CN109265440A - 氮杂环类荧光探针的制备方法及在硫化氢检测中的应用 - Google Patents

氮杂环类荧光探针的制备方法及在硫化氢检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了氮杂环类荧光探针的制备方法及其在硫化氢检测中的应用。本发明合成的氮杂环类荧光探针的合成方法简单、反应步骤少、原材料便宜以及反应条件温和。同时通过本发明制备的氮杂环类荧光探针能够实现对细胞内源性以及外源性H2S的检测以及荧光成像，且本发明制备的氮杂环类荧光探针能够对细胞溶酶体内H2S的检测以及荧光成像。因本发明合成的荧光探针结构中的氮杂环类分子不仅可以增加探针的水溶性，也可以增加弱碱性，使得杂环类荧光探针具有溶酶体靶向性好、水溶性好、灵敏度高等优点，实现对溶酶体中硫化氢的快速荧光信号响应及其实时可视化监测。

Description

氮杂环类荧光探针的制备方法及在硫化氢检测中的应用
技术领域
本发明涉及荧光探针制备以及应用技术领域，特别涉及一种检测溶酶体中硫化氢的氮杂环类荧光探针、氮杂环类荧光探针的制备方法以及氮杂环类荧光探针在检测硫化氢中的应用。
背景技术
硫化氢(H2S)是继一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)之后被发现的第三种生物体内源性产生的气体信号分子，主要是由L型胱氨酸通过胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase，CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)等生物酶内源性产生。H2S在调控心血管系统、神经系统、免疫系统、内分泌系统、呼吸系统、和肠胃系统等正常生理过程中起着重要作用。异常水平的H2S与许多疾病相关，比如高血压、阿尔茨海默氏症、唐氏综合症、糖尿病、肝硬化等。溶酶体(lysosome)是细胞内主要的代谢场所，参与细胞的代谢、胞内运输、细胞膜循环和细胞凋亡等多种生理功能。因此，对细胞溶酶体内硫化氢的检测对理解硫化氢生物生理、病理关系，乃至疾病早期诊断具有潜在的应用价值。
经典的检测硫化氢的方法主要有比色法、气相色谱法、电子顺磁共振法(EPR)或电子自旋共振法(ESR)、高效液相色谱法(HPLC)、电化学方法、化学发光法(ECL)等。这些方法大部分都具有很高的灵敏度和特异性，根据所测对象的性质选择某一种方法进行测量。但是它们都存在着操作复杂、费时费力、成本高，无法实现细胞内及生物体内的实时检测等不足。荧光探针法由于灵敏度高，选择性好，操作简便，而且具有立体位阻小、很好的时间与空间分辨率、膜透性好、结构多样、Stokes位移可控及制备方便等优点，常用于活性物种的测定。且荧光法结合激光扫描共聚焦显微技术，能够有效地实现活细胞和组织内功能性活性物种“实时、可视、定量”的高灵敏度检测，在研究细胞信号转导、细胞生理功能与病理效应方面具有独特的优势。然而大多数检测硫化氢的探针主要针对于体外以及细胞质中的H2S的检测，很难实现细胞器水平上的内源性H2S的检测，尤其是溶酶体靶向的H2S的检测。且现有的制备方法存在反应步骤多以及反应条件不温和等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供氮杂环类荧光探针的制备方法及在硫化氢检测中的应用，以解决现有技术中制备方法存在反应步骤多以及反应条件不温和等问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：氮杂环类荧光探针的制备方法及在硫化氢检测中的应用，所述制备方法包括以下步骤。
步骤1：制备化合物一。
