CN1093407A

CN1093407A - 糖羧酸的制备

Info

Publication number: CN1093407A
Application number: CN93114961A
Authority: CN
Inventors: 石黑敏弘; 冈正秀; 山口高正; 野上昱雄
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1992-11-27
Filing date: 1993-11-26
Publication date: 1994-10-12
Also published as: CA2110111C; PH30166A; DE69334174D1; US5434061A; ES2292403T3; EP0599646A2; ATE224450T1; EP0599646A3; ATE374257T1; NZ250284A; DE69332301D1; AU5194893A; US5635611A; US5629411A; EP1111065A3; EP0599646B1; DE69334174T2; AU666234B2; CA2110111A1; US5635610A

Abstract

一种糖羧酸及其盐的产生方法，其特征在于属于假葡萄糖杆菌属的能氧化羟甲基和/或半缩醛羟基碳原子为羧基的微生物或由此微生物制得的细胞制品作用于含羟甲基和/或半缩醛羟基的糖或糖衍生物以产生及积累相应的羧酸以及获取这些羧酸，和通过以上方法得到的新的糖羧酸。通过本方法，高选择性高产率地从许多糖产生带有羧基(由羟甲基和/或半缩醛羟基氧化而来)的糖酸，生成的糖酸具有抗酶降解及增加水溶性及其它特点。

Description

本发明是关于新的糖羧酸及其盐（下文有时将简称为糖羧酸，包括盐在内）和产生新的糖羧酸化合物的方法。更准确地说，本发明是关于利用假葡糖杆菌属（Pseudogluconobacter）的菌株或由此而来的细胞制品，高效地将相应的含伯羟基（羟甲基）的糖转化成羧酸的生产方法，通过氧化相应糖的羟甲基生成羧基而生成的新的糖羧酸，利用假葡糖杆菌属的菌株或由此而来的细胞制品氧化相应的含半缩醛羟基的糖的连有半缩醛羟基的碳原子产生糖羧酸的方法，及相应糖的半缩醛羟基连接碳至少有一个被氧化成羧基而形成的新的糖羧酸。

可以催化氧化羟甲基形成羧基的微生物酶，已知的有源自醋杆菌属（Acetobacter）〔Agric.Biol.Chem.42，2331（1978）〕、葡糖杆菌属（Gluconobacter）〔Agric.Biol.Chem.42，2045（1978）〕或假单孢菌属（Pseudomonas）〔Biochem.J.，223，921（1984）〕的乙醇脱氢酶，源自甲醇细菌等微生物〔Agric.Biol.Chem.54，3123（1990）〕的甲醇脱氢酶等。但这些酶具有高度的底物专一性，至今仍没有报道表明这些酶可以作用于除了象甲醇和乙醇等醇类之外的底物。

同时，一些微生物可以作用于糖，象D-山梨醇、L-山梨糖等（这些糖在后文中统称为山梨糖），催化氧化羟甲基形成羧基，如已知的来自葡糖杆菌属菌株的山梨醇脱氢酶〔Agric.Biol.Chem.46.135（1982）〕、山梨糖脱氢酶[Agric.Biol.Chem.55，363（1991）]和葡萄糖脱氢酶[Agric.Biol.Chem.44，1505（1980）]。但这些酶都具有高度的底物专一性;缺少多方面适应性。另外已发明的一些从土壤中分离到并命名为糖酮化假葡糖杆菌属（Pseudogl uonobacter.saccharoketogenes）的细菌可以利用D-葡萄糖或其它类似底物产生实质量的2-酮-L-古洛糖酸（后文中有时以2KG^A代表）（日本专利公开S-62-228228和公开S-64-85088）和2-酮-D-葡糖二酸（日本专利公开S-62-228287）。

提及多糖，例如葡聚糖，这是一个统称，它代表利用肠系膜状明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）和其它微生物由蔗糖产生的许多主要含α-1→6键的高分子葡聚糖，并试图进行各种化学修饰。但是通过任何常规的化学反应，很难获得高度位点选择性的目的产物，大量副产物的形成是不可避免的。因为许多多糖包括葡聚糖在内。都分别由许多分子量不同的高分子同系物组成，化学修饰时伴随的副反应产生各种复杂的副产物，而这些产物的结构通常是不一致的（Biotransformations in Preparative Organic Chemistry：H.G.Davis等，Academic Press）。

具体地，试用了氧化剂如次氯酸钠、次溴酸钠、氯、溴、碘等对葡聚糖进行化学氧化，但产物的结构还没有阐明清楚，或者推测的结构还没有完全证实。关于葡聚糖的化学氧化，相关的公开可以在Patel等（日本专利公开S-61-233001、欧州专利公开NO.0150085）中找到。

如前所述，由于底物专一性，利用微生物氧化含羟甲基糖和其它化合物被严格限制在单糖或类似物的范围内。而且如上文所述，对糖的半缩醛羟基和羟甲基部分的化学氧化，尤其是对寡糖和多糖，都伴随着副反应，不可避免地需要一套复杂的纯化工艺。因此确实需要具有更好的选择性和收率的氧化技术。本发明的目的就是提供一种产生糖酸，即糖羧酸的方法，它包括利用对广泛底物具有位点专一性的微生物高收率、高选择性地氧化至少一个羟甲基和/或一个半缩醛羟基连接的碳原子，最终产生许多有工业和社会用途的产品。

附图的简要说明

图1，实施例5中得到的混合物中葡糖醛酸类甜菊糖醇甙的HPLC图谱（示差折光检测）。

图2，实施例6中得到的混合物中葡糖醛酸类甜菊糖醇甙的HPLC图谱（示差折光检测）。

图3，实施例7中得到的葡糖醛酸类甜菊甙钠盐的HPLC图谱（示差折光检测）。

图4，实施例8中得到的葡糖醛酸类甜菊甙二钠盐的HPLC图谱（示差折光检测）。

图5，实施例10中得到的甜菊甙-A的一当量氧化产物的HPLC图谱（示差折光检测）。

图6，实施例10中得到的混合物中葡糖醛酸甜菊糖醇甙的HPLC图谱（示差折光检测）。

图7，实施例4中得到6-O-（2-羧乙基）-β-环糊精钠盐和6，6-二-O-（2-羧乙基）-β-环糊精的¹³C-NMR谱（270MHz，D₂O）（ppm）。

图8.实施例4中得到6-O-α-D-葡糖醛酸基-（14）-α-D-葡糖基-α-环糊精的C-NMR谱（270MHzD₂O）（ppm）。

图9.实施例4中得到的6-O-α-D-葡糖醛酸基-β-环糊精的¹³C-NRM谱（270 MHz，D₂O）（ppm）。

图10.实施例4中得到的6-O-（2-羧基-2-羟乙基）-β-环糊精钠盐和6，6-二-O-（2-羧基-2-羟乙基）-β-环糊精钠盐的¹³C-NMR谱（270HMz，D₂O）（8ppm）。

图11.用α-淀粉酶作6-O-α-D-葡糖醛酸基（14）-α-D-葡糖基-β-环糊精钠盐（附图说明为G2-β-CyDCOONa）的稳定性试验（时间坐标对%残留量），对照为6-O-α-麦芽糖基-β-环糊精（附图说明：G2-β-CyD）。

图12.使用葡糖糖化酶做6-O-α-D-葡糖醛酸基（14）-α-D-葡糖基-β-环糊精钠盐（附图说明：G2-β-CyDCOONa）的稳定性试验（时间坐标对%残留量），对照为-6-O-α-麦芽糖基-β-环糊精（附图说明：G2-β-CyD）。

图13.使用支链淀粉酶做6-O-α-D-葡糖醛酸基（14）-α-D-葡糖基-β-环糊精钠盐（附图说明：G2-β-CyDCOONa）的稳定性试验（时间坐标对%残留量），对照为6-O-α-麦芽糖基-β-环糊精（附图说明：G2-β-CyD）。

图14.使用葡糖苷酸酶做6-O-α-D-葡糖醛酸基（14）-α-D-葡糖基-β-环糊精钠盐（附图说明：G2-β-CyDCOONa）的稳定性试验（时间坐标对%残留量），对照为6-O-α-麦芽糖基-β-环糊精（附图说明：G2-β-CyD）。

为了达到上述目的，经过对微生物领域的深入探索之后，本发明的发明者发现糖酮化假葡糖杆菌可以容易地、高产地、高选择性地氧化广谱的含羟甲基（CH₂OH）和/或半缩醛羟基的糖及其糖衍生物，令人惊奇的是，这些微生物在底物专一性上非常宽松。因而它们是具有明显的多方面适应性的细菌。本发明以上述发现为基础发展来的。

