CN109234435A - 一种用于鉴定小麦茎秆壁厚的方法及其引物 - Google Patents

一种用于鉴定小麦茎秆壁厚的方法及其引物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴定小麦茎秆壁厚的方法及其引物，该方法通过提取待鉴定小麦品种的基因组DNA，利用特异性引物进行pcr扩增，将扩增得到的基因利用限制性内切酶进行酶切后，得到二条DNA片段为厚壁特性的小麦材料；得到三条DNA片段为薄壁特性的小麦材料。该特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。本发明方法操作简单、方便，检测快捷，可准确鉴定出茎秆厚壁与薄壁两种类型的小麦品种。

Description

一种用于鉴定小麦茎秆壁厚的方法及其引物
技术领域
本发明属于属于农业生物技术工程领域，具体涉及一种用于鉴定小麦茎秆壁厚的方法及其引物。
背景技术
正常小麦的茎秆表现为空心,其壁厚一般在0.2mm左右，然而自然界种存在具有壁厚较厚对一类小麦，茎秆内仅有极小的髓腔，其壁厚较厚可达一般在0.5mm以上，最高可达1.5mm，其茎秆机械强度高，往往具有抵抗茎蜂等害虫口器、耐干旱的能力，同时比空秆小麦的抗倒伏能力要强，具有很大的应用前景。
目前对具有厚壁(极端情况表现为茎秆全实心)到小麦资源进行基因定位，多数将与壁厚相关的基因定位在小麦3BL染色体臂上，并且具有很大的遗传效应(陈华华等，2008；Cook et al.2004；Nilsen et al.2017)，但是控制小麦茎秆壁厚基因尚未被克隆，前人多采用集团分离分析法进行基因定位，其与最近的标记Xgwm247之间的距离在5cM之上。Oiestad et al.(2017)利用Qss.msub.3BL近等基因系研究了若干候选基因的在空心、实心近等基因系中的若干基因，利用转录组测序分析的方法其在该区间鉴定出一个与木质素合成酶相关的咖啡酸3-O-甲基转移酶(COMT)基因，推测可能跟壁厚基因相关，但仍需要进一步的确认。IWGSC(国际小麦基因组测序组，2018)认为小麦壁厚这一性状与一个DOF转录因子的拷贝数目正相关，该转录因子具有一个与DNA结合的锌指结构，位于3B染色体物理位置819.5-830Mb之间。
综上所述，现有技术存在的问题是：以上的文献，总结为厚壁这一性状与木质素合成酶咖啡酸3-O-甲基转移酶(COMT)、DOF转录因子相关，可能为该基因的候选基因，对于壁厚这一性状来说，小麦茎秆壁的厚度与木质素合成酶咖啡酸3-O-甲基转移酶的表达量正相关，与DOF转录因子的拷贝数目正相关，从这一技术原理上，对厚壁这一性状的鉴定需要对咖啡酸3-O-甲基转移酶的表达量以及DOF转录因子的拷贝数目进行鉴定，现有基于基因组DNA的PCR技术对基因表达量以及拷贝数的鉴定无能为力，对基因表达量、拷贝数的鉴定需要用到对转录组进行实时定量PCR，这种技术相对于基因组DNA的PCR技术来说，需要耗费更多的人力和时间，其鉴定成本高，不利于大规模的群体筛选与鉴定。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于基因组DNA的PCR鉴定技术，具体提供了一种有关小麦茎秆壁厚的方法及其特异引物，用于鉴定茎秆具有厚壁特性的小麦材料。
本发明具体通过以下技术方案实现：
一种用于鉴定小麦茎秆壁厚的方法，包括以下步骤：
提取待鉴定小麦品种的基因组DNA，利用特异性引物进行pcr扩增，将扩增得到的基因利用限制性内切酶进行酶切后，得到二条DNA片段为厚壁特性的小麦材料；得到三条DNA片段为薄壁特性的小麦材料。
其中所述的特异性引物为：
P1：GACAGCCACTTAGGACTTCA；
P2：ACGCCACAACGACATTGCTCACG。
所述的限制性内切酶为Apo I，其其酶切位点为5’-RAA/TTY-3’。
所述的pcr扩增引物所用的浓度为0.2uM、退火温度为60℃。
所述的厚壁特性的小麦材料的酶切图谱为370+1130bp条带。
所述的薄壁特性的小麦材料的酶切图谱为340+370+790bp条带。
在本发明的另一方面，上述特异性引物也在本发明的保护范围之内。
另一方面，所述的特异性引物在鉴定小麦茎秆壁厚中应用也在本发明保护范围之内。
同时，一种用于鉴定小麦茎秆壁厚的试剂盒，所述的试剂盒中包含上述特异性引物和内切酶。
本发明的有益效果为：不需要做荧光定量PCR以及基因组基因拷贝数的鉴定，直接对引物PCR产物进行酶切，根据酶切产物即可判断，简单方面快捷。
附图说明
图1是壁厚材料86-741与薄壁材料CS、川麦42P1+P2引物扩增产物的Apo I酶切示意图，其中1、2、3泳道分别为CS、川麦42以及86-741；
图2是86-741与川麦42重组自交系群体厚壁与薄壁材料的鉴定，M为Marker，1-96为群体材料；
图3是小麦微核心种质资源材料厚壁与薄壁类型的分子鉴定，M为Marker，1-96为群体材料。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明是这样实现的，通过中国春基因组序列并结合厚壁材料86-741的PCR产物测序，克隆到咖啡酸3-O-甲基转移酶基因启动子的上游5000bp区域，发现该区域厚壁材料86-741与薄壁材料川麦42(CM42)、中国春(CS)之间具有较大的差异，其中有一处厚壁与薄壁材料间的SNP差异导致了Apo I酶切位点的变化，所用PCR引物为：P1：GACAGCCACTTAGGACTTCA；P2：ACGCCACAACGACATTGCTCACG，所用限制性内切酶为Apo I，其酶切位点为5’-RAA/TTY-3’，酶切后具有厚壁特性的小麦材料86-741具有二条DNA片段，分别为370bp、1130bp左右(图1)，薄壁材料川麦42和CS的P1+P2引物扩增片段的酶切产物分别为340bp、370bp和790bp左右(图1)。