将摩尔比为1：40-1：120的4-磺酸-1，8-萘二甲酸酐钾盐和氯化亚砜加入回流装置一中，同时向所述回流装置一中加入0.01-1mL的N，N-二甲基甲酰胺；然后启动所述回流装置一，在回流的条件下搅拌反应6-24h得到反应液一，回流温度为65～80℃；待所述反应液一冷却至室温后转至冰水中，待所述冰水中有固体析出时，进行抽滤、洗涤，得到所述化合物一，所述化合物一的结构式I-1为：
步骤2：制备化合物二。
将摩尔比为1：1-1：5的所述化合物一和叠氮化钠同时溶于体积为10-150ml有机溶剂一内，所述化合物一、叠氮化钠、有机溶剂一位于回流装置二内并在回流的条件下反应4-24h得到所述反应液二，其中，所述回流的温度为60～85℃；待所述反应液二冷却至室温后转至冰水中，待所述冰水中有固体析出时，进行抽滤、洗涤，得到所述化合物二，所述化合物二的结构式I-2为：
步骤3：制备化合物三。
将摩尔比为2：1：1-1：4：4的所述化合物二、溴乙胺溴化盐以及碱一溶于体积为5-100ml有机溶剂二中并进行回流反应3-36h得到所述反应液三，其中，所述回流反应的回流温度为65～80℃；待所述反应液三冷却至室温后，进行抽滤，旋干得到所述化合物三的粗产品，然后利用洗脱剂并通过薄层柱对所述粗产品进行层析得到所述化合物三的纯品，所述化合物三的结构式I-3为：
步骤4：制备氮杂环类荧光探针LyCyclen-N3。
将轮环藤宁和碱二溶于体积为4-80ml无水有机溶液中并于室温下搅拌反应0.1-2h后得到前驱液；然后将溶解有所述化合物三的无水乙腈溶液逐滴加入到所述前驱液中，滴加时间为3-60min，并加入0.01-0.2g催化量的碘化钾于室温下搅拌反应2-16h后得到反应液四，其中，所述轮环藤宁、碱二和所述化合物三的摩尔比为8：8：1-1：1：1；待反应完成后，将所述反应液四进行抽滤，旋干得到粗产品，然后再利用洗脱剂并通过薄层柱对所述粗产品进行层析得到所述氮杂环类荧光探针LyCyclen-N3，所述氮杂环类荧光探针LyCyclen-N3的结构式I-4为：
优选的，所述步骤1和步骤2中，反应液冷却至室温后转至冰水中的具体操作为：在通风橱中，将所述反应液缓慢滴加至装有冰水的烧杯中，并用玻璃棒不断搅拌直至所述烧杯中有白色沉淀生成。
优选的，所述步骤1和步骤2中，反应液冷却至室温后转至冰水中的具体操作为：在通风橱中，将所述反应液缓慢滴加至装有冰水的烧杯中，并用玻璃棒不断搅拌直至所述烧杯中有白色沉淀生成。
优选的，所述步骤2中的有机溶剂一为丙酮或乙腈。
优选的，所述步骤3中的有机溶剂二为甲醇或乙醇，所述碱一为三乙胺或4-N，N-二甲基吡啶，所述洗脱剂采用体积比为30:1-10:1的二氯甲烷和甲醇的混合液，所述洗脱剂的用量为5-500L。
优选的，所述步骤4中的无水有机溶液为二氯甲烷或乙腈；所述碱二为无水碳酸钾、三乙胺或4-N，N-二甲基吡啶。
优选的，所述步骤4中利用TLC跟踪监测技术用于监测所述反应是否完成。
优选的，在所述步骤3和步骤4中，利用旋转蒸发仪对冷却至室温后的反应液进行旋干。
本发明还提供一种检测溶酶体中硫化氢的氮杂环类荧光探针，其是根据所述的氮杂环类荧光探针的制备方法制备而成。所述氮杂环类荧光探针是以1，8-萘二甲酸酐为母体，并在所述母体的分子结构上一侧链接叠氮基团，另一侧连接四元氮杂环轮环滕宁；所述氮杂环类荧光探针的结构式如下：
本发明还另外提供一种所述的氮杂环类荧光探针在检测溶酶体中硫化氢的应用，所述氮杂环类荧光探针是用于水体系中硫化氢的特异性检测，以及对所述硫化氢进行定性或定量检测。
本发明还另外再提供另一种所述的氮杂环类荧光探针在检测溶酶体中硫化氢的应用，所述氮杂环类荧光探针是用于细胞溶酶体内自发性或外源性硫化氢的检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明合成的氮杂环类荧光探针的合成方法简单、反应步骤少、原材料便宜以及反应条件温和。本发明制备的氮杂环类荧光探针可以实现在体外对H2S的高特异性、高灵敏性的检测。
