CN1093416C - 防治心血管病的植物制剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种防治心血管病的植物制剂的制备方法，以水杉叶为原料，首先是粉碎、浸提；其次是浓缩；第三是加水、过滤；第四是树脂吸附分离；第五是浓缩；第六是干燥；第七是粉碎，包装。本发明方法简单，能耗低，易于工业化生产。本制剂不仅可预防和逆转心脏肥厚，还具有抗心律失常和抗心肌缺血复灌引起的损伤等作用。

Description

防治心血管病的植物制剂的制备方法

本发明涉及一种心血管的植物制剂的制备方法，具体的说，该药物组合物可用于防治心脏肥厚、抗心律失常和心肌缺血复灌引起的损伤心血管疾病。

目前，用于防治心血管疾病的药物种类繁多，化学合成药物由于临床疗效和毒副作用的局限性，均不尽人意，人们热衷于来自天然的植物药。近年来，国内外相继开展古老树种药用有效成分的研究和应用，被称为“活化石”的银杏就是突出的代表。银杏(Ginkgobiloba L.)为银杏科银杏属唯一生存种，是中生代的侏罗纪孑遗植物，也是我国特有的古老树种之一。银杏果、叶、树皮和根均可药用，在我国已有近千年的药用历史。鉴于该植物具有独特的生理作用和临床治疗价值，促使银杏提取物(EGb)及其制剂成为近代国际国内研究开发的热点。银杏叶的成分十分复杂，主要含有黄酮类化合物和萜内酯有效成分，在治疗心脑血管疾病，增加冠状动脉血流量，以及治疗脑缺血、脑老化、老年痴呆症、哮喘等有独特疗效。60年代末，原联邦德国开发出银杏叶制剂梯波宁(Tebonin)，主要含有黄酮类化合物，能有效地改善脑血管和末梢血管血液循环，长期服用几乎无副作用。70年代起，银杏制剂在欧洲一直盛销不衰，在法国和德国的药物销售中，银杏叶制剂销售额一直名列前矛。80年代发展迅猛，不断将银杏叶的开发应用研究推向新高潮。银杏叶提取物不仅用于药品，还用于保健食品，护肤化妆品等。

近十年来，我国也对银杏进行了开发研究，目前市场上销售的银杏叶制剂有10多种，生产银杏提取物的约有200多厂家，银杏制剂成为我国药业重要产业之一。目前国内银杏制剂有天保宁片和胶囊，主要含银杏总黄酮甙，由浙江康恩贝制药公司生产；银可络主要含黄酮与萜类成分；达纳康主要含黄酮甙、萜内酯成分，由博福—益普生(天津)制药有限公司生产，银杏口服液，由辽阳辽河制药厂生产。

银杏叶提取物的生产工艺，国内外均有一系列专利，主要有溶剂生产工艺和树脂生产工艺。经检索未发现一种从水杉叶中提取药物的组合物的制备方法被公开。

本发明的目的是提供了一种对心血管系统疾病的预防、治疗作用显著，毒性低的药物组合物，从水杉叶中提取的甙类成分除可制备各种制剂外，尚可用予药品和保健食品。

本发明的目的还在于利用国内大量生产、价格便宜的药材来代替依赖进口、价格昂贵的药材作为制备所述植物制剂的原料。

本发明的目的尚在利用成本低、工艺简单、能耗低、生产纯度高、水溶性好、宜于工业化生产的制备方法。

为达到上述目的，本发明通过以下技术措施来达到：一种防治心血管病的植物制剂的制备方法，通过研究，各种制剂的药理显示，水杉叶中提取物有较强防治心脏肥厚等药理作用的活性成分，主要是黄酮类化合物，从水杉叶中提取的黄酮甙：主要是槲皮素-3-鼠李糖(槲皮甙)、山奈素-3-鼠李糖甙、杨梅黄素-3-鼠李糖甙、木樨草素-7-葡萄糖甙、芹菜黄素-7-葡萄糖甙，如结构式I，为黄酮甙的活性成分之一。