本发明是指：

1）产生糖羧酸或其盐的方法，它包括具有氧化羟甲基和/或半缩醛羟基连接的碳原子生成羧基的能力，属于假葡糖杆菌属的微生物或由此而来的细胞制品作用于含有羟甲基和/或半缩醛羟基的单糖衍生物、寡聚糖、寡聚糖衍生物、多糖或多糖衍生物，形成和积累相应的羧酸并获得该羧酸，和

2）相应的糖或糖衍生物的羟甲基和/或半缩醛羟基至少有一个被氧化成羧基而形成的新的糖羧酸。

本发明所应用的假葡糖杆菌属的微生物可以是该属的任何一株能氧化糖的羟甲基和/或半缩醛羟基碳原子的菌株，包括对该菌进行传统的诱变处理如化学诱变剂亚硝基胍、紫外线、放射线、基因工程等而得到的突变株。特别是指糖酮化假葡糖杆菌的菌株，下列在欧州专利申请（EPA）221，707中描述过的菌株作为典型例子。

O 糖酮化假葡糖杆菌

K591S：FERM BP-1130，IFO 14464

O 糖酮化假葡糖杆菌

12-5：FERM BP-1129，IFO 14465

O 糖酮化假葡糖杆菌

TH14-86：FERM BP-1128，IFO 14466

O 糖酮化假葡糖杆菌

12-5：FERM BP-1132，IFO 14482

O 糖酮化假葡糖杆菌

TH12-4：FERM BP-1131，IFO-14483

O 糖酮化假葡糖杆菌

22-3：FERM BP-1133，IFO-11484

在本发明的方法中，假葡糖杆菌属的任何菌株的细胞及由它们而来的任何细胞制品都可同样得以应用。上面提到的细胞制品例如可以是菌株的培养液。也可以应用该微生物产生的酶系统。但就假葡糖杆菌属而言，酶通常分泌在胞内。因此有利于使微生物细胞作用于底物糖产生相应的羧酸。使用休止细胞尤为合适。这些细胞或该微生物的培养液的制备可用例如日本专利公开S-64-85088中描述的方法。

因此，斜面培养物传到种子培养物和主培养物中以制备发酵培养液。如有必要，离心发酵液，收集沉淀，并用盐水洗涤数次。经过洗涤的沉淀可接着用于氧化反应。该微生物可在含有可利用的营养物质的液体培养基中好气培养，培养基包括碳源（碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、淀粉等或蛋白胨、酵母膏等有机物）、氮源（无机和有机含氮物质如铵盐、尿素、谷物浸出液、蛋白胨等）、无机盐（磷酸盐、硫代硫酸盐和其它钾、钠、钙、镁、铁、锰、钴、铜盐等）以及微量营养物，如维生素和象辅酶A（COA）、泛酸、生物素、胸腺嘧啶、核黄素、FMN（黄素单核苷酸）等一类的辅酶，氨基酸如L-半胱氨酸、L-谷氨酸等及含这些氨基酸的天然产物。这样得到的培养液可直接用于本发明的方法中。培养可在PH4～9间进行，优选PH为6～8。

培养时间决定于采用的微生物菌株，培养基成份和其它条件，但优选10～100小时。合适的培养温度为10℃～40℃，优选25℃～35℃。在培养基中添加稀土金属可以提高目的产物的产量。添加到培养基中的稀土金属包括钪（SC）、钇（Y）、镧（La）、铈（Ce）、镨（Pr）、钕（Nd）、钷（Pm）、钐（Sm）、铕（Eu）、钆（Gd）、铽（Tb）、镝（Dy）、钬（Ho）、铒（Er）、铥（Tm）、镱（Yb）和镥（Lu）。这些稀土金属可以分别以片状或氯化物、碳酸盐、硫酸盐、硝酸盐、氧化物或草酸盐的形式批量加入。这些元素可以单独使用或联合使用，例如碳酸铈和氯化镧。而且在分离纯化过程中得到的这些元素的粗品也同样可以使用。加入培养基的稀土元素的量应选自不影响所用的微生物生长的范围内，一般为0.000001-0.1%（W/V），优选在0.001～0.05%（W/V）之间。关于这些元素添加到培养基中的方法，一般可以在培养过程中间歇加入或连续加入。

在实施本发明时，准备氧化的底物糖可以溶解或悬浮于水或水相溶溶剂如乙醇、丙酮，聚乙二醇或类似物中，形成的溶液或悬浊液与微生物接触。溶剂应选择合适的量，以不阻滞反应。因此合适的底物浓度一般在0.1～20%（W/V），优选为1～5%（W/V）。本发明的微生物氧化反应的适宜温度范围在10℃～40℃，优选为25℃～35℃。本反应优选在好气条件下进行，例如通气量在0.1-5升/分钟，必要时加以50～2000转/分的搅拌。反应时间取决于底物糖的伯羟基和/或半缩醛羟基的性质，但应在5分钟到三天之间，一般为1～24小时。这些氧化反应优选在持续控制的PH条件下进行。推荐PH的范围在4～9之间，为了得到较好的效果，PH控制在6～8之间。任何不影响该反应的碱都可以用于控制PH值。例如无机盐如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钙、氢氧化镁、氢氧化铁等及象吗啉代基乙磺酸钠和吗啉代基乙磺酸钙等有机盐都可以使用。必要时为了选择性地控制反应，可以加入阴离子交换树脂到反应体系中，而不必使用碱金属盐等中和剂。阴离子交换树脂的加入特别适用于控制该氧化反应选择性形成一当量氧化产物。用于此目的阴离子交换树脂可以是任何一种吸收羧酸产物的阴离子交换树脂。特别优选的阴离子交换树脂为苯乙烯和丙烯酸树脂系列。例如Amberlite（Organo Co.的商标）IRA-400、IRA-401、IRA-402、IRA-410、IRA-900、IRA-910、IRA-35、IRA-68、IRA-94S等，和Diaion（Mitsubishi Kasei的商标）SA-10A、SA-20A、PA-306、PA-308、PA-406、WA-10、WA-11、WA-20、WA-30等都可以使用。

当反应体系中的底物糖（含羟甲基和/或半缩醛羟基的单糖衍生物、寡糖、寡糖衍生物、多糖、多糖衍生物）消失时，停止搅拌，从反应混合物中将阴离子交换树脂分离出来。接着用适当的洗脱液将目的产物从树脂上洗脱下来。例如洗脱剂可以是氯化钠和碱金属盐等的水溶液，或盐酸、硫酸、磷酸、柠檬酸等各种酸的水溶液。通过已知的或类似的分离流程，可将产物糖羧酸从产生的洗脱液中分离纯化出来。

例举其一个或多个伯羟基（羟甲基）可被氧化形成相应的糖羧酸的糖，可提及的有单糖衍生物如D-葡萄糖、D-果糖、D-半乳糖、D-核糖、D-甘露糖、L-山梨糖等〔例如氨基糖如D-葡萄糖胺、N-乙酰-D-葡萄糖胺、N-乙酰壳二糖，三-N-乙酰壳三糖等，与抗坏血酸相关的化合物如糖基-L-抗坏血酸、L-抗坏血酸等，与核酸相关的化合物如肌苷、腺苷、尿苷、鸟苷、胞苷、胸苷、2-脱氧肌苷、2-脱氧腺苷、2-脱氧尿苷、2-脱氧鸟苷、2-脱氧胞苷、2-脱氧胸苷等〕，寡糖如链脲佐菌素、蔗糖、乳糖、Palat-inose、棉子糖、乳糖苷蔗糖、葡糖苷蔗糖、半乳糖苷蔗糖、木糖等，淀粉糖如麦芽三糖、麦芽四糖、异麦芽三糖、6-α-葡糖基麦芽糖、麦芽酚等，氨基糖如有效霉素A，纤维素寡糖类如纤维二糖、纤维三糖、纤维六糖等，甜菊糖醇甙如甜菊甙、甜菊甙-A、甜菊甙-C、甜菊甙-D、甜菊甙-E、卫茅醇甙-A、rubusoside〔下式（Ⅱ）的化合物，其中R₁＝β-Glc，R₂＝-β-Glc〕等，寡糖衍生物如mogrosides等，及多糖和它们的衍生物如环糊精、可溶性淀粉、糊精、葡聚糖、β-1，3-葡聚糖等。