2、本发明制备的氮杂环类荧光探针具有快速跨越细胞膜的能力，能够实现对细胞内源性以及外源性H2S的检测以及荧光成像。该探针与细胞孵育后，无需洗涤，可直接用于激光共聚焦成像使探针具有快速跨越细胞膜的能力。
3、本发明合成的荧光探针结构中的氮杂环类分子不仅可以增加探针的水溶性，也可以增加弱碱性。使得杂环类荧光探针具有溶酶体靶向性好、水溶性好、灵敏度高等优点，实现对溶酶体中H2S的快速荧光信号响应及其实时可视化监测。
附图说明
图1为本发明的氮杂环类荧光探针对H2S的紫外可见吸收光谱图；
图2为本发明的氮杂环类探针对不同浓度H2S的荧光响应图；
图3为本发明的氮杂环类荧光探针对H2S的选择性分析图；
图4为本发明的氮杂环类荧光探针的制备方法流程图；
图5为本发明的氮杂环类荧光探针对宫颈癌细胞(HeLa)细胞中H2S的荧光成像图；
图6为本发明氮杂环类荧光探针探针与溶酶体在HeLa细胞中共定位的荧光成像图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
现有技术中，检测硫化氢的探针主要针对于体外以及细胞质中的H2S的检测。其很难实现细胞器水平上的内源性H2S的检测，尤其是溶酶体靶向的H2S的检测。为解决这一技术问题，本发明提供一种检测溶酶体中硫化氢的氮杂环类荧光探针。所述氮杂环类荧光探针是以1，8-萘二甲酸酐为母体，并在所述母体的分子结构上一侧链接叠氮基团，另一侧连接四元氮杂环轮环滕宁；所述氮杂环类荧光探针的结构式如下：
本实施例中的氮杂环类荧光探针具有溶酶体靶向性好、水溶性好、灵敏度高等优点，实现对溶酶体中硫化氢的快速荧光信号响应及其实时可视化监测。该探针与细胞孵育后，无需洗涤，可直接用于激光共聚焦成像。这是因为本发明合成的荧光探针结构中的氮杂环类分子不仅可以增加探针的水溶性，也可以增加弱碱性，使探针具有快速跨越细胞膜的能力，还可以特异性靶定在溶酶体内。为验证所述氮杂环类荧光探针具有上述特点，我们通过以下实验进行验证。
实验一：验证所述氮杂环类荧光探针在体外反应体系中对H2S的响应。紫外-可见吸收光谱测试：将本实施例制备的氮杂环类荧光探针LyCyclen-N3溶于四氢呋喃(THF)溶液中并配置成浓度为1mmol/L的储备液。利用10mmol/L的磷酸缓冲液(PB缓冲溶液)稀释探针母液至浓度为5.0μM和20μM，然后将浓度为5.0μM和20μM的探针母液用于紫外-可见吸收光谱测试。其中，所述10mmol/L的磷酸缓冲液中含有30％的CH3CN做为共溶剂，所述磷酸缓冲液的pH为7.4，氮杂环类荧光探针的吸收光谱性质是氮杂环类荧光探针与被分析物在PB缓冲溶液反应60min后进行测定的。其测定结果如图1所示，所述氮杂环类荧光探针在375nm波长处有一个强吸收峰。随着加入不同浓度(0-120μM)的H2S(在水溶液中，以HS_的形式存在)，氮杂环类荧光探针在375nm处的吸收值逐渐下降。但在440nm波长处出现一个新的吸收峰，其吸收值随着H2S浓度的增加而逐渐增强。这是因为H2S将氮杂环类荧光探针结构中具有强拉电子效应的叠氮基团还原为具有强推电子效应的氨基，改变了氮杂环类荧光探针分子结构中的推拉电子体系，从而使探针的吸收光谱红移了65nm。同时，加入H2S以后，氮杂环类荧光探针溶液的颜色也发生了明显地变化，由无色转变为浅黄色。