             槲皮甙(Quercitrin)

本发明还提供了制备含黄酮甙，槲皮素-3-鼠李糖甙(槲皮甙)、山奈素-3-鼠李糖甙、杨梅黄素-3-鼠李糖甙、木樨草素-7-葡萄糖甙、芹菜黄素-7-葡萄糖甙的植物制剂的制备方法，其包括下述步骤，以水杉叶为原料，首先粉碎浸提，将水杉叶干燥，稍加粉碎为粗粉，用一定浓度的乙醇加热提取，浸提时控制一定温度和时间，提取完毕，稍冷却，趁热抽滤；其次是浓缩，将乙醇提取液控制在一定的温度和真空度减压浓缩，回收乙醇至稀浸膏；第三是加水、抽滤；滤渣再用水热提，过滤，浓缩，干燥，粉碎。第四是大孔吸附树脂分离，将水提液上大孔吸附树脂柱，先用水冲洗树脂柱至液体为无糖反应，再用不同浓度的乙醇解吸至无黄酮体反应，最后再用水冲洗至无醇；第五是浓缩，将乙醇洗脱液控制在一定的温度和真空范围减压浓缩为稠浸膏；第六是干燥，将浸膏趁热倒入不锈钢盘，放入真空干燥器，在一定的温度和压力下干燥，得褐色块状物；第七是粉碎，将褐色块状物粉碎为粉末，即为成品。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1、采用了醇提—树脂法制备工艺，其特点是工艺简单、成本低、收率高、产品纯度高，树脂可再生重复使用，易于工业化生产。

2、水杉为速生性落叶乔木，在我国分布极广，资源丰富。本发明在国内外均首次利用水杉叶片进行新药开发，为水杉的综合利用提供一种新资源。

3、药理研究表明，水杉叶提取物在显示预防和逆转心脏肥厚同时，对肥厚引起的并发症，如心律失常、心肌缺血亦有对抗作用，说明该制剂对心血管药理作用广泛，主治与防治并发症兼而有之，具综合治疗作用。同时它与目前心脏肥厚的逆转中应用的合成药，如血管紧张素II转换酶抑制剂(卡托普利、依那普利)、钙拮抗剂(维拉帕米、硝苯吡啶)和β-受体阻滞剂(哌唑嗪)作用相当。

4、毒性评价：LD₅₀＝19.13g/kg，相当于成人剂量的1125倍，故几无毒性。

5、制剂为水溶性成分，吸湿性低，应用方便。

水杉叶提取物(FMG)药理实验研究

一、FMG对心脏肥厚的作用

(一)对L-甲状腺素所致大鼠心脏肥厚的抑制作用，采用L-甲状腺素(1mg·kg^-1·d^-1·ip×8d)诱发的大鼠心脏肥厚模型。

方法：wistar大鼠40只，雌雄兼用，体重228±35g，随机分为5组，即肥厚对照组(生理盐水2ml·kg^-1·d^-1·ip)，阳性药物对照组(普萘洛尔Proparnolol 10mg·kg^-1·d^-1·ip)、FMG低高剂量组分别以FMG5、10mg·kg^-1·d^-1·ip，正常对照组五个处理组。持续给药8天。

结果表明：

1、对心脏重量参数的影响：

与正常对照组比肥厚对照组心重/体重，左室重/体重，分别增加47％、32％；与肥厚对照组相比，FMG低、高剂量组、阳性对照组分别使心重/体重降低15％、21％、29％；而使左室重/体重分别降15％、19％、21％。

2、对心肌纤维直径的影响

与正常对照组比肥厚对照组心肌纤维直径增加53％；与肥厚对照组相比，FMG低、高剂量组、阳性对照组分别使心脏纤维直径降低22％、23％、23％。

3、对心室蛋白质及RNA含量的影响。

与正常对照组相比肥厚对照组的心室蛋白质和RNA含量增加44％、10％；与肥厚组相比，FMG低、高剂量组、阳性对照组分使蛋白质含量降低21％、25％、19％；，使RNA含量分别降低8.2％、8.9％、5.6％。