因此提出一种用于鉴定小麦茎秆壁厚的方法，通过提取待鉴定小麦品种的基因组DNA，利用特异性引物进行pcr扩增，将扩增得到的基因利用限制性内切酶进行酶切后，得到二条DNA片段为厚壁特性的小麦材料；得到三条DNA片段为薄壁特性的小麦材料。
实施例1
材料：86-741与川麦42重组自交系(RIL)群体，群体大小185个，利用CTAB法提取其基因组DNA。
引物：P1：GACAGCCACTTAGGACTTCA；
P2：ACGCCACAACGACATTGCTCACG。
限制性内切酶：Apo I由美国NEB公司提供，其酶切位点为5’-RAA/TTY-3’。
具体过程如下：
扩增体系如下(20ul体系)：10×PCR缓冲液(Buffer)1ul，模板2.0ul(适量)，25mM浓度的镁离子1.2ul(体系Mg2+浓度为1.5mM)，2.5mM浓度dNTP加1.2ul(体系dNTP的0.2mM)，0.1ul+0.1ul≤10uM引物≤0.4ul+0.4ul(体系引物浓度为0.2uM)，5U/ul rTaq酶0.16ul(体系rTaq浓度为1U/25ul)，加无菌去离子水或ddH2O水至20ul。
其中所用PCR试剂中10×PCR缓冲液、25mM浓度的镁离子、2.5mM浓度dNTP以及5U/ul rTaq酶由宝生物工程(大连)有限公司提供；本发明利用Apo I酶对PCR产物进行直接酶切，不可在PCR反应体系中加入PCR添加剂或者使用PCR Master Mix等试剂。
PCR程序为：94℃预变性4min；降落PCR程序共10个循环每一循环降低1℃，94℃45秒，70℃45秒，72℃60秒；常规PCR程序28个循环，94℃45秒，60℃45秒，72℃60秒；最后一部扩增：72℃，10min。
Apo I酶切：在上述PCR产物中直接加入：10×NEBuffer 3.1缓冲液1ul(PCR产物中含有一定的盐离子浓度)，10,000units/ml的Apo I内切酶0.4ul，加入去离子水至25ul；50℃40min，80℃20min，置于4℃冰箱。
电泳检测：2％的琼脂糖凝胶电泳(按比例加入10000×GelStain核酸染料)，酶切产物上样量为8ul，60V电压，40min，照相、分析。
结果与分析：
从图2显示的是1-96号样品茎秆厚壁与薄壁特性的分子检测情况，在该RIL群体中主要分为2中类型，一种是具有厚壁特性的材料，如样品2、3、7、8，P1+P2的PCR产物ApoI酶切后具有370bp、1130bp左右的条带，其茎秆平均壁厚分别为1.500、1.498、1.312、1.539mm；另外一种是具有薄壁特性的材料，如样品1、4、5、6，分子鉴定图谱具有340bp、370bp和790bp左右的条带，其茎秆平均壁厚分别为0.536、0.504、0.549、0.519mm(表1)。
表1鉴定86-741与川麦42RIL群体茎秆壁厚类型(部分)
利用本方法对86-741与川麦42重组自交系群体进行分子鉴定，群体分为两种类型，370+1130bp酶切图谱类型，表现为厚壁特性，其平均壁厚为1.248mm；另外一种为340+370+790bp类型，表现为薄壁特性，其茎秆平均壁厚为0.680mm，相差近一倍，并且两组数据平均值之间差异极其显著(表2)。
表2 86-741与川麦42RIL群体中两种分子鉴定类型的茎秆壁厚比较
综上，86-741为具有壁厚特性的小麦材料，在其与薄壁特性的川麦42做成的RIL群体中，利用本方法的分子鉴定技术，可以区分出厚壁与薄壁两种类型。
实施例2
材料：我国小麦微核心种质资源材料96份。
引物：P1：GACAGCCACTTAGGACTTCA；
P2：ACGCCACAACGACATTGCTCACG。
限制性内切酶：Apo I由美国NEB公司提供，其酶切位点为5’-RAA/TTY-3’。
方法：同实施例1
结果与分析：如图3，在96份微核心种质资源材料中，利用本方法共鉴定出4个材料具有厚壁特性，分子表现为纯合基因型，新冬2号、Tanori、骊英5号、农大311，其5节平均壁厚为0.78、0.91、0.62、0.91，其它绝大多数材料表现为薄壁特性，如边巴春麦6、江东门、火麦、小佛手(表3)。
表3微核心种质材料中具有厚壁材料的分子鉴定及其表型
对96份微核心种质资源群体进行分子鉴定，群体分为两种类型，370+1130bp酶切图谱类型，表现为厚壁特性，其平均壁厚为0.808mm；另外一种为340+370+790bp类型，表现为薄壁特性，其茎秆平均壁厚为0.509mm，相差近一倍，并且两组数据平均值之间差异极其显著(表4)。
表4微核心种质群体中两种分子鉴定类型的茎秆壁厚比较
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 四川省农业科学院作物研究所
<120> 一种用于鉴定小麦茎秆壁厚的方法及其引物
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gacagccact taggacttca 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgccacaac gacattgctc acg 23

