CN109362574A - 一种刺槐组织培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种刺槐组织培养方法，该方法通过对MS基础培养基进行改进，采用GS培养基中的大量元素，同时去除MS的大量元素，改良MS培养基中的无机盐浓度和配比，合并组成基础培养基后，可以有效的提高不定芽诱导率，并且培养出来的组培苗成活率高，栽培后生长旺盛，生长势强。

Description

一种刺槐组织培养方法
技术领域
本发明涉及组织培养技术领域，具体涉及一种刺槐组织培养方法。
背景技术
刺槐最适宜山区造林绿化，不仅是矿柱、枕木、车船、农具等重要用材来源，而且是良好的蜜源植物。其耐旱、适应性强、生长快、繁殖易、用途广，是重要的速生用材树种之一，是我国西北、华北等地区优良的保持水土、防风固沙、改良土壤和″四旁″绿化树种。刺槐树对二氧化硫、光化学烟雾等具有一定抗性，并且外形树冠高达、叶色鲜绿素雅而芳香，是园艺中最佳的树种；此外刺槐树的木材坚硬、耐水湿，具有很高的经济价值；并且刺槐耐盐碱，将其作为盐碱地的种植植被，能够使得盐碱地林业生态功能得以提升，并且通过选育耐盐刺槐树种造林，能够有效的改善盐碱地生态功能。因此，刺槐的需求量也越来越高。
由于刺槐组培的研究较少，对其研究还处于初级阶段，因此在组培过程中出现的各种问题需要通过不断摸索才能成功，在试验过程中发明人发现，将常规的MS作为基础培养基，在接种后，不定芽诱导率较低，并且在生根过程中发现虽然生根，但是根系较少，成活率虽然不低，但是移栽后生长不旺盛的现象。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明提供一种刺槐组织培养方法，该方法通过对培养基进行改进，提高了不定芽诱导率，培养出来的组培苗成活率高，栽培后生长旺盛，生长势强。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种刺槐组织培养方法，所述方法包括如下步骤：
(1)外植体的选择及消毒处理：以幼嫩的刺槐茎尖为外植体，用自来水冲洗干净后放入75％酒精中30～45s，无菌水冲洗2～3遍后，用0.1％的HgCl2浸泡灭菌4～6min，再用无菌水冲洗2～3遍备用；
(2)接种培养：将经过步骤(1)消毒处理的外植体接种到接种培养基中，所述接种培养基为GS的大量元素+去除大量元素的MS+2，4-D0.5～1mg/L+6-BA 2.5～5mg/L+GA30.025～0.05mg/L+蔗糖3.5％+琼脂0.4％，每瓶只接一段外植体，培养2～3天开始生长，每30天接转一次；
(3)生根培养：将经过继代培养的分化芽转移到生根培养基上诱导生根，25～30天开始生根，当根生长到3em左右出瓶；所述生根培养基为：GS的大量元素+去除大量元素的MS+IAA0.6～0.8mg/l+蔗糖3.0％+活性炭0.1％。
其中，接种培养的条件为：pH值为5.8，培养温度为24～28℃，光照强度1400～2000lx，光照时间为12～14小时/天。
生根培养的培养条件为：pH值为5.8，温度为22～25℃，光照强度2600～28001x，光照时间为12～14小时/天。
进一步地，上述刺槐组织培养方法，还包括组培苗移栽，具体如下：出瓶前练苗一周，先将培养瓶移至温室，自然条件下炼苗1～2d，然后解开封口膜，炼苗4～6d，炼苗完成后取出小苗洗净根部附着的培养基，用多菌灵或百菌清1000倍液清洗并浸泡幼苗根部，然后移栽到经消毒的基质中，温度控制在24-26℃，湿度控制在70％左右，14d以后逐渐降低湿度，直至将移栽苗置于自然条件下，炼苗移栽期间要遮光，使光照强度为自然光的40～60％。
优选地，所述栽培基质为泥炭土和珍珠岩混合基质，两者以3∶1的体积比混合。
本发明方法具有如下优点：
发明人对培养基进行了改进，对于在试验中出现的问题，申请人对MS基础培养基进行了改进，引入GS培养基，并且仅采用其大量元素，同时去除MS的大量元素，改良MS培养基中的无机盐浓度和配比，合并组成基础培养基后，可以有效的提高不定芽诱导率，并且培养出来的组培苗成活率高，栽培后生长旺盛，生长势强。
本发明通过摸索一系列合理的培养基配方和培养条件，实现了使刺槐有效繁殖的目的，组培苗生产整齐一致，为其快速繁殖提供了有效的支持，也为进一步探索刺槐的基因工程、拓宽外植体材料等奠定了基础。并且还为实现规模化工业生产成为可能，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是本发明不同基础培养基第6天愈伤组织分化情况对比；
图2是不同基础培养基第35天时不定芽的分化情况对比；
图3是本发明刺槐的生根情况；
图4本发明刺槐的移栽生长情况。