氮杂环类荧光探针对硫化氢的荧光响应测试：先将60μL的储备液加入到100mL的锥形瓶中。然后将HEPES缓冲溶液与四氢呋喃的混合溶液倒入所述锥形瓶中并将所述储备液稀释至60mL。其中，所述HEPES缓冲溶液的浓度为10mmol/L，pH值为7.4，所述HEPES缓冲溶液与四氢呋喃的体积比为7:3。再者，向所述锥形瓶中加入不同浓度的NaHS标准液，然后以405nm为激发光，在狭缝宽均为5nm的条件下，以440nm为激发光，收集的发射光谱范围是460-750nm，以测量氮杂环类荧光探针对硫化氢的荧光响应，其测定结果如图2所示，氮杂环类荧光探针的背景荧光较低。随着H2S浓度的不断增加，氮杂环类荧光探针在540nm的荧光逐渐增强。当向氮杂环类荧光探针溶液中加入30μM H2S时，氮杂环类荧光探针的荧光强度几乎达到了最大值，其荧光强度增加了约50倍。当H2S的浓度低至1.0μM时，氮杂环类荧光探针溶液的荧光增强在荧光仪可以清晰地分辨出来，说明氮杂环类荧光探针对H2S具有较高的灵敏性。而且氮杂环类荧光探针的荧光强度与H2S浓度之间具有很好的线性关系，相关系数的平方值为0.9979。所述NaHS标准液的浓度范围为0-100μmol/L，且所述NaHS作为H2S的供体。
实验二：验证所述氮杂环类荧光探针在体外反应体系中对H2S的响应的选择性。
向氮杂环类荧光探针溶液中分别加入其它阴离子(F-、Cl-、Br-、I-、CO3 2-、HCO3 -、NO2 -、NO3 -、SO4 2-、HSO4 -、SCN-)、活性氧(H2O2和ClO-)和200μmol/L生物硫醇(Cys、Hcy和GSH)，使得氮杂环类荧光探针溶液的最终浓度为1mmol/L。然后，再分别以405nm和488nm为激发光，在狭缝宽均为10nm的条件下，测量氮杂环类荧光探针对硫化氢的荧光响应的选择性。其验证结果，如图3所示，我们依次测定了探针对F-、Cl-、Br-、I-、CO3 2-、HCO3 -、NO2 -、NO3 -、SO4 2-、HSO4 -、SCN-、H2O2、ClO-、HS-、Cys和GSH的荧光响应曲线。向氮杂环类荧光探针溶液溶液中加入浓度高达1.0mM的上述物质，也仅能观察到微弱的氮杂环类荧光探针荧光强度变化。但是当加入50μM HS-时，探针在540nm处的荧光发生了明显的增强。上述验结果表明，氮杂环类荧光探针对H2S的选择性远高于其它物质，表明氮杂环类荧光探针对H2S的检测不仅具有高敏感性，同时也具有专一检测H2S的特性。
实施例2
为得到实施例1所述的氮杂环类荧光探针，我们采用以下制备方法以解决现有制备方法存在的反应步骤多以及反应条件不温和等问题。
参考图4，一种检测溶酶体中硫化氢的氮杂环类荧光探针的制备方法，所述制备方法包括以下步骤。
步骤1：制备化合物一。
将摩尔比为1：40-1：120的4-磺酸-1，8-萘二甲酸酐钾盐和氯化亚砜加入回流装置一中。同时向所述回流装置一中加入0.01-1mL的N，N-二甲基甲酰胺。然后启动所述回流装置一。在回流的条件下搅拌反应6-24h得到反应液一，回流温度为65～80℃。待所述反应液一冷却至室温后转至冰水中，即在通风橱中，将所述反应液一缓慢滴加至装有冰水的烧杯中，并用玻璃棒不断搅拌直至所述烧杯中有白色沉淀生成。即待所述冰水中有固体析出时进行抽滤，并用水进行洗涤，得到所述化合物一，所述化合物一的结构式I-1为：
步骤2：制备化合物二。
将摩尔比为1：1-1：5的所述化合物一和叠氮化钠同时溶于体积为10-150ml有机溶剂一内。所述有机溶剂一为丙酮或乙腈中的任意一种。所述化合物一、叠氮化钠、有机溶剂一位于回流装置二内并在回流的条件下反应4-24h得到所述反应液二。其中，所述回流的温度为60～85℃。待所述反应液二冷却至室温后转至冰水中。即在通风橱中，将所述反应液二缓慢滴加至装有冰水的烧杯中，并用玻璃棒不断搅拌直至所述烧杯中有白色沉淀生成。即待所述冰水中有固体析出时，进行抽滤、洗涤，得到所述化合物二，所述化合物二的结构式I-2为：
步骤3：制备化合物三。