下文将不时描述寡糖和多糖衍生物包括通过本发明的方法已将连有寡糖和多糖半缩醛羟基的碳原子氧化为羧基的糖酸。

可以通过本发明的方法专一性氧化其半缩醛羟基片断的多糖包括葡聚糖、纤维素、几丁质、直链淀粉、支链淀粉、麦芽三糖、6-α-葡糖基麦芽糖、异麦芽糖、纤维二糖、乳糖、麦芽糖等。

在从这些糖得到的糖羧酸中，下列产物是新化合物：

Palatinose的羟甲基至少有一个被氧化成羧基而形成的糖羧酸及其盐;

蔗糖的羟甲基至少有一个被氧化成羧基而形成的糖羧酸及其盐;D-海藻糖的羟甲基至少有一个被氧化成羧基而形成的糖羧酸及其盐;麦芽糖-β-环糊精的羟甲基至少有一个被氧化成羧基而形成的糖羧酸及其盐;

2-O-α-D-吡喃型葡糖基-L-抗坏血酸的羟甲基至少有一个被氧化成羧基而形成的糖羧基及其盐;

链脲佐菌素的羟甲基至少有一个被氧化成羧基而形成的糖羧酸及其盐;

庚酮糖的羟甲基至少有一个被氧化成羧基而形成的糖羧酸及其盐;

式（Ⅰ）的麦芽糖糊精的羟甲基至少有一个被氧化成羧基而形成的糖羧酸及其盐;

（n＝0-30）

式（Ⅱ）的甜菊糖醇甙的羟甲基至少有一个被氧化成羧基而形成的糖羧酸及其盐;

式（Ⅲ）的有效霉素A的羟甲基至少有一个被氧化成羧基而形成的糖羧酸及其盐;

（R＝CH₂OH）

mogroside的羟甲基至少有一个被氧化成羧基而形成的糖羧酸及其盐;

葡聚糖的羟甲基被氧化成羧基而形成的式（Ⅷ）的糖羧酸〔例如葡聚糖基葡糖醛酸（又称葡糖醛酸基葡聚糖或葡聚糖-葡糖醛酸）〕及其盐或与金属盐形成配位化合物或络合物（下文将简称为络合物）;

（其中n＝1-50，优选为10-15）

葡聚糖基葡糖醛酸（也称葡聚糖-葡糖醛酸）的半缩醛羟基所连碳原子被氧化成羧基而形成的式（Ⅸ）的糖羧酸〔例如葡糖醛酸基葡聚糖基葡糖醛酸〕及其盐或与金属盐的络合物都是有工业价值的新化合物。

（其中n＝1-50，优选10-15）

在使用所述的假葡糖杆菌属的微生物或由此获得的细胞制品氧化这些底物糖时，糖的氧化是位置选择的和根据糖的伯羟基或半缩醛羟基的数目和性质以逐级方式进行的，结果得到相应高度专一性的糖酸，这也是利用假葡糖杆菌属的菌株及其细胞制品进行的氧化反应的一个特点。

当目的产物可以容易地被分离时，假葡糖杆菌属的微生物可以培养在含有底物糖的培养基中。培养条件可与上文提及的制备培养液的培养条件相同。

这样产生和积累的糖羧酸可通过已知或与其类似的流程进行分离纯化。例如目的产物的分离和纯化可以通过过滤、离心、活性碳或吸附剂处理、溶媒萃取、层析、沉淀或盐析等方法，这些方法可以单独使用，也可以适当地组合使用。

当上述阴离子交换树脂存在下进行氧化反应时，通过倾析、离心或其它方法将树脂从反应混合物中分离出来，然后使用适当的洗脱剂进行洗脱。收集产生的富含目的产物的流份，进行上述的分离流程或分离纯化流程。

产生葡聚糖羧酸和铁盐的络合物一般可以用产生葡聚糖-铁盐络合物的已知方法或其它类似的方法。例如，可以通过葡聚糖羧酸与铁盐溶胶象氢氧化铁溶胶反应来产生。将葡聚糖羧酸加入到不含盐的纯氢氧化铁溶胶中，同时调整混合物的PH值为8.0-10之间，加热条件例如高压灭菌锅加热100℃～120℃计30分钟，可以较好地形成一胶体溶液或悬浮液。

利用这一方法，通过生成铁盐、螯合作用/水合作用等步骤，可以形成葡聚糖羧酸-铁盐络合物。如下文所述，在水中这种铁盐络合物的溶胶悬液中铁元素的含量大约为50～250mg/ml（在溶液基础上），必要时可通过蒸发、浓缩或其它类似的方法由贫铁络合物生成富铁络合物。这种富铁铁盐络合物可在长时间保持稳定，而且在水中很稳定地保持其溶胶状态是该络合物一个特别的特征。

最终的葡聚糖羧酸-铁盐（例如：氢氧化铁）络合物可用注射用蒸馏水、生理盐水或其它类似物稀释，然后给动物非肠道使用。另外，用药用稀释剂或赋形剂、通过本领域已知的制药流程进行配制，制成片剂、粉剂、粒剂、胶囊、乳剂、溶液、预混物、糖浆等，用于口服使用。而且这些药剂或其在载体中的分散体可用作饮料或饮用水的添加剂。再者，必要时用药用稀释剂或赋形剂配制每种物质，再临时稀释这种配制物制成单位剂量，混合于饮料和饮用水中给药。另外，这些独立的制剂可或通过同一途径或不同途径单独给药或同时给药或交叉给药。

根据本发明，每一种糖羧酸都能得到游离化合物或其盐。当然通过本领域已知方法，当得到游离酸时可转化成盐，当得到盐时可转化为游离酸或不同的盐。也可以在培养基内加入铁，碱金属例如锂、钠、钾等或碱土金属如镁、钙等，当产生和积累糖羧酸时就能转化成相应的盐。终产物可通过常规技术如元素分析、熔点测定、旋光测定、红外光谱、NMR谱、色谱等来鉴定。

根据本发明得到糖羧酸被证明具有独特的性质，可应用于广泛的

相应的葡糖醛酸形式的甜菊糖醇甙衍生物都是不同的新化合物，而且发现每一种化合物都具有增强的、强烈的、浓郁的甜味。它们有希望作为具有低热量的特点和抗龋齿作用的高甜度食品原料，同时这些化合物和传统甜味剂一样，在甜食、非酒精饮料、泡菜、冷饮中有抗酶能力。而且因为这些化合物具有改善的溶解度、低毒性和易于分解和降解的特点，它们能够改善药物的味道，因此可作为矫味剂。例如，它们可被掺在片剂、粉剂或其它制剂中。从β-麦芽糖基-β-环糊精衍生而来的糖羧酸是环糊精系列首次出现的糖羧酸，具有水溶性明显提高（溶解度＞200g/100ml，H₂O，25℃）的特点。因此，象前列腺素、类固醇、巴比妥酸等溶解性差的药物，可用β-环糊精衍生出来的糖羧酸处理，产物的水溶性有所提高，可作为注射剂。为了实现笼形化的目的，这些糖羧酸可以已知的笼形化物质同样的方式应用。由蔗糖衍生而来的β-果糖基-（21）-α-D-葡糖醛酸和α-D-葡糖醛酸基-（12）-β-D-6-果糖酮酸，都是没有甜味的新的蔗糖衍生物，并发现它们能抗葡糖苷酶、果胶酶、葡糖苷酸酶和蔗糖酶的降解。和蔗糖相比，它们对酶的敏感性低。因此，这些化合物作为难消化，低热量的蔗糖衍生物是很有价值的，可加在甜食、蛋糕、冷饮等中。它们的钙、镁和铁盐可用作相应的金属离子吸收的改进剂。因此，这些化合物可加在饼干、蛋糕、无酒精饮料中，作为防止骨质疏松症的食品和饮料。

而且通过氧化Palatinose而得到β-D-果糖基-（61）-α-D-葡糖醛酸和α-D-葡糖醛酸基-（61）-α-D-果糖酮酸可用作难消化、低热量的抗龋齿剂。因此象普通的甜味剂和调味剂一样，这些化合物也可以同样方式用于各种食品，如口香糖和其它食品。还有从D-海藻糖衍生而来的α-D-葡糖醛酸基-（11）-α-D-葡糖醛酸作为抗体制剂难消化湿润剂或稳定剂是有价值的。同时可通过氧化D-葡糖糖胺而得到的β-氨基-α-脱氧-D-葡糖醛酸可作为一种高效保湿的化妆品基质。