4、对心室Na⁺、K⁺-ATP酶及Ca²⁺-ATP酶活性的影响。

与正常对照组相比肥厚对照组的Na⁺、K⁺-ATP酶及Ca²⁺-ATP酶活性增加82.1％、81.7％；与肥厚对照组相比，FMG低、高剂量组及阳性对照组分别使Na⁺、K⁺-ATP酶活性降低31％、42％、46％，使Ca²⁺-ATP酶活性降低44％、46％、38％。

(二)对肾性高血压大鼠左室肥厚的预防作用。

通过缩窄左肾动脉建立肾性高血压大鼠左室肥厚模型。以Sprague-Dawleg雄性大鼠，体重150-200g。分成四组，阳性药物对照，依那普利(enalapril)6mg·kg^-1·d^-1·ip，FMG组：FMG40mg·kg^-1·d^-1·ip，肥厚对照组和正常对照组均给予等量生理盐水ig，术后第四周起，ig40mg·kg^-1·d^-1持续5周。

结果：与肥厚对照组相比，FMG组大鼠的心重及其心重/体重，左室重及左室重/体重分别下降16.72％、14.36％、19.99％和17.69％；心脏外径、左室壁厚度及两者之比分别下降7.38％、19.51％和12.54％；心肌纤维直径下降19.17％；左心室肌钙离子含量、蛋白质含量与总量分别下降14.09％、8.96％和27.41％；左心室肌胶原含量与总量分别下降27.19％和45.08％。血压仅轻微下降(p＞0.05)。

(三)对腹主动脉缩窄所致大鼠左室肥厚有预防和逆转作用。

通过缩窄腹主动脉建立大鼠左室肥厚模型，研究FMG对其的预防和逆转作用。

Sprague-Dawley雄性大鼠，体重150-200g，预防实验动物于术后1周血压稳定后，随机分四组：FMG组：ig FMG40mg·kg^-1·d^-1；阳性药物对照组：ig依那普利6mg·kg^-1·d^-1；肥厚对照组和正常对照组：均ig等量生理盐水，持续给药5周。逆转实验动物于术后第7周随机分四组：(同前)，持续给药6周。

结果表明：与肥厚对照组，预防和逆转两部分实验FMG组大鼠的心重、心重/体重、左室重和左室重/体重明显缩小，预防实验部分缩小15.62％、14.50％、17.78％和16.61％，逆转实验缩小20.53％、21.17％、24.03％和24.63％；对心肌纤维直径明显缩小，预防和逆转实验分别缩小18.31％和18.99％；对左心室肌蛋白质含量和总量，预防和逆转部分实验分别下降23.89％和28.02％；对左心室肌钙离子的含量明显降低，预防和逆转实验分别降低13.69％和13.46％。

(四)对容量超负荷大鼠心肌肥厚的预防作用。

通过腹腔动-静脉造瘘术建立大鼠容量超负荷心肌肥厚模型。研究FMG对其的预防作用。

雄性SD大鼠，体重180-220g，随机分成6个组，阳性对照组：ig卡托普利(Captopril)50mg·kg^-1·d^-1，FMG组是：高、中、低剂量组：ig400、40、4mg·kg^-1·d^-1，肥厚对照和正常对照组均给予等量的ig生理盐水。术后给予不同剂量的FMGig，持续5周。

结果表明：

1、与肥厚对照组相比，FMG高、中、低剂量组心重/体重分别下降21.42％、17.14％和4.53％，而左室重/体重分别下降16.62％、9.94％和1.67％。

2、与肥厚对照组相比，FMG高、中、低剂量组心室RNA含量分别下降29.84％、26.24％和4.30％；蛋白质含量分别降低23.96％、14.88％和7.10％。