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种刺槐组织培养方法，所述方法包括如下步骤：
(1)外植体的选择及消毒处理：以幼嫩的刺槐茎尖为外植体，用自来水冲洗干净后放入75％酒精中30s，无菌水冲洗2遍后，用0.1％的HgCl2浸泡灭菌4min，再用无菌水冲洗2遍备用；
(2)接种培养：将经过步骤(1)消毒处理的外植体接种到接种培养基中，所述接种培养基为GS的大量元素+去除大量元素的MS+2，4-D 0.5mg/L+6-BA 2.5mg/L+GA3 0.05mg/L+蔗糖3.5％+琼脂0.4％，每瓶只接一段外植体，培养2～3天开始生长，每30天接转一次；
(3)生根培养：将经过继代培养的分化芽转移到生根培养基上诱导生根，25天开始生根，当根生长到3cm左右出瓶；所述生根培养基为：GS的大量元素+去除大量元素的MS+IAA0.6mg/l+蔗糖3.0％+活性炭0.1％。
(4)组培苗移栽，出瓶前练苗一周，先将培养瓶移至温室，自然条件下炼苗1d，然后解开封口膜，炼苗6d，炼苗完成后取出小苗洗净根部附着的培养基，用多菌灵或百菌清1000倍液清洗并浸泡幼苗根部，然后移栽到经消毒的基质中，温度控制在24℃，湿度控制在70％左右，14d以后逐渐降低湿度，直至将移栽苗置于自然条件下，炼苗移栽期间要遮光，使光照强度为自然光的40％。
实施例2
一种刺槐组织培养方法，所述方法包括如下步骤：
(1)外植体的选择及消毒处理：以幼嫩的刺槐茎尖为外植体，用自来水冲洗干净后放入75％酒精中40s，无菌水冲洗3遍后，用0.1％的HgCl2浸泡灭菌6min，再用无菌水冲洗2遍备用；
(2)接种培养：将经过步骤(1)消毒处理的外植体接种到接种培养基中，所述接种培养基为GS的大量元素+去除大量元素的MS+2，4-D 1mg/L+6-BA 2.5mg/L+GA3 0.025mg/L+蔗糖3.5％+琼脂0.4％，每瓶只接一段外植体，培养2～3天开始生长，每30天接转一次；
(3)生根培养：将经过继代培养的分化芽转移到生根培养基上诱导生根，30天开始生根，当根生长到3cm左右出瓶；所述生根培养基为：GS的大量元素+去除大量元素的MS+IAA0.8mg/1+蔗糖3.0％+活性炭0.1％。
(4)组培苗移栽，出瓶前练苗一周，先将培养瓶移至温室，自然条件下炼苗1d，然后解开封口膜，炼苗5d，炼苗完成后取出小苗洗净根部附着的培养基，用多菌灵或百菌清1000倍液清洗并浸泡幼苗根部，然后移栽到经消毒的基质中，温度控制在25℃，湿度控制在70％左右，14d以后逐渐降低湿度，直至将移栽苗置于自然条件下，炼苗移栽期间要遮光，使光照强度为自然光的50％。
实施例3
一种刺槐组织培养方法，所述方法包括如下步骤：
(1)外植体的选择及消毒处理：以幼嫩的刺槐茎尖为外植体，用自来水冲洗干净后放入75％酒精中45s，无菌水冲洗3遍后，用0.1％的HgCl2浸泡灭菌5min，再用无菌水冲洗2遍备用；
(2)接种培养：将经过步骤(1)消毒处理的外植体接种到接种培养基中，所述接种培养基为GS的大量元素+去除大量元素的MS+2，4-D 0.8mg/L+6-BA3.5mg/L+GA3 0.04mg/L+蔗糖3.5％+琼脂0.4％，每瓶只接一段外植体，培养2～3天开始生长，每30天接转一次；
(3)生根培养：将经过继代培养的分化芽转移到生根培养基上诱导生根，25～30天开始生根，当根生长到3cm左右出瓶；所述生根培养基为：GS的大量元素+去除大量元素的MS+IAA0.7mg/l+蔗糖3.0％+活性炭0.1％；
(4)组培苗移栽，出瓶前练苗一周，先将培养瓶移至温室，自然条件下炼苗2d，然后解开封口膜，炼苗6d，炼苗完成后取出小苗洗净根部附着的培养基，用多菌灵或百菌清1000倍液清洗并浸泡幼苗根部，然后移栽到经消毒的基质中，温度控制在26℃，湿度控制在70％左右，14d以后逐渐降低湿度，直至将移栽苗置于自然条件下，炼苗移栽期间要遮光，使光照强度为自然光的60％，移栽后生长状况见图4。
对于本发明所得出来的实施方案，申请人进行了如下试验，具体如下：
1.试验材料
以幼嫩的刺槐茎尖为外植体，分别于2018年1月19日和2018年3月8日在两种培养基上进行愈伤组织诱导。
2.试验方法
用剪刀将幼嫩的茎段剪下，保留茎尖约1.5cm，用自来水冲洗干净后放入75％酒精中30s，无菌水冲洗3遍后，用0.1％的HgCl2浸泡灭菌6min，再用无菌水冲洗3遍备用。接种时去除大的叶片，仅保留幼嫩组织，接在原培养基和改良培养基上。原培养基配方：MS+2，4-D0.5mg/L+6-BA 5mg/L+GA3 0.05mg/L+蔗糖3.5％+琼脂0.4％，pH值5.8。改良培养基(本发明)配方：MS中的大量元素由GS大量元素替代，其他成分与原培养基相同。每瓶接种3-5个外植体，于25+1℃下暗培养，观察愈伤组织的诱导情况，30天后给以12h/d 20001x的光照条件，35天时观察不定芽诱导情况。