将摩尔比为2：1：1-1：4：4的所述化合物二、溴乙胺溴化盐以及碱一溶于体积为5-100ml有机溶剂二中并进行回流反应3-36h得到所述反应液三。其中，所述回流反应的回流温度为65～80℃，所述有机溶剂二为甲醇或乙醇中的任意一种，所述碱一为三乙胺或4-N，N-二甲基吡啶中的任意一种。待所述反应液三冷却至室温后进行抽滤，并利用旋转蒸发仪对抽滤后的物质进行旋干得到所述化合物三的粗产品。然后利用洗脱剂并通过薄层柱对所述粗产品进行层析得到所述化合物三的纯品。所述洗脱剂为二氯甲烷和甲醇混合液，二者的体积比为30:1-10:1，所述洗脱剂的用量为5-500L。所述化合物三的结构式I-3为：
步骤4：制备氮杂环类荧光探针LyCyclen-N3。
将轮环藤宁和碱二溶于体积为4-80ml无水有机溶液中并于室温下搅拌反应0.1-2h后得到前驱液。其中，所述无水有机溶液为二氯甲烷或乙腈中的任意一种，所述碱二为无水碳酸钾、三乙胺或4-N，N-二甲基吡啶中的任意一种。然后然后将溶解有所述化合物三的无水乙腈溶液逐滴加入到所述前驱液中，滴加时间为3-60min。并加入0.01-0.2g催化量的碘化钾于室温下搅拌反应2-16h后得到反应液四。其中，所述轮环藤宁、碱二和所述化合物三的摩尔比为8：8：1-1：1：1，并利用TLC跟踪监测技术用于监测所述反应是否完成。待反应完成后，将所述反应液四进行抽滤，并利用旋转蒸发仪对抽滤后的物质旋干得到粗产品。然后再利用洗脱剂并通过薄层柱对所述粗产品进行层析得到化合物四，所述化合物四即为所述的氮杂环类荧光探针LyCyclen-N3。所述洗脱剂为二氯甲烷和甲醇混合液，二者的体积比为30:1-10:1，所述洗脱剂的用量为5-500L。所述氮杂环类荧光探针LyCyclen-N3的结构式I-4为：
按照上述方法步骤，我们通过大量实验参数的调节与对比，选出以下最优案例。
步骤1：制备化合物一。
将3.2g 4-磺酸-1，8-萘二甲酸酐钾盐溶于60mL氯化亚砜中，加入1.16mL的三乙胺，于80℃下然后加入几滴N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，回流12h得到反应液一。待冷却至室温后，在通风橱中将反应液一缓慢滴至装有冰水的烧杯中，滴加的过程不断搅拌，慢慢析出固体。然后进行抽滤，并用大量的水冲洗滤饼，得目标产物化合物一。该产品不需纯化，可直接用于下一步反应。所述化合物一的合成反应方程式为：
步骤2：制备化合物二。
将2.8g化合物一和0.66g叠氮化钠溶于100mL丙酮溶剂中，回流12h得到反应液二。待冷却至室温后，在通风橱中将反应液二转入装有冰水的烧杯中。待固体析出后进行抽滤，并用大量的水冲洗滤饼，得目标产物化合物二。所述化合物二的合成反应方程式为：
步骤3：制备化合物三。
将2g化合物二和1.71g溴乙胺溴化盐溶于50mL乙醇溶剂中，回流12h得到反应液三。待所述反应液三冷却至室温有固体析出时，进行抽滤并得到所述化合物三的粗产品。然后以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，通过薄层柱层析得到所述化合物三的纯品。所述化合物三的合成反应方程式为：
步骤4：制备氮杂环类荧光探针LyCyclen-N3。
将1.48g轮环藤宁和1.2g无水碳酸钾溶于40mL无水乙腈中，并于室温下搅拌30min。将溶有1g所述化合物三的30mL无水乙腈溶液逐滴加入到上述反应体系中，并加入催化量的碘化钾。并于室温下搅拌反应6h。利用TLC跟踪监测技术检测反应是否完成。待反应完成后，抽滤除去碳酸钾粉末，并用真空旋转蒸发仪除去乙腈。得到的残渣用柱层析纯化得目的产物氮杂环类荧光探针LyCyclen-N3。所述氮杂环类荧光探针的合成反应式为：
本实施例中的探针制备方法具有合成方法简单、反应步骤少、原材料便宜、反应条件温等优点。通过本实施例制备的荧光探针具有荧光背景低、溶酶体靶向性好，跨膜能力强。同时，通过本实施例的制备方法可以合成具有定位和检测功能于一体的单荧光探针，实现对溶酶体中硫化氢的快速荧光信号响应。且通过本实施例中的制备方法制备的荧光探针对硫化氢具有高特异性和高灵敏的检测性。通过荧光成像，该荧光探针可以检测溶酶体中硫化氢，实现对溶酶体内硫化氢的动态监测。