3、与肥厚对照组相比，FMG高、中、低剂量组心室肌细胞内Ca²⁺浓度分别下降24.51％、20.63％和3.37％。

4、与肥厚对照组相比，FMG高、中、低剂量组心室Ang(血管紧张素II)含量分别降低28.48％、13.29％和5.30％。

5、与肥厚对照组相比，FMG高、中、低剂量组心室MDA(丙二醛)含量分别减少26.34％、17.63％和4.63％。

6、SOD活性分别增高67.10％、53.63％和15.93％。

7、大鼠腹腔动-静脉造瘘术前0.5h给予不同剂量的FMG ig，术后4小时取心脏标本，免疫组化SP法测定大鼠心室C-FOS蛋白质的含量。结果：与动、静脉瘘组相比，FMG高、中、低剂量组心室C-FOS蛋白质表达分别下降48.89％、33.58％和10.12％。

结论：

1、FMG可预防容量超负荷大鼠心肌肥厚的形成，并具一定剂量依赖关系；

2、可降低容量超负荷大鼠心室局部AngII含量和心室肌细胞内Ca²⁺浓度，抑制心室C-FOS蛋白质的表达，可能是其作用机制；

3、可增加心肌SOD活性，减少心肌MDA含量，可能促进其预防心肌肥厚的作用。

二、对多种实验性心律失常模型的作用。

(一)对乌头碱所致大鼠心律失常的影响：

SD大鼠13只，雌雄兼用，体重200±20g，FMG：10mg·kg^-1·ig，乌头碱19ug·kg^-1，对照组：生理盐水2ml·kg^-1·ig。

结果表明：FMG能推迟乌头碱诱发的大鼠心律失常的出现时间(p＜0.01)，并缩短心律失常持续时间(p＜0.01)。

(二)对氯化钙诱发大鼠心律失常的影响:

SD大鼠13只，雌雄兼用，体重274±30g，FMG10mg·kg^-1·ig，4％氯化钙，设生理盐水对照组。

结果表明：FMG能提高氯化钙诱发大鼠心律失常的阈剂量(p＜0.01)。

(三)对哇巴因诱发豚鼠心律失常的影响：

豚鼠14只，雌雄兼用，体重274±40g，FMG10mg·kg^-1·ig，哇巴因30mg·L^-1，设生理盐水对照组。

结果表明：FMG能增加致豚鼠室早、室颤及心电活动停止所需的哇巴因用量。

(四)对大鼠心肌缺血复灌性心律失常的影响：

SD大鼠14只，雌雄兼用，体重225±20g。随机分成两组，给药组(FMG10mg·kg^-1)、对照组(2ml·kg^-1生理盐水)。

结果表明：FMG能缩短复灌后心律失常持续时间(p＜0.01)，减少复灌后心室纤颤的发生(p＜0.05)。

结论：FMG具有广泛的抗心律失常作用，能对抗乌头碱、氯化钙、哇巴因及大鼠心肌缺血复灌所致多种类型的室性心律失常。

三、对离体豚鼠工作心脏缺血再灌注损伤的影响。

采用离体豚鼠工作心脏缺血再灌注损伤模型。豚鼠21只，体重375±30g，雌雄兼用。

结果表明：1、FMG0.5mg/ml剂量下能使缺血再灌注心脏的AP(主动脉压)，LVSP(左室收缩压)，+dp/dt_max(左室内最大上升速率)、-dp/dt_max(左室内最大下降速率)、AF(主动脉流量)、CF(冠脉流量)、CO(心输出量)及HR(心率)分别恢复到缺血前的76％、71％、79％、82％、79％、84％、80％、78％(p均＜0.01)；

2、抑制再灌注损伤心脏LVEDP(左室舒张末期压)的升高(p＜0.01)，改善缺血再灌注损伤心肌的舒缩功能；

3、提高缺血再灌注损伤心肌SOD的活性(p＜0.01)，降低MDA含量(p＜0.01)，抑制细胞膜脂质过氧化。减少冠脉流动液中CK(肌酸激酶)、LDH(乳酸脱氢酶)的漏出(p均＜0.01)。