基本培养基的确定
采用不同基础培养基，其余添加的培养基成分完全相同，愈伤组织的生长情况见表1。
表1不同基础培养基愈伤组织分化情况对比
在试验中发明，1/2MS、GS培养基不仅产生愈伤组织率比本发明的要低，并且均有不同程度的褐变情况，所以从愈伤组织分化情况来看，可以选择MS培养基和本发明的改良培养基，但从不定芽诱导率来讲，MS、1/2MS、GS培养基均很低，而采用本发明的培养基，结果取得了意想不到的技术效果，产生愈伤组织率达到95.5％，不定芽诱导率也高达64.2％。对比试验过程中的部分图片见图1和图2。
并且在此基础上进一步对未褐变的愈伤组织进一步进行生根试验，结果见表2。
表2不同基础培养基生根情况对比
从表2可以看出，在对未褐变的愈伤组织进行下一步试验时，各种培养基的生根率和根长均差别不是很大。
生根后，从基部慢慢长出主根，之后由主根上发出多条须根，见图3，待根系发育成熟后移植于种植土，于培养箱培养一周后，再将组培苗移栽到大田中，移栽后的生长状况见表3。
表3刺槐在不同培养基上培养后的生长状况
从表3可以看出，后期的大田生长状况进行比较，MS培养基培养出来的组培苗叶片边缘稍微下垂，长势稍差，1/2MS培养基培养出来的组培苗叶片边缘稍微下垂，长势稍差，GS培养基培养出来的组培苗叶片边缘下垂翻卷，长势一般，而采用本发明的培养基培养出来的组培苗叶片正常，茎段粗壮，长势好，并且平均新发叶片数也是最高。
综上，采用本发明的培养基，不仅产生愈伤组织率高，而且不定芽诱导率也高，移栽后的组培苗叶片正常，茎段粗壮，长势好，并且平均新发叶片数也是最高。可见，本发明通过对基础培养基进行改进，可以大大提高刺槐的组培繁殖率。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种刺槐组织培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)外植体的选择及消毒处理：以幼嫩的刺槐茎尖为外植体，用自来水冲洗干净后放入75％酒精中30～45s，无菌水冲洗2～3遍后，用0.1％的HgCl2浸泡灭菌4～6min，再用无菌水冲洗2～3遍备用；
(2)接种培养：将经过步骤(1)消毒处理的外植体接种到接种培养基中，所述接种培养基为GS的大量元素+去除大量元素的MS+2，4-D 0.5～1mg/L+6-BA 2.5～5mg/L+GA3 0.025～0.05mg/L+蔗糖3.5％+琼脂0.4％，每瓶只接一段外植体，培养2～3天开始生长，每30天接转一次；
(3)生根培养：将经过继代培养的分化芽转移到生根培养基上诱导生根，25～30天开始生根，当根生长到3cm左右出瓶；所述生根培养基为：GS的大量元素+去除大量元素的MS+IAA0.6～0.8mg/l+蔗糖3.0％+活性炭0.1％。
2.根据权利要求1所述的刺槐组织培养方法，其特征在于，接种培养的条件为：pH值为5.8，培养温度为24～28℃，光照强度1400～20001x，光照时间为12～14小时/天。
3.根据权利要求1所述的刺槐组织培养方法，其特征在于，生根培养的培养条件为：pH值为5.8，温度为22～25℃，光照强度2600～2800lx，光照时间为12～14小时/天。
4.根据权利要求1所述的刺槐组织培养方法，其特征在于，还包括组培苗移栽，具体如下：出瓶前练苗一周，先将培养瓶移至温室，自然条件下炼苗1～2d，然后解开封口膜，炼苗4～6d，炼苗完成后取出小苗洗净根部附着的培养基，用多菌灵或百菌清1000倍液清洗并浸泡幼苗根部，然后移栽到经消毒的栽培基质中，温度控制在24～26℃，湿度控制在70％左右，14d以后逐渐降低湿度，直至将移栽苗置于自然条件下，炼苗移栽期间要遮光，使光照强度为自然光的40～60％。
5.根据权利要求4所述的刺槐组织培养方法，其特征在于，所述栽培基质为泥炭土和珍珠岩混合基质，两者以3∶1的体积比混合。
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CN106171971A (zh) * 2016-06-27 2016-12-07 中国科学院植物研究所 一种丁香叶忍冬组培快繁的方法

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及华: "刺槐玻璃苗愈伤组织化再生正常植株", 《河北林学院学报》 *

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