实施例3
将利用实施例2的制备方法制备出实施1中所述的氮杂环类荧光探针可应用于水体系中硫化氢的特异性检测，以及对所述硫化氢进行定性或定量检测；也可应用于细胞溶酶体内自发性或外源性硫化氢的检测。下面将说明具体的应用案例。
应用案例一：氮杂环类荧光探针在宫颈癌细胞成像中的应用。
将104个宫颈癌细胞的细胞种于激光共聚焦专用的培养皿中，于37℃、5％CO2条件下培养24后。将实施例1制备所述的氮杂环类荧光探针LyCyclen-N3加入到宫颈癌细胞中，使其最终浓度5μmol/L。培养30min后，进行激光共聚焦成像，成像结果如图5所示。如图5中的Probe组所示，直接将氮杂环类荧光探针加入细胞中培养30min后，能够观测到的绿色荧光。这表明本发明的氮杂环类荧光探针(Probe)能够直接检测细胞中内源性H2S。为了验证细胞中的荧光信号确实来源于氮杂环类荧光探针对H2S的响应。我们用H2S的清除剂NMM预先处理细胞30min，随后加入氮杂环类荧光探针再孵育30min后进行荧光成像。如图5中的NMM+Probe组所示，在细胞中几乎观察不到荧光，表明细胞中的荧光信号确实来源于氮杂环类荧光探针对细胞内源性H2S的响应。最后，我们预先用NMM处理后的细胞后，先加100μmol/L的NaHS(外源性加入H2S)孵育30min后，再加氮杂环类荧光探针进行培养30min，然后进行成像。如图5中的NMM+Probe+NaHS组所示，显示细胞中能观察到明亮的绿色荧光，表明氮杂环类荧光探针能够检测细胞中外源性H2S。
应用案例二：氮杂环类荧光探针在宫颈癌细胞中与溶酶体共定位应用。
将104个宫颈癌细胞的细胞种于激光共聚焦专用的培养皿中，于37℃、5％CO2条件下培养24后。将实施例1所述的氮杂环类荧光探针LyCyclen-N3(所述氮杂环类荧光探针的浓度为5μmol/L)和商用溶酶体定位染料Lyso Tracker(所述溶酶体定位染料的浓度为1μmol/L)加入到宫颈癌细胞中，培养30min后，进行激光共聚焦成像。绿色通道的激发波长是488nm，收集的波长范围是510-560nm；红色通道的激发波长是633nm。收集的波长范围是650-700nm。成像结果如图6所示，我们的氮杂环类荧光探针与商用溶酶体在细胞中的荧光信号具有很好的重叠效应，表明我们的氮杂环类荧光探针能够特异性的检测对细胞溶酶体中的H2S。这样为研究亚细胞水平H2S的正常生理功能以及在病例状态下的作用提供了很好的研究工具。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种检测溶酶体中硫化氢的氮杂环类荧光探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
步骤1：制备化合物一
将摩尔比为1：40-1：120的4-磺酸-1，8-萘二甲酸酐钾盐和氯化亚砜加入回流装置一中，同时向所述回流装置一中加入0.01-1mL的N，N-二甲基甲酰胺；然后启动所述回流装置一，在回流的条件下搅拌反应6-24h得到反应液一，回流温度为65～80℃；待所述反应液一冷却至室温后转至冰水中，待所述冰水中有固体析出时，进行抽滤、洗涤，得到所述化合物一，所述化合物一的结构式I-1为：
步骤2：制备化合物二
将摩尔比为1：1-1：5的所述化合物一和叠氮化钠同时溶于体积为10-150ml的有机溶剂一内，所述化合物一、叠氮化钠、有机溶剂一位于回流装置二内并在回流的条件下反应4-24h得到所述反应液二，其中，所述回流的温度为60～85℃；待所述反应液二冷却至室温后转至冰水中，待所述冰水中有固体析出时，进行抽滤、洗涤，得到所述化合物二，所述化合物二的结构式I-2为：