四、对豚鼠心室肌细胞膜离子通道的影响。

应用双酶酶解法分离单个豚鼠心室肌细胞，利用膜片钳全细胞记录技术，研究FMG对心室肌细胞膜离子通道的影响。

豚鼠350±50g，雌雄兼用。

FMG灌流浓度为20、40、80ug/ml，分别灌注5min，L-型钙电流的峰值电流分别下降21％(p＜0.05)、40％(p＜0.01)、57％(p＜0.01)，但不影响L-型钙电流的反转电位和激流电位。FMG 80ug/ml和较长时间灌流(10分钟)，对I_KI、I_Na基本无影响(p均＜0.05)。

结果表明：FMG对心室肌细胞L-型钙通道具阻滞作用，且呈浓度依赖性。

五、水杉叶提取物(FMG)急性毒性试验。

取昆明种小鼠100只，随机分为5组(每组20只，雌雄各半)FMG给药剂量分别为11.47g/kg、14.34g/kg、17.92g/kg、22.49g/kg、28g/kg，按小鼠体重每10g，灌胃0.2ml，给药后连续观察7天，记录动物毒性反应情况和死亡分布。

      FMG毒性试验结果按Bliss法计算LD₅₀

剂量(g/kg)	对数剂量x	r	n	p	yem	Y	nw	y	nwx	nwy
											11.47	1.00	0	20	0	-	3.1	3.1	2.66	3.286	8.241
14.34	1.16	4	20	0.2	4.16	3.9	8.1	4.19	9.364	33.939
											17.92	1.25	6	20	0.3	4.48	4.8	12.5	4.49	15.625	56.125
22.40	1.35	15	20	0.75	5.67	5.7	10.6	5.67	14.310	60.102
											28.00	1.45	19	20	0.95	6.64	6.5	5.4	6.63	1.830	35.802

LD₅₀＝19.13g/kg

LD₅₀的可信限17.70-20.67g/kg(p＝0.95)

FMG剂量及毒性：

根据以上急毒实验结果，250g大鼠的有效剂量为10mg/kg，按70kg成人的相应用药剂量为1.70mg/kg

用药量为1.70×70＝119mg/人/d，有效剂量按50倍剂量则为5950mg/人/d

按小鼠半数致死量测定结果：FMG19.13g/kg

∴半数致死量与成人的有效量的关系：

                    19.13/0.017≌1125倍

半数致死量是成人有效量的1125倍。

实施例：

采用水杉叶片为原料，其步骤是：

第一步粉碎后浸提，一是称取经干燥粉碎为3-10目的水杉叶粗粉200g；二是将粗粉放入2L圆底烧瓶；三是浸提，加入40-80°的食用乙醇1L-1.5L，在常压下加热提取2-4小时，温度控制在45-75℃，浸提结束后，稍冷却，抽滤，得乙醇提取液；四是残渣加入40-80°食用乙醇0.8-1L，继续按上述方法操作，重复两次。三次滤液合并为1.8-2.5L。

第二步是浓缩，将乙醇提取液经输液管不断地输入薄膜浓缩器，控制温度在45-70℃、真空度在450-550mmHg，减压浓缩，回收乙醇至小体积，得挥去乙醇浸膏200g。

第三步是加水、抽滤，将稀浸膏加1-3倍蒸馏水，搅拌均匀，抽滤，分去残渣，得褐色澄清水提液0.4-0.6L。残渣加蒸馏水0.4-0.6L煮沸三次，趁热过滤，水提液合并、浓缩、干燥、粉碎，得深褐色粉末2g，得率为1％，含黄酮甙20-30％(分光光度法测定)。

