖和血压、抗氧化、抗辐射、抗肿瘤和抗疲劳的功效，可以用作制备具有调节血脂、血糖和血压、抗氧化、抗辐射、抗肿瘤和抗疲劳的保健食品或药品的原料或配料。
试验例1
摇瓶装料量对红曲霉降解白果致敏致毒成分的影响，结果如表1所示。
其中采用实施例1的方法，只是在步骤(3)100毫升三角瓶中分别装入6、 8、10、12、15、20克的20～30目白果粉，考察摇瓶装料量对红曲霉降解白果致敏致毒成分的影响，试验编号为1-6，结果如表1所示。
对比例为100毫升三角瓶装10克20～30目白果粉，经同样处理，但是不接种红曲霉种子液。
表1.摇瓶装料量对红曲霉降解白果致敏致毒成分的影响
由表2可以看出，摇瓶装料量对红曲霉降解白果致敏致毒成分影响显著。当装料量较少时，培养基中的可利用碳源、氮源不能满足菌株生长所需，因而红曲霉长势不好，其菌体内可降解银杏酚酸、MPN和MPNG的酶量少，从而降解率低。当装料量为10时，红曲霉生长最好，因而降解率也是最高。但是，装料量进一步增加，影响了氧气、营养物质的传递，进而影响了红曲霉的生长，导致降解率下降。对比例中没有接种红曲霉，因为降解率非常低，银杏酚酸、MPNG 的微量降解可能是培养基高温灭菌造成的。所以100毫升三角瓶中装入10克的白果粉为最佳摇瓶装料量。
试验例2
无机盐组合对红曲霉降解白果致敏致毒成分的影响，结果如表2所示。
其中采用实施例1的方法，只是在步骤(3)中将硫酸镁1克与磷酸二氢钾 2克(编号1)分别置换为硫酸镁1克与碳酸钙2克、硫酸镁1克与氯化钠2克、磷酸二氢钾1克与碳酸钙2克、磷酸二氢钾1克与氯化钠2克、碳酸钙1克与氯化钠2克(编号2-5)，考察无机盐组合对红曲霉降解白果致敏致毒成分的影响，试验编号为1-6，结果如表2所示。对比例按实施例2同样操作，但是步骤(3) 不加无机盐。
表2.无机盐组合对红曲霉降解白果致敏致毒成分的影响
由表2可以看出无机盐组合对红曲霉降解白果致敏致毒成分的影响显著，最佳组合为硫酸镁1克与磷酸二氢钾2克，其次为硫酸镁1克与碳酸钙2克，最差的为碳酸钙1克与氯化钠2克组合。与对比例相比，添加无机盐的试验组对致敏致毒成分的降解能力都比不添加的要好。致敏致毒成分的降解需要依靠红曲霉菌体分泌的酶进行催化，添加无机盐降解效果好，主要有两个原因：第一，添加的无机盐可以作为致敏致毒成分降解酶的激活剂，从而导致降解效果好；第二，致敏致毒成分降解酶可能是金属酶，无机盐的加入正好可以作为降解酶的辅因子，从而导致降解效果好。
试验例3
无机氮源对红曲霉降解白果致敏致毒成分的影响，结果如表3所示。
其中采用实施例1的方法，只是在步骤(3)中将氯化铵3克(编号1)分别置换为硫酸铵3克(编号2)、硝酸钠3克(编号3)，考察无机氮源对红曲霉降解白果致敏致毒成分的影响，试验编号1-3，结果如表3所示。对比例按实施例3同样操作，但是步骤(3)不加无机氮源。
表3.无机氮源对红曲霉降解白果致敏致毒成分的影响
由表3可以看出无机氮源对红曲霉降解白果致敏致毒成分的影响显著，最佳的无机氮源为氯化铵，其次为硫酸铵，硝酸铵最差。与对比例相比，添加氯化铵、硫酸铵组队对致敏致毒成分的降解效果要好，主要是因为氯化铵、硫酸铵等为快速利用氮源，可以与有机氮源配合，促进红曲霉的生长，从而有利于红曲霉对致敏致毒成分的降解。添加硝酸钠组其降解效果甚至低于不加无机氮源的对比例组，这说明硝酸钠作为慢速利用氮源不能被红曲霉利用，而且，硝酸钠对红曲霉的生长存在较为明显的抑制作用。
试验例4
测试本发明实施例1-3中所得发酵产品中致敏致毒成分降解率及功能成分含量，结果如表4所示。
其中，对比例1采用实施例1相同的操作方法，但是步骤4不接种种子液。
对比例2采用实施例2相同的操作方法，但是步骤4不接种种子液。
对比例3采用实施例3相同的操作方法，但是步骤4不接种种子液。
表4发酵产品中致敏致毒成分降解率及功能成分含量