步骤3：制备化合物三
将摩尔比为2：1：1-1：4：4的所述化合物二、溴乙胺溴化盐以及碱一溶于体积为5-100ml有机溶剂二中并进行回流反应3-36h得到所述反应液三，其中，所述回流反应的回流温度为65～80℃；待所述反应液三冷却至室温后，进行抽滤，旋干得到所述化合物三的粗产品，然后利用洗脱剂并通过薄层柱对所述粗产品进行层析得到所述化合物三的纯品，所述化合物三的结构式I-3为：
步骤4：制备氮杂环类荧光探针LyCyclen-N3
将轮环藤宁和碱二溶于体积为4-80ml无水有机溶液中并于室温下搅拌反应0.1-2h后得到前驱液；然后将溶解有所述化合物三的无水乙腈溶液逐滴加入到所述前驱液中，滴加时间为3-60min，并加入0.01-0.2g的碘化钾于室温下搅拌反应2-16h后得到反应液四，其中，所述轮环藤宁、碱二和所述化合物三的摩尔比为8：8：1-1：1：1；待反应完成后，将所述反应液四进行抽滤，旋干得到粗产品，然后再利用洗脱剂并通过薄层柱对所述粗产品进行层析得到所述氮杂环类荧光探针LyCyclen-N3，所述氮杂环类荧光探针LyCyclen-N3的结构式I-4为：
2.根据权利要求1所述的检测溶酶体中硫化氢的氮杂环类荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤1和步骤2中，反应液冷却至室温后转至冰水中的具体操作为：在通风橱中，将所述反应液缓慢滴加至装有冰水的烧杯中，并用玻璃棒不断搅拌直至所述烧杯中有白色沉淀生成。
3.根据权利要求1所述的检测溶酶体中硫化氢的氮杂环类荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤2中的有机溶剂一为丙酮或乙腈。
4.根据权利要求1所述的检测溶酶体中硫化氢的氮杂环类荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤3中的有机溶剂二为甲醇或乙醇，所述碱一为三乙胺或4-N，N-二甲基吡啶，所述洗脱剂采用体积比为30:1-10:1的二氯甲烷和甲醇的混合液，所述洗脱剂的用量为5-500L。
5.根据权利要求1所述的检测溶酶体中硫化氢的氮杂环类荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤4中的无水有机溶液为二氯甲烷或乙腈；所述碱二为无水碳酸钾、三乙胺或4-N，N-二甲基吡啶。
6.根据权利要求1所述的检测溶酶体中硫化氢的氮杂环类荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤4中利用TLC跟踪监测技术用于监测所述反应是否完成。
7.根据权利要求1所述的检测溶酶体中硫化氢的氮杂环类荧光探针的制备方法，其特征在于，在所述步骤3和步骤4中，利用旋转蒸发仪对冷却至室温后的反应液进行旋干。
8.一种检测溶酶体中硫化氢的氮杂环类荧光探针，其是根据权利要求1至7中任意一项所述的氮杂环类荧光探针的制备方法制备而成，其特征在于，所述氮杂环类荧光探针是以1，8-萘二甲酸酐为母体，并在所述母体的分子结构上一侧链接叠氮基团，另一侧连接四元氮杂环轮环滕宁；所述氮杂环类荧光探针的结构式如下：
9.一种如权利要求8所述的氮杂环类荧光探针在检测溶酶体中硫化氢的应用，其特征在于，所述氮杂环类荧光探针是用于水体系中硫化氢的特异性检测，以及对所述硫化氢进行定性或定量检测。
10.一种如权利要求8所述的氮杂环类荧光探针在检测溶酶体中硫化氢的应用，其特征在于，所述氮杂环类荧光探针是用于细胞溶酶体内自发性或外源性硫化氢的检测。
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