CN108570509A - 一种脊尾白虾ec16 snp标记的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出用于检测脊尾白虾EC16位点SNP标记的引物。本发明还提出脊尾白虾EC16位点SNP标记的检测方法，包括如下步骤：首先提取不同地理群或脊尾白虾群内个体的基因组DNA备用；利用脊尾白虾转录组文库中的含有EC16 SNP标记的核心序列，在其序列两端设计特异性引物；使用该引物对脊尾白虾不同地理群或脊尾白虾群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行检测；PCR产物进行限制性内切酶酶切反应，根据出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，并获得脊尾白虾的遗传多态性图谱。本发明主要应用于脊尾白虾群体间遗传标记、系谱认证和遗传图谱的构建。

Description

一种脊尾白虾EC16 SNP标记的检测方法

技术领域

本发明属于脊尾白虾DNA分子遗传标记技术，是脊尾白虾在EC16位点遗传多态性的SNP标记检测方法。

背景技术

本发明做出之前，国内外仅见脊尾白虾微卫星遗传标记的研究报道，国内朱晓宇（2010）等报道了近缘物种中国对虾微卫星标记对脊尾白虾的通用性，筛选出2个通用标记。贾舒雯等（2011，2012）采用人工合成的生物素标记(AG)15探针及磁珠富集法构建了脊尾白虾基因组微卫星富集文库，筛选出26个多态性微卫星标记；并利用其中12个微卫星标记分析了莱州湾、海州湾、象山脊尾白虾野生群体的遗传多样性。微卫星标记同样可用来揭示不同家系群体的遗传变化规律。如王日芳（2016）利用33个微卫星标记对脊尾白虾3个近交家系进行了评价，揭示了近交系的遗传特性。刘九美等（2017）利用25个微卫星标记分析了脊尾白虾回交家系的遗传变异规律。王佳佳等（2017）基于高通量测序开发了60个脊尾白虾多态性微卫星标记。关于脊尾白虾SNP标记的报道仅见李吉涛发表的利用脊尾白虾转录组文章（Molecular Biology Reports, 2015）。目前GenBank中尚未见注册的脊尾白虾SNP标记，可用于遗传连锁图谱构建和系谱识别的SNP标记的数量仍极其缺乏，国内外尚未见有脊尾白虾SNP多态性图谱的构建、特异性遗传标记等方面应用的研究报道。

发明内容

本发明其目的是提出一种脊尾白虾DNA分子遗传标记检测方法，主要利用建立的脊尾白虾转录组文库中含有SNP标记的核心序列，在其两端设计特异性引物进行PCR扩增，PCR产物通过限制性内切酶进行酶切反应，从而快速地检测脊尾白虾每个个体在此SNP位点的遗传变异，获得该引物的脊尾白虾多态性图谱，通过图谱直观地检测出每个个体的基因型。

本发明提出用于检测脊尾白虾EC16位点SNP标记的引物，所述正向引物序列如SEQID NO.1所示，所述反向引物序列如SEQ ID NO.2所示。

此外，本发明还提出脊尾白虾EC16位点SNP标记的检测方法，包括如下步骤：首先提取不同地理群或脊尾白虾群内个体的基因组DNA备用；利用脊尾白虾转录组文库中的含有EC16 SNP标记的核心序列，在其序列两端设计特异性引物；使用该引物对脊尾白虾不同地理群或脊尾白虾群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行检测；PCR产物进行限制性内切酶酶切反应，根据出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，并获得脊尾白虾的遗传多态性图谱；所述特异性引物序列分别为：正向引物序列为SEQ ID NO.1所示，反向引物序列为SEQ ID NO.2所示。

进一步的，PCR扩增体系为：脊尾白虾基因组DNA 100ng；10X PCR Buffer，2.0μL；25mmol/L Mg²⁺，2μL；Taq酶，1U；dNTP，2μL；正反引物各2μL；加灭菌水至20μL。进一步的，PCR反应程序为：94℃变性5min；94℃ 40sec，55℃ 40sec，72℃ 40sec，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

进一步的，PCR产物的检测和酶切：将PCR产物在1％的琼脂糖凝胶进行电泳，160V恒电压电泳20-30分钟进行检测；PCR产物检测合格后，利用限制性内切酶EcoR I进行酶切反应，酶切反应体系20μL，包括PCR产物5μL，10X Buffer 2.0μL，EcoR I内切酶1μL，加ddH₂O至20μL；酶切反应温度37℃保温1小时，然后进行琼脂糖凝胶电泳，160V恒电压电泳25分钟进行检测，最后利用全自动凝胶成像仪进行拍照可得到脊尾白虾在EC16 SNP位点的多态性图谱。