将实施例组与对比组进行比较，由表4可以明显地看出：(1)红曲霉发酵可以显著地降解白果中的银杏酚酸、MPN和MPNG，从而降低白果的致敏致毒性，对比例组没有接种红曲霉，因而致敏致毒成分降解很少；(2)红曲霉发酵在降低白果致敏致毒成分的同时，分泌产生了许多功能性次级代谢产物如Monaconlin K、红曲色素、红曲多糖、γ-氨基丁酸、麦角固醇，赋予白果新的保健功能，对比例组没有接种红曲霉，因而没有产生红曲霉次级代谢产物。
Claims (10)
1.一种利用红曲霉发酵降解白果致敏致毒成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)白果粉的制备：将去外种皮的白果干燥后，去骨质中种皮及膜质内种皮，得干燥的白果果仁，粉碎后得白果粉；
(2)红曲霉种子液的制备：取步骤(1)制备的白果粉，配制白果粉葡萄糖琼脂固体培养基，灭菌后备用；将红曲霉接种到白果粉葡萄糖琼脂固体培养基，连续活化培养；用无菌水将活化的红曲霉斜面孢子洗涤下来转入无菌容器中打散孢子团，制备孢子悬液；配制白果粉葡萄糖液体培养基，灭菌后接入孢子悬液，培养制备红曲霉种子液；
(3)白果粉固态发酵培养基的制备：取α-淀粉酶、糖化酶、木瓜蛋白酶用去离子水配制成混合酶液；取步骤(1)制备的白果粉，向其中加入混合酶液，酶解；取无机盐、无机氮源溶于去离子水中得无机营养液，取无机营养液加入酶解后的白果粉中，混合均匀后灭菌得到白果粉固态发酵培养基；
(4)白果粉红曲霉固态发酵：向步骤(3)制备的白果粉固态发酵培养基中加入步骤(2)制备的红曲霉种子液，进行固态发酵；发酵结束后，发酵物经干燥后白果粉红曲霉发酵产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述白果粉粒径为20-60目。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述白果粉葡萄糖琼脂固体培养基配方为：白果粉2～3克，葡萄糖1.5～2克，琼脂1.5～2克，去离子水100毫升；所述的白果粉葡萄糖液体培养基配方为：白果粉3～5克，葡萄糖2～3克，去离子水100毫升。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的孢子悬液浓度为1～5×108cfu/mL，孢子悬液接种量为白果粉葡萄糖液体培养基体积的5～10％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述取步骤(1)制备的白果粉为100毫升容器中优选装入6-20克白果粉。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的混合酶液每毫升中含20～50Uα-淀粉酶、300～700U糖化酶和6000～14000U木瓜蛋白酶，混合酶液加入量为白果粉重量的20～40％，酶解温度为25～37℃，酶解时间为30～120分钟。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的无机盐为硫酸镁、碳酸钙、氯化钠、磷酸二氢钾中的一种或多种，无机氮源为氯化铵、硫酸铵和硝酸钠中的一种或多种，无机营养液中无机盐的浓度为质量分数1.5～5％、无机氮源浓度为质量分数1～3％，无机营养液添加量为白果粉重量的10～20％。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的红曲霉种子液添加量为固态培养基重量的1～10％，发酵温度25～32℃，发酵时间8～20天。
9.一种权利要求1所述的利用红曲霉发酵降解白果致敏致毒成分的方法所制备的银杏酚酸、MPN、MPNG含量显著降低的红曲霉固态发酵白果粉。
10.一种权利要求9所述的红曲霉固态发酵白果粉在制备具有调节血脂、血糖和血压、抗氧化、抗辐射、抗肿瘤和抗疲劳的保健食品或药品的原料或配料中的应用。
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