同时，在通过氧化肌苷和其它核苷而得到的酸中，特别是5′-羧基肌苷和5′-羧基腺苷作为一种调味品对改进香味的特性和抗酶解稳定性有使用价值。这些衍生物可用作食品和调味品的配料，尤其是作为可保存食品的调味剂。

而且通过氧化2，7-脱水-β-D-阿卓庚酮糖得到的1-羧基-2，7-脱水-β-D-阿卓庚酮糖带有柔和的甜味，还可用作饼干和其它甜食、无酒精饮料等中的铁、钙、镁的增溶剂。从链脲佐菌素衍生而来的糖羧酸可用作抗酶的抗癌药。而且通过研究这些化合物的抗微生物活性发现，这些衍生物或经过适当稀释可用于医院病房、手和足等的消毒和灭菌。由mogroside衍生的糖羧酸作为高甜味剂用于无酒精饮料和甜食等是很有价值的。

氧化麦芽糖糊精而得到的糖羧酸可作为难消化、低能食品原料，以本领域已知的方式添加到甜食、糕点和冷饮等中。

还有可通过氧化葡聚糖的羟甲基生成的羧基而得到的葡聚糖基葡糖醛酸不仅可以类似葡聚糖作为药物添加剂，而且比葡聚糖更稳定和更有效，作为氢氧化铁溶胶溶液的稳定剂表现出优良特性。另外，氧化葡聚糖其葡糖醛酸的羟甲基形成羧基或氧化葡聚糖基葡糖醛酸的半缩醛羟基连接碳形成羧基可得到葡糖醛酸基葡聚糖基葡糖醛酸及其盐，这些化合物和葡聚糖一样可用作制药基质和食物的保粘剂。金属盐与葡聚糖基葡糖醛酸或葡糖醛酸基葡聚糖基葡糖醛酸及其盐形成络合物，这些金属盐包括一价、二价、三价金属盐如钙、镁、铁、钠、锂、钾盐等。其中尤其是与铁化合物如氢氧化铁形成的络合物、与葡聚糖-铁复合药物一样可作为铁的补充剂用于缺铁性贫血的补血药。

有效霉素A为上文所示的式（Ⅲ）的化合物，它对水稻的鞘疫病的致病微生物有杀真菌活性。因为预期根据本发明得到的有效霉素A的氧化产物对致病微生物的葡糖苷酶有抗性，所以它可作为长效的有效霉素A衍生物用作农用杀真菌长效药物。由抗坏血酸衍生而来的糖羧酸也对酶的降解有较高的抗性，因此发现可作为抗酶解的抗氧化剂得以应用。和抗坏血酸一样，该糖羧能作为抗氧化剂掺入到含铁食品中。

这样根据本发明，通过氧化各种糖的羟甲基和/或半缩醛羟基连接的碳原子而制得的糖羧酸具有各种底物糖所没有的特性，并且发现了前所未有的用途。

与含有羟甲基的底物糖相比，通过氧化至少一个羟甲基生成羧基而衍生出来的本发明的糖羧酸具有更高的酶解稳定性和水溶性，同时，必要时可以转变成金属盐。因此，在食品领域里，它们有望用作难消化、低能量的节食物质或促进金属吸收的制剂。令人特别惊奇的是，由甜菊糖醇甙（甜菊甙、甜菊甙A、C、D、E、rubusoside等）衍生而来的糖羧酸要比蔗糖甜100-250倍，具有香味而没有底物甜菊甙、rubusoside等的苦味和令人不快的余味，因而有价值用作不供能的甜味剂。

通过氧化环糊精的羟甲基衍生而来的本发明的糖羧酸具有非常有用的特点如高溶解度、低毒性、良好的分解和降解性。可用于脂溶性药物、脂肪酸、碱性药物等的笼形化。因为笼形化提高了溶解性和稳定性并改善了活性成分的味道，所以本产品可用作矫正剂。特别是它能用作如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、粒剂、软膏、注射液、糖浆、悬液、滴鼻剂等药物制剂的功能改善基质。

本发明能够广谱地氧化糖的羟甲基形成羧基，因此可以产生许多新的糖羧酸。

而且根据本发明，通过氧化至少一个半缩醛羟基连接的碳原子形成羧基而得到的糖羧酸与含有半缩醛羟基的底物相比，具有更高的酶解稳定性和水溶性，而且必要时它们可以转化成金属盐，在食品领域中，它们有希望用作难消化、低供能节食物质或促进金属吸收。在制药领域里，利用它们对活性成份的稳定作用和低的酶降解性，用于肠道制剂。

根据本发明，通过氧化广谱的糖的羟甲基和/或半缩醛羟基连接的碳原子生成游离羧基，可以高选择性和高产率地产生糖羧酸。最终的羧酸对酶具有高稳定性而且提高了其水溶性，这只是提到了一些明显的特点。

下面的实施例将更详细地描述本发明，但本发明的适用范围并不局限于这些例子。

实施例1

β-D-果糖基-（21）-α-D-葡糖醛酸钠的制备

一个菌环量的糖酮化假葡糖杆菌TH14-86从斜面培养物接种到含有下述培养基（20ml）的200ml的滑壁摇瓶中，在旋转摇床上30℃预培养一天。接着，每20ml培养基加入1ml培养物30℃振荡培养20天作为种子培养物。同时，一菌环量的巨大芽孢杆菌12108（Bacillus megaterium 12108）从斜面接种到含有下述培养基（20ml）的200ml滑壁摇瓶中，30℃振荡培养两天。

然后按下述条件进行罐发酵。上述的100ml TH14-86的种子培养物（种子培养基）和1.5ml巨大芽孢杆菌的种子培养基被加到下述的发酵培养基中，30℃振荡培养20小时以生产糖酮化假葡糖杆菌TH-14-86的细胞悬液。

细胞反应：

向-5升Biot发酵罐加入200ml无菌水和30g蔗糖配·成的溶液，接着加入1l上述细胞悬液和800ml无菌水，最后总体积为2升。32℃进行培养，通气量为1l/min，800rpm搅拌，随着反应的进行通过自动装置滴加10%的NaOH，以控制反应体系的PH值为6.3。底物在两小时内转化成单羧酸。

分离和纯化：

两升上述反应混合物经8000rpm离心去除细胞，上清液通过装有活性炭（特级shirasagi色谱层析碳，400g）的柱子。用1.2升水冲洗柱子，然后用3升水进行洗脱。收集目的产物流份，减压浓缩产生19.70gβ-D-果糖基-（21）-α-D-葡糖醛酸钠白色粉末。

钠盐：¹³CNMR D₂O（90MHz），δppm：61.39，62.84，71.48，72.42，73.09，73.65，74.65，76.88，82.01，92.70，104.18，176.49.

β-D-果糖基-（21）-α-D-葡糖醛酸镁的制备

1.89gβ-D-果糖基-（21）-α-D-葡糖醛酸钠溶于10ml水中，溶液通过IR-120（H⁺型）柱（50ml）。流出液里加入0.103g氧化镁，搅拌混合物10分钟。然后通过一微孔滤器（GS型，0.22μm）过滤，浓缩滤液。最终的糖浆用乙醇-丙酮处理，产生1.45gβ-D-果糖基-（21）-α-D-葡糖醛酸镁白色粉末。

C₂₄H₃₈O₂₄Mg·6H₂O的元素分析

理论值：C，34.20;H，5.98

实测值：C，34.33;H，5.82

培养基成份：

〔用于TH14-86〕

种子培养基（通用于第一次和第二次培养）

乳糖 1%

酵母膏（Prodivel） 1%

（NH₄）₂SO₄0.3%

谷物浸出液 3%

CaCO₃（优质品） 2%

加CaCO₃之前PH＝7.0

〔用于巨大芽孢杆菌〕

〔种子培养基〕

蔗糖 4%

Proflo〔N源，Tradas Protein（T&P）〕 4%

K₂HPO₄0.65%

KH₂PO₄0.55%

NaCl 0.05%

（NH₄）₂SO₄0.05%

MgSO₄·7H₂O 0.005%

泛酸钙 0.025%

灭菌前PH＝7.0

〔主发酵培养基〕

蔗糖 0.05%

单独灭菌

谷物浸出液 2%

单独灭菌

（NH₄）₂SO₄0.3%

单独灭菌

FeSO₄·7H₂O 0.1%

单独灭菌

维生素B₂1mg/l

灭菌前PH＝7.0

山梨糖 10%

单独灭菌

LaCl₃0.01%

单独灭菌

CaCO₃（优质品） 4%

单独灭菌

实施例2

α-D-葡糖醛酸基-（12）-β-D-6-果糖酮酸的制备

α-D-葡糖醛酸基-（12）-β-D-6-果糖酮酸的钠、镁、钙盐可按实施例1同样的方法制备。

钠盐：白色粉末

¹³C-NMR（D₂O）ppm：61.98，71.96，73.02，73.35，73.69，76.37，77.03，79.82，93.97，105.80，175.03，175.70.