进一步的，所述EC16 SNP标记的核心序列如SEQ ID NO.3所示。

脊尾白虾EC16 SNP位点遗传多态性图谱的构建方法，包括如下步骤：首先提取不同地理群或脊尾白虾群内个体的基因组DNA备用；利用脊尾白虾转录组文库中的含有EC16SNP标记的核心序列，在其序列两端设计特异性引物；使用该引物对脊尾白虾不同地理群或脊尾白虾群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行检测；利用PCR产物进行限制性内切酶酶切反应，根据出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，并获得脊尾白虾的遗传多态性图谱；所述特异性引物序列分别为：正向引物序列为SEQ ID NO.1所示，反向引物序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明相对于现有技术所具有的优点为：

1.本发明可快捷地获得脊尾白虾的EC16遗传标记基因座位的遗传变异图谱，方法简便，所得结果可直观地检测出脊尾白虾每个个体的基因型，从而区分纯合子和杂合子个体。

2.本发明主要应用于脊尾白虾群体间遗传标记、系谱认证和遗传图谱的构建等。PCR引物和限制性内切酶是本发明的核心，在脊尾白虾总群检测中呈现多态性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的EC16引物和限制性内切酶对脊尾白虾20个个体的检测图谱，编号1-20是脊尾白虾的20个个体，M是DL 2000标准分子量。

具体实施方式

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。

下面通过实施例结合附图详细叙述本发明在脊尾白虾EC16 SNP核心序列DNA分子遗传标记技术方法。

实施例1，

本发明还提出一种脊尾白虾EC16位点SNP标记的检测方法，包括如下步骤：

1.首先提取不同地理群或脊尾白虾群内个体的基因组DNA稀释备用；

2.利用脊尾白虾转录组文库中的含有EC16 SNP标记的核心序列，在其序列两端设计特异性引物；

3.使用该引物对脊尾白虾不同地理群或脊尾白虾群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行检测；

4.利用PCR产物进行限制性内切酶酶切反应，根据出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，并获得脊尾白虾的遗传多态性图谱；

5.所述特异性引物序列分别为：正向引物序列为SEQ ID NO.1所示，反向引物序列为SEQ ID NO.2所示。

实施例2，试验方法：

1.脊尾白虾基因组DNA的提取：取脊尾白虾肌肉组织100mg，剪碎后放入1.5mL离心管中，加入pH8.0的TE溶液(10mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA) 475μL，用研磨棒研磨；加入10％SDS溶液25μL，混匀；加入20mg/mL蛋白酶K 4μL，混匀，55℃消化2.5-3h；重蒸酚抽提两次，每次10min，12000转/min离心5min，取上清；酚:氯仿(1:1)抽提一次，10min，12000 转/min离心5min，取上清；氯仿抽提一次5min，12000转/min离心5min，取上清；加入1/25体积的5mol/L NaCl溶液，混匀后再加入两倍体积的-20℃的无水乙醇沉淀DNA 15min；挑出的DNA，用70％的乙醇洗涤数十分钟，使DNA干燥，用灭菌水500μL充分溶解后，定量将其稀释成50ng/μL的浓度备用。

2.SNP引物的设计：在脊尾白虾转录组文库中含有EC16 SNP核心序列的基础上，利用EC16 SNP核心序列两侧的序列在同一物种相对于核心序列的高度保守性，据此在其两端设计特异性引物，用其扩增出该位点的DNA片段。由于SNP核心序列存在碱基突变，造成相应限制性内切酶酶切位点的变化，利用酶切位点的变化进行限制性内切酶酶切反应即可获得DNA序列长度的变化，这是检测SNP多态性的根源。本发明的SNP核心序列两端的特异性引物序列为：正向引物5’-CCC GAA CAA GAA AAC ACC-3’，反向引物5’-ACG AGA CAA ACC CGAACT-3’，使用该引物时的退火温度为59℃。

其中EC16位点SNP的核心序列为：CCCGAACAAGAAAACACCAACAGCAGCTGAGTTAGATGCTGAGCTTGATGAATACCTAAAGGAAATGAATTCCAAGAAGTAGAAAGGTAGTGATTATGCCCCCCTGACATTTTATCTAGACTTTGGTAACGATGTTTATACAGGTAAACTGATATTCTATGGTCTTTTCTCTCACCCTATGAATTTGGACGTTCATTCTTTTCCTATTAACATAAAAAAGCTGAAGGTTATGTAATAGTTTTCTGATCAAATGGTATAAAGTGAATAACTTTCATTAGCCATTGTAATAGGGTAGTATAAAGTTAAATGCATAAGGTTGAAGACCAGTCAGATTGTAAATTTAGGCAGATTGATCTTACATATTACAAGATCTCCATATGTACATTTAAGAATATATTTTGTACCCTTTCAGCCAAAGAAATATTTTGCAAACCATCTTAAATTTACAACCAATCTATATTTTAACTTGGATCTAAACTGAGTATGCTGTTGTCTGTAGTTCGGGTTTGTCTCGT。