第四步是树脂吸附分离，一是用250-300g(AB-8型大孔吸附树脂、天津南开大学生产)经酸、碱、乙醇和水处理过的大孔树脂，按一定量湿法上层析柱，装入直经为4.5cm的层析柱内，先用水平衡；二是将上述0.4-0.6L褐色澄清水提液倒入层析柱上端，从上往下顺树脂柱流，逐步吸附，同时打开柱塞，以3-8ml/min的流速让水提液通过树脂柱，直至柱下端，使树脂将水提液全部吸附；三是加水冲洗，逐步用1.5-2.5L水液洗脱单糖、多糖等水溶性杂质，并用斐林溶液(Terling溶液)检查流出液呈糖的阴性反应为止；四是用70°乙醇解吸，首先用1.8-2L70°乙醇冲洗树脂柱，流速均为3-8ml/min，用1％AlCl₃乙醇溶液检查流出液呈黄酮体阴性反应；五是用95°乙醇继续冲洗树脂柱，逐步用1-2.5L95°乙醇冲洗至流出液为无色，用1％AlCl₃乙醇溶液检查流出液呈黄酮体阴性反应；六是用2-3L的水冲洗树脂柱至无醇，收集乙醇洗脱液，此柱的树脂已再生，可继续用于相同植物成分的分离。

第五步是浓缩。将乙醇洗脱液控制温度在45-70℃、真空度在450-550mmHg，减压浓缩至稠浸膏，趁热倒在不锈钢盘上。

第六步是干燥，将上述装有浸膏的不锈钢盘放入真空干燥器内，控制温度在60-70℃烘干后为褐色块状物。

第七步是粉碎，将褐色块状物粉碎为40-60目的粉末22g，得率11％，含黄酮甙20-45％(分光光度法测定)。

Claims (6)

1、一种防治心血管病的植物制剂的制备方法，以水杉叶为原料，步骤是：

A、粉碎、浸提，将水杉叶干燥，粉碎为粗粉，以食用乙醇加热浸提，浸提时控制一定温度、时间，抽滤；

B、浓缩，将乙醇提取液输入薄膜浓缩器，控制温度和真空度在一定范围内，减压浓缩至稀浸膏；

C、加水、过滤，将稀浸膏加一定量水液，搅拌均匀，抽滤除去残渣，得褐色澄清水提液，残渣加水煮沸，趁热过滤、浓缩、干燥、粉碎；

D、树脂吸附分离，用经酸、碱、醇、水处理过的大孔吸附树脂，按一定量湿法上层析柱，先用水平衡，再将褐色澄清水提液倒入柱上端，从上往下顺树脂柱流，逐步吸附；用一定量的水洗树脂柱，除去单糖、多糖等杂质，用斐林溶液检查糖呈阴性反应后，再用乙醇解吸，并用1％AlCl₃乙醇溶液检查黄酮体呈阴性反应，最后再用水冲洗树脂柱至无醇味，收集乙醇洗脱液；

E、浓缩，将乙醇洗脱液，控制温度和真空度在一定范围内，减压浓缩至稠浸膏，趁热倒入不锈钢盘；

F、干燥，将装有浸膏的不锈钢盘放入真空干燥器内，控制温度和真空度在一定范围内，得褐色块状物；

G、粉碎，将褐色块状物粉碎为粉末，包装。

2、根据权利要求1所述的一种防治心血管病的植物制剂的制备方法，其特征是将干燥的水杉叶粉碎为3-10目的粗粉，提取时加入4-7倍40-80°的食用乙醇，温度控制在45-70℃。

3、根据权利要求1所述的一种防治心血管病的植物制剂的制备方法，其特征是将乙醇提取液输入薄膜浓缩器，控制温度45-70℃，真空度在450-550mmHg。

4、根据权利要求1所述的一种防治心血管病的植物制剂的制备方法，其特征是浸膏加1-3倍水，残渣加0.4-0.6L水，煮沸三次。

5、根据权利要求1所述的一种防治心血管病的植物制剂的制备方法，其特征是树脂吸附分离，用70°乙醇解吸，用1.8-2L 70°乙醇冲洗树脂柱，再用95°乙醇冲洗树脂柱，逐步用1-2.5L95°乙醇冲洗至流出液为无色。

6、根据权利要求1所述的一种防治心血管病的植物制剂的制备方法，其特征是乙醇洗脱液，控制温度在45-70℃，真空度在450-550mmHg。