镁盐：白色粉末

C₁₂H₁₆O₁₃Mg·5H₂O的元素分析

理论值：C，29.86;H，5.43

实测值：C，29.76;H，5.51

钙盐：白色粉末

C₁₂H₁₆O₁₃Ca·3H₂O的元素分析

理论值：C，31.17;H，4.80

实测值：C，31.26;H，4.99

实施例3

向1升实施例1所述的糖酮化假葡糖杆菌细胞悬液中加入30g Palatinose和1升无菌水，反应在32℃，800rpm和通气率1.6升/分下进行1小时。反应混合物经8000rpm离心去除细胞，上清液进行活性碳（特级Shirasagi色谱层析碳，400g）柱层析。用水（21）洗柱子，用10%甲醇-水（41）洗脱，再用50%甲醇-水（41）洗脱。收集，浓缩和冷干流份，产生35.8gβ-D-果糖基-（61）-α-D-葡糖醛酸钠。

这种钠盐通过-IR120（H⁺型）柱，浓缩流出液，产生β-D-果糖基-（61）-α-D-葡糖醛酸。

¹³C-NMR（D₂O）ppm∶63.35，68.60，71.78，72.52，72.77，73.45，75.14，75.99，79.53，98.81，102.21，176.93.

C₁₂H₂₀O₁₂·4.5H₂O的元素分析

理论值：C，32.96;H，6.68

实测值：C，33.17;H，5.84

实施例4

利用下列底物化合物（括号内），通过实施例3中所述的同样的步骤可产生相应的糖羧酸。

〔表2〕反应产物目录

化合物¹³C-NMR 其它特征数据

[对照:β-环糊精4mM,

6-O-α-D-葡糖基-

(1→4)-α-D-葡糖基-β-

环糊精 8mM]

6-O-(2-羧基-乙基)- Na盐:¹³C-NMR(270MHz

β-环糊精Na盐和6, D₂O)δppm:

6-二-O-(2-羧乙基)- 谱图示于图7中

β-环糊精Na盐[又名羧基-C信号在181.127,

3-O-(6-环麦芽庚糖基)-丙酸钠] 181.508和185.076ppm

(6-O-(3-羟基-丙基)-

β-环糊精和6,6-二-O-

(3-羧基-丙基)-β-环糊精)

6-O-D-葡糖醛酸基- Na盐:¹³C-NMR(270MHz

(1→4)-α-D-葡糖基- D₂O)δppm:

α-环糊基Na盐谱图示于图8中

[又名6-D-环麦芽庚糖基羧基-C信号在177.105ppm

1-(6→1)-D-α-葡糖基-

(4→1)-O-α-D-

葡糖醛酸钠盐]

(6-O-α-麦芽糖基-

α-环糊精)

[表3] 反应产物目录

化合物分析数据

6-O-α-[D- TCL:硅胶,Merck Kiesel Gel 60(F₂₅₄No 5715)

葡糖醛酸基]-β- 溶剂系统:1-丙醇-乙酸乙脂-H₂O-乙酸(6:4:2:4)

环糊精[又名6-O- 产率64% Rf=0.25,¹³C-NMR(270MHz,D₂Oδppm:

环麦芽庚糖基- 谱图示于图9中:羧基-C信号在178.070ppm

(6→1)-D-α-葡糖醛酸]

(6-O-α-D-葡糖基)-

β-环糊精)

6-O-α-D-[葡糖醛酸基- HPLC:柱,NH2P-50

(1→4)-α-D-葡糖基]- 流动相:乙腈-H₂O=55.45

α-环糊精[又名6-O- 流速:1ml/min产率68%

环麦芽庚糖基-(6→1)-D- 温度:25℃ RT=7.58

α-葡糖基-(4→1)-O-α-D-

葡糖醛酸](6-O-

麦芽糖基-α-环糊精)

6-O-(2-羧基-2-羟乙基)-¹³C-NMR(270MHz,D₂O)δppm:

β-环糊精Na盐[又名2- 谱图示于图10中

羟基-3-O-(6-环麦芽庚糖基)-

丙酸钠盐]和6,6-二-O-(2-

羧基-2-羟乙基)-β-环糊精

Na盐[又名7^A,7^C-二-O-

[α-D-葡糖醛酸基-(1→4)-

O-D-葡糖基]-α-(1→6)-

麦芽庚糖]

(6-O-(2,3-二-羟丙基]-β-

环糊精和6,6-二-O-

(2,3-二-羟丙基)-β-环糊精

实施例5

往5升的Biot发酵罐中装入1升与实施例1中相同的糖酮化假葡糖杆菌的细胞悬液及30g甜菊叶抽提液（主要由甜菊甙组成的甜菊糖醇甙），再加入1升无菌水。此反应体系在32℃，800rpm搅拌并给予1.6升/分钟的通气量的同时，整个反应过程中自动地滴加10%NaOH溶液以控制反应体系的PH为6.3。1.5小时后底物消失，中止反应。2升反应混合物以8000rpm的转速冷冻离心去除细胞，上清液通过HP-2柱（合成芳香吸附剂，Mitsubishi Kasei）（1.8升）。此柱用8升水冲洗，用50%的乙醇（5升）洗脱。洗脱液中含有葡萄糖醛酸型的甜菊糖醇甙混合物。洗脱液经浓缩与冷干，得到19.2g白色粉末。此品具有强的芳香的甜味。

上述产品按以下条件进行HPLC层析：

HPLC柱：ODP

流动相：乙腈-水（3∶7），另加0.1%的三氟乙酸

流速：1.0ml/min

温度：35℃

检测器：RI（示差析光检测）与UV（紫外）

HPLC分析谱（RI检测）见图1

TLC板：硅胶，Merck Kieselgel 60 F₂₅₄No.5715

溶剂系统：CHCl₃∶MeoH∶H₂O（6∶4∶1）

显色试剂：硫酸∶MeoH（1∶1）

温度：110-120℃加热10分钟。

Rf＝2.6

本产品的¹³C-NMR（D₂O）谱可显示出羰基碳的化学位移在177.87（酯）和171.84（COO^-）这说明了羧基的形成。HPLC分析谱显示本产品主要由葡萄糖接于19位的化合物组合而接于甜菊糖醇13位的化合物已被转变为糖醛酸。

实施例6

与实施例5同样的方法，用1升的糖酮化假葡糖杆菌细胞悬液氧化处理30g甜菊叶抽提物，条件是32℃，800rpm搅拌1.6升/分的通气量，滴加完59ml 5%的NaoH溶液（约相当于2个氧化当量）后中止反应。所需氧化时间为21小时。然后将反应混和物经离心去除细胞，纯化上清液（1850ml）（如实施例5），获得13.0g葡萄糖醛酸型的甜菊糖醇甙，钠盐混合物白色粉末，这种产品具有强烈而浓郁的甜味。

HPLC：ODP柱，温度35℃

流动相：乙腈-水（3∶7）另加0.1%的三氟乙酸

流速：1毫升/分钟

HPLC分析谱图（RI检测）见图2。

实施例7

30g甜菊甙用糖酮化假葡糖杆菌按实施例5同样的方法氧化处理。反应时间90分钟，消耗30ml5%的氢氧化钠。反应混合物经纯化得到20g白色粉末。产物也具有强烈而浓郁的甜味。

上述产物的HPLC图谱（RI检测）见图3。400mg本品的白色粉末用一反相ODP-50柱（φ/21.5×300mm，Asashi Kasei）纯化，流动相为水-乙腈（72∶28）及外加0.1%的三氟乙酸;主流份经浓缩冷干得到124mg白色粉末。本品在甲醇-水（9∶1）中重结晶得到无色针状物，m·p·226-230℃（分解）。

IR（KBr）Cm^-1：3500～3250，1715，1605，1080-1010，890。

C₃₈H₅₇O₁₉Na·1.5H₂₀的元素分析：

理论值：C，52.59;H，6.97

实测值：C，52.56;H，7.15

基于上述数据，获得的主要氧化产物是化合物（Ⅱ）的钠盐，其中R₁＝-β-Glc-2-β-Glc，R₂＝-β-GlcUA，即13-O-β-槐糖苷基，19-O-β-D-葡糖醛酸基甜菊糖醇的钠盐，见式（Ⅳ），

实施例8

甜菊甙30g用实施例5的方法用糖酮化假葡糖杆菌氧化处理。反应时间80分钟，消耗67m15%的NaoH。反应物经纯化得到32g白色粉末。产物也具有强烈而浓郁的甜味。其HPLC分析图谱（RI检测）见图4。将1g本品施于HPLC的反相ODP-50柱（φ/21.5×300mm，Asahi Kasei）用2%的乙酸/乙腈梯度，获得0.22g主要氧化产品。本品的次级离子质谱（SI-MS）显示m/z869（M+2H₂₀.H⁺）峰¹³C-NMR（d₆-吡啶）ppm：15.12，18.95，20.21，21.69，

27.78，37.91，37.96，39.33，39.41，40.35，42.12，43.58，43.91，47.23，53.55，56.86，62.57，70.07，71.54，72.49，72.75，75.75，76.16，76.79，76.83，77.51，77.72，77.78，86.00，86.97，95.07，97.60，103.89，103.94，153.50，171.26，171.89，176.23.