Claims (9)

1.一种用于鉴定小麦茎秆壁厚的方法，其特征在于，包括：
提取待鉴定小麦品种的基因组DNA，利用特异性引物进行pcr扩增，将扩增得到的基因利用限制性内切酶进行酶切后，得到二条DNA片段为厚壁特性的小麦材料；得到三条DNA片段为薄壁特性的小麦材料。
2.根据权利要求1所述的一种用于鉴定小麦茎秆壁厚的方法，其特征在于，所述的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。
3.根据权利要求1所述的一种用于鉴定小麦茎秆壁厚的方法，其特征在于，所述的限制性内切酶为Apo I，其其酶切位点为5’-RAA/TTY-3’。
4.根据权利要求1所述的一种用于鉴定小麦茎秆壁厚的方法，其特征在于，所述的pcr扩增引物所用的浓度为0.2uM、退火温度为60℃。
5.根据权利要求1所述的一种用于鉴定小麦茎秆壁厚的方法，其特征在于，所述的厚壁特性的小麦材料的酶切图谱为370+1130bp条带。
6.根据权利要求1所述的一种用于鉴定小麦茎秆壁厚的方法，其特征在于，所述的薄壁特性的小麦材料的酶切图谱为340+370+790bp条带。
7.权利要求2所述的特异性引物。
8.权利要求7所述的特异性引物在鉴定小麦茎秆壁厚中应用。
9.一种用于鉴定小麦茎秆壁厚的试剂盒，所述的试剂盒中包含权利要求7所述的特异性引物和内切酶Apo I。
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