3.PCR扩增：首先加样，加样量如下：脊尾白虾基因组DNA(50ng/μL)，2μL；10X PCRBuffer，2.0μL；Mg²⁺ (25mmol/L)，2μL；Taq酶(5U/μL)，0.2 μL；dNTP(各2.5mmol/L)，2μL；本发明的引物(各10mmol/μL)，正反引物各2μL；加灭菌水至20μL。其次，进行PCR反应，其PCR扩增仪程序参数为：94 ℃变性5min；94℃ 40sec，55℃ 40sec，72℃ 40sec，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

4、PCR产物的检测和酶切：PCR反应结束后，将PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳仪的电压为160V，电泳时间在20-30分钟左右，即可终止；然后利用限制性内切酶EcoR I进行酶切反应，酶切反应体系20μL，包括PCR产物5μL；10X Buffer 2.0μL；EcoR I内切酶1μL；加ddH₂O至20μL。酶切反应温度37℃保温1小时，然后将酶切反应产物在1%琼脂糖凝胶电泳中进行电泳分离，160V电压电泳时间25分钟左右，利用全自动凝胶成像仪进行拍照，即可得到脊尾白虾在EC16 SNP位点的多态性图谱。如图1所示，酶切电泳图谱结果显示1-4、7-10、13-20为杂合个体，5-6、11-12为纯合个体。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120> 一种脊尾白虾EC16 SNP标记的检测方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cccgaacaag aaaacacc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acgagacaaa cccgaact 18

<210> 3

<211> 515

<212> DNA

<213> 脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)

<400> 3

cccgaacaag aaaacaccaa cagcagctga gttagatgct gagcttgatg aatacctaaa 60

ggaaatgaat tccaagaagt agaaaggtag tgattatgcc cccctgacat tttatctaga 120

ctttggtaac gatgtttata caggtaaact gatattctat ggtcttttct ctcaccctat 180

gaatttggac gttcattctt ttcctattaa cataaaaaag ctgaaggtta tgtaatagtt 240

ttctgatcaa atggtataaa gtgaataact ttcattagcc attgtaatag ggtagtataa 300

agttaaatgc ataaggttga agaccagtca gattgtaaat ttaggcagat tgatcttaca 360

tattacaaga tctccatatg tacatttaag aatatatttt gtaccctttc agccaaagaa 420

atattttgca aaccatctta aatttacaac caatctatat tttaacttgg atctaaactg 480

agtatgctgt tgtctgtagt tcgggtttgt ctcgt 515

Claims (7)

1.用于检测脊尾白虾EC16位点SNP标记的引物，其特征在于，所述正向引物序列如SEQID NO.1所示，所述反向引物序列如SEQ ID NO.2所示。

2.脊尾白虾EC16位点SNP标记的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

首先提取不同地理群或脊尾白虾群内个体的基因组DNA备用；

利用脊尾白虾转录组文库中的含有EC16 SNP标记的核心序列，在其序列两端设计特异性引物；

使用该引物对脊尾白虾不同地理群或脊尾白虾群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行检测；

利用PCR产物进行限制性内切酶酶切反应，根据出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，并获得脊尾白虾的遗传多态性图谱；

所述特异性引物序列分别为：正向引物序列为SEQ ID NO.1所示，反向引物序列为SEQID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，PCR扩增体系为：脊尾白虾基因组DNA100ng；10X PCR Buffer，2.0μL；25mmol/L Mg²⁺，2μL；Taq酶，1U；dNTP，2μL；正反引物各2μL；加灭菌水至20μL。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，PCR反应程序为：94℃变性5min；94℃40sec，55℃ 40sec，72℃ 40sec，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，PCR产物的检测和酶切：将PCR产物在1％的琼脂糖凝胶进行电泳，160V恒电压电泳20-30分钟进行检测；PCR产物检测合格后，利用限制性内切酶EcoR I进行酶切反应，酶切反应体系20μL，包括PCR产物5μL，10X Buffer2.0μL，EcoR I内切酶1μL，加ddH₂O 至20μL；酶切反应温度37℃保温1小时，然后进行琼脂糖凝胶电泳，160V恒电压电泳25分钟进行检测，最后利用全自动凝胶成像仪进行拍照可得到脊尾白虾在EC16 SNP位点的多态性图谱。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述EC16 SNP标记的核心序列如SEQID NO.3所示。

7.脊尾白虾EC16 SNP位点遗传多态性图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

首先提取不同地理群或脊尾白虾群内个体的基因组DNA备用；

利用脊尾白虾转录组文库中的含有EC16 SNP标记的核心序列，在其序列两端设计特异性引物；

使用该引物对脊尾白虾不同地理群或脊尾白虾群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行检测；

利用PCR产物进行限制性内切酶酶切反应，根据出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，并获得脊尾白虾的遗传多态性图谱；

所述特异性引物序列分别为：正向引物序列为SEQ ID NO.1所示，反向引物序列为SEQID NO.2所示。