基于以上数据，本产物被鉴定为化合物（Ⅱ）的二钠盐其中R₁＝-β-Glc-2-β-GlcUA，R₂＝-β-GlcUA即13-O-〔2-O-（β-葡糖醛酸基）〕-β-D-葡糖基，19-O-β-D-葡糖醛酸基甜菊糖醇二钠盐，见下式（Ⅴ）：

实施例9

同实施例5，往5升的Biot罐中充加30g甜菊甙及1.6升无菌水。此反应体系在32℃下进行800rpm的搅拌及1升/分的通气量，加入20g碳酸钙，反应4小时。21反应混合物经8000rpm离心去除细胞，上清液（1.81）通过HP-20柱（合成芳香吸附剂，Mitsubishi Kasei）。该柱用8l的水冲洗后再用50%的乙醇（5l）洗脱。洗脱液中含有糖醛酸型甜菊甙钙盐。此产品经浓缩与冷干后得到12.98g白色粉末。粉末在甲醇中重结晶得到无色针状品，该品具有柔和的甜味。

¹³C-NMR（d₆-吡啶）ppm：15.93，19.74，20.92，21.00，

28.58，38.66，38.71，40.06，41.04，41.86，42.00，42.91，44.33，48.19，54.50，57.63，73.11，73.30，73.45，73.97，74.08，76.53，77.72，77.86，77.89，78.34，78.39，84.79，86.79，95.84，98.21，105.46，107.02，153.70，171.93，172.18，172.95，176.78.

基于以上数据，该产物被确认为化合物（Ⅱ）的钙盐，其中R₁＝-β-Glc UA-2-β-Glc UA，R₂＝-β-Glc UA，即13-O-〔2-O-β-葡糖醛酸基〕-β-D-葡糖醛酸基，19-O-β-D-葡糖醛酸基甜菊糖醇钙盐，如式（Ⅵ），

实施例10

同实施例5，15.8g的糖酮化假葡糖杆菌细胞与2000ml无菌水混和后，加入10g甜菊甙-A作为底物，反应在32℃，800rpm搅拌并有1.6升/分的通气量条件下进行。反应体系用2%NaoH溶液控制PH值为6.3。消耗3ml的2%NaOH溶液后，中止反应，离心得上清液。反应时间为135分钟。上清液按实施例5的方法纯化，得到10.16g白色粉末。

本产物的HPLC分析图谱（RI检测）见图5。

IR（KBr）Cm^-1：3340，1720，1610，1410，1070

该产物具有强烈而浓郁的甜味。

实施例11

往5升的Biot发酵罐中充加1升与实施例1中所用相同的糖酮化假葡糖杆菌细胞悬液及30g甜菊甙，接着加入1l无菌水及200ml Amberbite IRA-68型树脂（下文简称IRA-68）形成一种反应系统。32℃温度下800rpm搅拌及1.6升/分的空气通过该系统。当2小时后上清液不再显示有甜菊甙时，中止反应，将反应混合物离心，分离IRA-68。将分离出的IRA-68装入一个（φ/4×24Cm）的柱子中，用2l2N-NaCl溶液洗脱。洗脱液通过HP-20柱（0.5l）。此柱用1l的水冲洗，再用0.8l 50%的甲醇-水洗脱。该洗脱液经浓缩至干，得到9.20g白色粉末。此粉末在乙醇-水（9∶1）中重结晶得到无色针状晶体，m·p·226～230℃（分解）。

此产品被确认为13-O-β-槐糖苷基-19-O-β-葡糖醛酸基甜菊糖醇钠盐，即示于实施例7中的（Ⅳ）。

实施例12

同实施例11，往5升的Biot发酵罐中装填1l糖酮化假葡糖杆菌细胞悬液和30g甜菊叶提取液（至少6种不同甜菊糖醇甙的混合物），接着加入1l无菌水和200mlIRA-68。本反应体系在32℃下以800rpm搅拌并导入1.6升/分的空气。2小时后上清液中不显示有甜菊甙时，中止反应，反应混合物离心并分离上清和IRA-68，将此IRA-68装入φ/4×25Cm的柱中，用1l 2N-NaCl溶液洗脱。洗脱液通过HP-20柱（0.5升）。该柱用1l水冲洗，再用1l 50%的甲醇-水洗脱。洗脱液经浓缩至干得到8.9克白色粉末。本品的HPLC分析图谱（RI检测）见图6。

IR（KBr）Cm^-1：3500-3200，1720，1705，1610，1400

实施例13

30g转糖苷化的糖苷〔transglycosylated glycoside（SK Sweet，Sanyo Kokusaku Pulpco.）〕用实施例6中相同方法氧化与纯化后可得到28.3g白色粉末，本品的¹³C-NMR谱（D₂O）在羰基-C区域显示出8个信号（179.50，179.46，179.40，179.37，179.32，179.26，177.10，177.07，ppm），说明至少有一个糖的伯羟基转变为羧基。本品具有浓郁的甜味。

实施例14

同实施例11，200mg mogroside V（存在于Momordica grosvenori中的高甜度糖苷）加入到10ml（相当于0.32g）糖酮化假葡糖杆菌细胞悬液及3毫升水中，接着加入5mlIRA-68。此混合物在30℃下以229rpm搅拌5.5小时。静置反应混合物，并倾析上清液。残留下的IRA-68装柱后用50ml水冲洗。然后用0.01NHCl洗脱。经收集并冷干洗脱液，得到32mg白色粉末。根据其IR数据〔（KBr）Cm^-1：3300，1600，1410，1060-1000〕，可确认葡萄糖链已转变为糖醛酸。本品具有类似蔗糖的甜味。

实施例15

在60ml无菌水中溶解1.0grubusoside，随后加入13ml IRA-68。然后加入30ml实施例1中描述的糖酮化假葡糖杆菌细胞悬液，反应在32℃，600rpm搅拌及60升/分钟的通气量条件下进行，时间为240分钟。从反应混合物中分离出IRA-68并装入柱中，柱子用15ml水冲洗后用200ml2N-NaCl溶液洗脱，SV＝0.5。洗脱液再通过HP-20柱（20ml），该柱用150ml水冲洗后，再用50%甲醇溶液100毫升洗脱，SV＝0.5。洗脱液经浓缩至干后在乙醇中重结晶得到0.48g无色颗粒状结晶。m·p·184-188℃（分解）。C₃₂H₄₇O₁₄Na·5H₂O的元素分析结果：

理论值：C，49.99;H，7.47

实测值：C，50.05;H，7.54

根据以上数据，该产品可被确认为下式（Ⅶ）的化合物。

发现该产品（Ⅶ）为一种类似于纯蔗糖的优质高甜味品，不带苦味。

实施例16

Fursultiamine盐酸盐 10mg

维生素B₂2mg

Taulin 1000mg

苯甲酸 30mg

对羟苯甲酸丁酯 2.5mg

葡糖醛酸型甜菊甙钠盐（Ⅳ） 50mg

柠檬酸 100mg

甘氨酸 500mg

按以上配方通过下述方法配制成一种饮料。对羟苯甲酸丁酯和苯甲酸溶于约30ml70℃的温水中。当溶液的温度降至25℃时，将fursultiamine盐酸盐、维生素B₂、Taulin、葡糖醛酸型甜菊甙（一种甜味剂）、柠檬酸及甘氨酸溶解在溶液中。整个溶液用1N的NaOH将PH值调至3.5，并补加水到50ml。

实施例17

首先，30g碳酸钙沉淀、5g碳酸镁、58.5g乳糖及6g羟脯氨酰基纤维素混匀后，加入30ml水形成颗粒状。形成的颗粒状物经烘干制成粉状。该粉末与0.05g葡糖醛酸型甜菊甙（医用矫味药）及0.5g硬脂酸镁混合后，该混合物经压制成型得到每片200mg重，直径为8.5mm的片剂。

实施例18

往5升的Biot发酵罐中装填1.5l实施例1中描述的糖酮化假葡糖杆菌及30g葡聚糖-4（摩尔分子量4000-6000，Extra Synthese，法国），接着加入1.7l无菌水。反应在32℃、600rpm的搅拌及1.6升/分钟的通气量条件下进行反应，整个反应过程自动滴加0.5%的NaOH溶液以维持反应系统PH值为6.3。反应时间3小时，反应混合物12升经8000rpm冷冻离心去除细胞，得到1.98l上清液此上清液再通过一醋酸纤维素酯膜滤器进一步除去细胞。滤液再通过-IRA-80（OH-型）柱（50ml），此柱用少量的水（100ml）洗涤，得到2l洗脱液。将洗脱液施于HP-20柱（900ml），用21的水洗脱。弃去开始700ml洗脱液，收集接下来的3.3l洗脱液。此部分洗脱液用13.8ml浓盐酸酸化，用纤维素醋酸酯膜（φ/0.2μm）过滤。滤液施于100ml Sephabeads SP205（Mitsubishi Kasei）。该吸附剂用700ml0.05MHCl及21水冲洗，而后用2120%甲醇溶液洗脱。收集适当流份。该流份经减压浓缩得到14g葡聚糖基葡糖醛酸白色粉末。本产品的HPLC分析条件：Asahi Pack GS320柱（φ/7.6×50mm，Asahi kasei），流动相：水，流速：1ml/min;检测：RI（Waters 410）及200nm（Tosoh UV-8020），样品：20μl 0.5%水溶液，结果是在Rt＝8.48处有一单峰（起始葡聚糖的Rt＝10.83）。

为了鉴定此产品的结构，进行了一种酶消化试验。将100μl浓度为4mg/ml的葡糖淀粉酶溶液加入100μl 1.5%的上述产品的水溶液，混合物30℃孵育24小时。酶消化结果可用HPLC进行分析。葡聚糖-4作为对照物也用葡糖淀粉酶处理，结果表明本产品不会被葡糖淀粉酶消化。而葡聚糖-4却被葡糖淀粉酶解，底物消失，生成葡萄糖。基于此结果，本产品可确定为式（Ⅷ）的葡聚糖基葡糖醛酸（其中n＝15）。

实施例19

同实施例1的方法，在蛋白胨酵母（py）培养基（含1%的Bactopetone和1%酵母膏）中培养糖酮化假葡糖杆菌，30℃及PH7.5条件下230rpm摇床培养3天。形成的培养液转入蛋白胨酵母主培养基中并在30℃230rpm摇床培养48小时，同时加入0.1%的氯化钙。形成的培养液在10，000rpm下离心10分钟。用500ml水清洗细胞沉淀物，每升培养液可得7.5g细胞。然后，将30g葡聚糖-4（摩尔分子量为4000～6000，Extra Synthese，法国）溶于1l水中，加入56g湿细胞物在1l水中的悬液。在32℃800rpm搅拌和60ml/min的通气量下，反应6.5小时，同时加入0.1%NaOH溶液调节反应体系的PH为6.3。将反应混合物离心，2l上清液通过一膜过滤器以去除细胞杂质。滤液通过-HP-20柱（900ml），此柱用2000ml水冲洗。流出液用浓盐酸酸化并经膜过滤。滤液施于SP-205柱（100ml），先用1000ml 0.05MHCl洗涤，再用2000ml水冲洗SP-205柱后，用2000ml 20%甲醇洗脱。洗脱液经浓缩冷干后得到14g葡聚糖基葡糖酸白色粉末。本产品的HPLC分析图谱（条件：Asahi Paek GS320）（φ/7.6mm×50mm，Asahi Kasei）;流动相：水，1ml/min;RI（Waters 410）检测，200nm（Tosoh UV-8020）;样品：20μl0.5%水溶液）在Rt＝8.70处显示一单峰。当本产品用葡糖淀粉酶在上述条件下酶解时，它迅速被酶解并产生葡萄糖基葡糖酸。因而本化合物可确定为葡聚糖基葡糖酸。

实施例20

同实施例19的方法，经培养所得50g（湿重）糖酮化假葡糖杆菌细胞加入到30克葡聚糖基葡糖醛酸（按实例18的步骤制备）在1l水中的溶液中，反应在32℃下以800rpm搅拌并导入60ml/min的空气的条件下进行21小时，同时逐步加入0.1%NaOH溶液以控制反应的PH为6.3。反应混合物离心，2升上清液通过膜过滤以进一步去除细胞。滤液施于HP-20柱（900ml），用1.5l水洗脱，洗脱液经浓缩冷干得到12g通式（Ⅸ）的葡糖醛酸基葡聚糖基葡萄糖酸钠盐白色粉末。

HPLC：Rt＝9.12，单峰

HPLC参数及装置：GS-320柱，流动相为水，流速为1ml/min，RI检测，¹³C-NMR（D₂O）δ：179.554，178.119，172.434，其强度比为1∶0.5∶0.5。179.554处的峰归属为葡糖醛酸基部分的羰基-C，其他峰归属为葡糖酸部分的羰基-C（认为有部分内酯化）。

实施例21

50ml50%Fecl₃·6H₂O水溶液加热到30℃后，搅拌下以0.4ml/min速度滴加50ml24%的Na₂CO₃溶液。然后，以3ml/min的速度滴加50ml10%的实施例18中的葡聚糖基葡糖醛酸溶液，并以0.4ml/min的速度逐步加注16%的Na₂CO₃溶液以控制反应系统的PH为4.3。最后，再加入200ml乙醇，充分搅拌混合物以制成浆液。该浆液以5000rpm离心，取沉淀并溶入40ml水中。此溶液经与60ml乙醇充分搅拌，混合物经离心去除可溶性部分。沉淀均匀分散在20ml水中，通过减压蒸发去除乙醇。残余物在剧烈搅拌下，以0.2ml/min的速度加入10%的NaOH溶液，以调PH值至5-6，然后加热至100℃并维持20分钟。最后再加入苯酚直至苯酚终浓度达到4mg/ml，得到22ml葡聚糖基葡糖酸-氢氧化铁溶胶。给小猪肌肉注射1ml本产品可使其贫血症有显著的改善。用同样的方法也可制得葡糖醛酸-葡聚糖基葡糖醛酸-氢氧化铁溶胶，其对小猪的贫血症也显示出明显的改善效果。

实施例22 葡聚糖基葡糖酸-氢氧化铁溶胶的制备

将100gFeCl₃·6H₂O溶于100ml水中并通过Branson B-220超声震动1小时，得到均一的溶液。该溶液加水至200毫升后转到-500ml的烧杯中。在30℃彻底搅拌下，以0.8ml/min的速度加入200ml24%的Na₂CO₃溶液，形成浅黄棕色的氢氧化铁溶胶。

将该氢氧化铁溶胶100ml置于-300ml的烧杯中，30℃并彻底搅拌下，逐渐加入50ml10%的葡聚糖基葡糖酸溶液。然后非常缓慢地以0.1～0.2ml/min的速度加入16%的NaCO₃溶液，以调节PH为4.3。再在搅拌下加入200ml乙醇，生成的沉淀离心回收，并均匀悬浮于80ml水中。向此悬浮液中加入120ml乙醇使之重新沉淀，离心收集沉淀。重复该过程，最后得到的沉淀悬浮于20ml水中。在彻底搅拌下，以0.1～0.2ml/min速度加入10%NaOH溶液直至PH6.0。此溶液在120℃高压釜中加热10分钟，然后加入苯酚（终浓度为1%）作为防腐剂。该溶液经在蒸发器中浓缩得到葡聚糖基葡萄糖酸-氢氧化铁溶胶。该溶胶很稳定，其特征如下。

总铁盐量：200mg/ml，粘度：32CP，导电性：47ms/Cm。

实施例23 葡聚糖基葡糖醛酸到铁盐的渗析转换

将50ml50%的Fecl₃·6H₂₀水溶液加热到30℃。剧烈搅拌下以0.3ml/min速度向此溶液中逐步加入50ml 24%的Na₂CO₃溶液，得到黑棕色的氢氧化铁溶胶（PH1.54）。将该溶胶转入-渗析管中在超纯水中渗析过夜。氢氧化铁溶胶渗析液（约170ml）呈黑棕色，PH值为4.47。

向该氢氧化铁溶胶渗析液中加入50ml10%的葡聚糖基葡糖醛酸（在例18中得到的）水溶液，混合物经彻底搅拌并用16%的Na₂CO₃溶液调PH至4.3。再在100℃高压釜中处理30分钟，然后用10%NaOH溶液将PH调至12。再用高压釜121℃处理20分钟以彻底溶解，得到黑棕色的葡聚糖基葡糖醛酸-氢氧化铁复合物溶液。该复合物溶液用上述渗析方法置渗析管中渗析过夜，然后加入苯酚（使其终浓度达到4mg/ml）得到22ml注射用葡聚糖基葡糖醛酸-氢氧化铁复合物溶胶。该产品是一种稳定的溶胶，具有下列特性。总铁盐浓度：201mg/ml，粘度23.9cp，导电性3.7ms/Cm。

给贫血性小猪肌内注射该品1ml即使其贫血症有明显好转。

也可用上述同样方法制备葡聚糖基葡糖酸-氢氧化铁复合物溶胶，并发现此复合物也可使小猪的贫血症得到显著好转。

实施例24

同实施例11的方法，往5升Biot发酵罐中装入1l糖酮化假葡萄糖杆菌细胞悬液和30g甜菊甙A，接着加入1.5l无菌水和400ml IRA-68以形成一反应体系。反应在32℃、600rpm搅拌及1.6l/min通气量条件下进行。1小时后上清液中甜菊甙A消失，则反应中止。反应混合物经离心分离IRA-68和上清液。将IRA-60装入柱中（φ/4×40cm）用2NNaCl溶液（8.1l）洗脱。洗脱液施于HP-20（1l）柱以吸附，先用8l水冲洗柱，再用10%～50%的乙醇洗脱，得到目的物糖醛酸型甜菊甙A钠盐。

上述产品经浓缩冷冻干燥得到10.6克无色粉末。该粉末经甲醇-水中重结晶可得10.6g无色针状晶体，其m·p·220℃（分解）。本产品的HPLC分析（ODP柱，乙腈-水＝30∶70）在Rt＝9.70处显示一单峰。

¹³C-NMR（D₂O）ppm;18.06，21.52，22.91，24.19，30.89，39.51，40.15，42.02，43.01，43.73，44.58，46.69，46.79，49.89，56.17，59.64，63.51，63.71，64.37，71.36，72.43，73.14，74.40，74.67，76.29，76.99，78.12，78.70，78.72，78.81，78.93，79.27，79.38，81.49，87.99，90.31，96.64，98.70，104.87，105.06，107.32，155.99，177.79，181.64.

根据上述数据，该产品可确定为式（Ⅱ）的化合物的钠盐，其中

R₁＝-β-Glc UA，即下面式（Ⅹ）的化合物。

试验实例

可用各种酶来评价在实施例4中获得的6-O-α-D-葡糖醛酸基（14）-α-D-葡糖基-β-环糊精钠盐（1）对酶降解的稳定性。对照底物用6-O-α-麦芽糖基-β-环糊精。

方法

往每一等分环糊精水溶液（10mM）中分别加入预定量的下述酶，每一反应体系在37℃的水浴中孵育。然后分别从反应混合物中取样500μl并加热至100℃持续15分钟以使酶钝化。样品以15，000rpm离心5分钟再通过Millipore USY-1滤器（分子量上限为10，000）过滤。将滤液稀释10倍并在下列条件下进行HPLC分析。

HPLC参数及装置：

柱：NH2P-50（Asahipak）

流动相：乙腈-水＝48∶52，外加0.005MPIC试剂

流速：0.8ml/min

检测：RI

所得上述每一样品的HPLC数据中，环糊精的残留量（%）的测定时间达120分钟。

所用的酶及其浓度

酶名称来源酶浓度(单位^*/毫升)

α-淀粉酶枯草杆菌 20

(Wako Pure Chemical)

葡糖淀粉酶 Rhizopns sp. 2

(Wako Pare Chemical)

支链淀粉酶肺炎克雷伯氏菌 10

(Klebsiella Pneumoniae)

(Hayashibara)

β-葡糖苷酸酶牛肝 700

(Wako Pure Chemical)

＊“单位”是基于市售酶所标的单位。

结果

用各种酶处理6-O-α-D-葡糖醛酸基（14）-α-D-葡糖基-β-环糊精钠（1）和6-O-α-麦芽糖基-β-环糊精，处理时间内上述化合物%残余量见图11～14。

结果发现，本发明的化合物（1）对α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和支链淀粉酶的降解作用比对照物6-O-α-麦芽糖基-β-环糊精稳定。

尤其在用支链淀粉酶降解时，对照物6-O-α-麦芽糖基-β-环糊精被分解60%，而本发明（1）的化合物却几乎未受影响。

Claims

1、产生糖羧酸或其盐的方法，包括使假葡萄糖杆菌属中能氧化羟甲基和/或连结半缩醛羟基的碳原子为羧基的微生物或从中得到的细胞制品作用于含羟甲基和/或半缩醛羟基的单糖衍生物、寡糖、寡糖衍生物、多糖、或多糖衍生物以产生和积累相应羧酸及获取上述羧酸。

2、产生糖羧酸或其盐的方法，包括使假葡萄糖杆菌属中的能氧化羟甲基为羧基的微生物或从中得到的细胞制品作用于含羟甲基的单糖衍生物、寡糖、寡糖衍生物、多糖、多糖衍生物以产生和积累相应的羧酸及获取上述羧酸。

3、根据权利要求1或2的方法，其中使用上述假葡萄糖杆菌属微生物细胞本身。

4、至少有一个Palatinose的羟甲基被氧化为羧基的糖羧酸或其盐。

5、至少有一个D-海藻糖的羟甲基被氧化为羧基的糖羧酸或其盐。

6、至少有一个麦芽糖基-β-环糊精的羟甲基被氧化为羧基的糖羧酸或其盐。

7、至少有一个2-O-2-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸的羟甲基被氧化为羧基的糖羧酸或其盐。

8、至少有一个链脲估菌素的羟甲基被氧化为羧基的糖羧酸或其盐。

9、至少有一个庚酮糖的羟甲基被氧化为羧基的糖羧酸或其盐。

10、至少有一个式Ⅰ的麦芽糖糊精的羟甲基被氧化为羧基的糖羧酸或其盐。

（n＝0-5）

11、至少有一个式（Ⅱ）的甜菊糖醇甙的羟甲基被氧化为羧基的糖羧酸或其盐。

12、根据权利要求11的糖羧酸或其盐，其中甜菊糖醇甙为式（Ⅱ）的甜菊甙，其中R₁和R₂分别代表-β-Glc-2-β-Glc和-β-Glc。

13、根据权利要求11的糖羧酸或其盐，其中甜菊糖醇甙为式（Ⅱ）的甜菊甙-A，其中R₁和R₂分别代表

和-β-Glc。

14、至少有一个有效霉素A的羟甲基被氧化为羧基的糖羧酸或其盐。

15、至少有一个mogroside的羟甲基被氧化为羧基的糖羧酸或其盐。

16、至少有一个葡聚糖的羟甲基被氧化为羧基的糖羧酸或羧酸盐。

17、权利要求16的糖羧酸或其盐与金属盐的复合物。

18、产生糖羧酸或其盐的方法，包括使属于假葡萄糖杆菌属的能氧化连接半缩醛羟基的碳原子为羧基的微生物或从中得到的细胞制品作用于含半缩醛羟基的单糖衍生物、寡糖、寡糖衍生物、多糖、多糖衍生物以产生及和积累相应的羧酸及获得上述羧酸。

19、根据权利要求18的方法，其中使用属于假葡萄糖杆菌属的微生物细胞本身。

20、根据权利要求18的方法，其中含半缩醛羟基的多糖为葡聚糖。

21、根据权利要求18的方法，其中含半缩醛羟基的多糖衍生物为葡聚糖基葡糖醛酸。

22、至少有一个半缩醛羟基连结的碳原子被氧化为羧基的糖羧酸或其盐。

23、权利要求22的糖羧酸或其盐与金属盐的复合物。

24、产生葡聚糖基葡糖醛酸-氢氧化铁复合物的方法，包括用氢氧化铁溶胶与葡聚糖基葡糖醛酸反应。

25、根据权利要求1的方法，其中含羟甲基的寡糖为蔗糖。