CN117025797A - 与奶牛乳房炎抗性相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了与奶牛乳房炎抗性相关的SNP分子标记及其应用，属于奶牛育种标记物领域。本发明提供的与奶牛乳房炎抗性相关的SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，多态性位点位于如SEQ ID No.1所示序列的第129位，多态性为C或T。该分子标记能够在不同遗传背景下准确预测奶牛乳房炎抗性特性，可用于鉴别高乳房炎抗性性状的奶牛，提高分子设计育种的效率。且根据上述SNP位点的鉴定结果，养殖人员可以选择有利的基因型个体留种，从而改善奶牛群体的乳房炎抗性性状，提高奶牛群体的乳房炎抗性，降低治疗成本，提高牧场经济效益。

Description

与奶牛乳房炎抗性相关的SNP分子标记及其应用
技术领域
本发明属于奶牛育种标记物领域，具体涉及一种与奶牛乳房炎抗性相关的SNP分子标记及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
乳房炎是奶牛生产中最常见和最昂贵的疾病之一，它会降低牛奶产量和质量，导致牧场治疗费用增加，并对动物福利产生负面影响。乳房炎的发病率、严重程度和结局受多种因素的影响，包括病原体类型、宿主免疫和环境。在宿主方面，乳房炎抗性、奶牛年龄和泌乳阶段影响乳房炎风险。通过分子育种手段从遗传角度提高奶牛对乳房炎的抗性是降低乳房炎发病率的根本途径之一。
早期的研究报道了影响牛临床乳房炎的QTL(quantitative trait locus的缩写，中文可以翻译成数量性状座位或者数量性状基因座)，然而这些研究并不能确定特定的候选基因变异。近年来，随着高密度SNP芯片数据的增加，识别致病突变的机会越来越高。通过关联作图来识别因果变异或将QTL分配给一个或几个基因，可能有助于识别控制乳房炎抗性的基因，如NPFFR2基因、TRAPPC基因、ARHGAP39基因、LY6K基因、LY6D基因、LYNX1基因等。然后，奶牛乳房炎抗性是一个多基因控制的复杂性状，仍有必要进一步挖掘相关基因位点。
按照牛参考基因组UMD3.1版本的注释，SH3PXD2B基因位于牛参考基因组20号染色体(UMD3.1:GK000020.2)的4010453-4094221bp区域，位于反义链上。其Ensembl version的基因名为ENSBTAG00000009019.5。该基因编码1个转录本，转录本名称为SH3PXD2B-201，转录本ID为ENSBTAT00000011874.5，该转录本有13个外显子，其中可编码的外显子有13个，转录本长度为2667nt，编码蛋白质长度为888个氨基酸残基。该基因编码一个以PX结构域和四个Src同源结构域为特征的适配蛋白。所编码的蛋白质是足体形成所必需的，并参与许多细胞类型的细胞粘附和迁移。参与侵入足和足体形成和细胞外基质降解的转换蛋白。结合基质金属蛋白酶(ADAMs)、NADPH氧化酶(NOXs)和磷酸肌苷。作为一种组织者蛋白，允许NOX1或nox3依赖性活性氧(ROS)的产生和ROS的定位。研究表明SH3PXD2B基因在脂肪细胞分化的早期有丝分裂克隆扩增中起作用，但是其对于奶牛乳房炎抗性的影响还没有报道。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供了与奶牛乳房炎抗性相关的SNP分子标记及其应用。
为了实现该技术目的，本发明设计筛选与奶牛乳房炎抗性相关的分子标记辅助育种，从而降低奶牛乳房炎发病率，降低治疗成本，提高奶牛盈利能力。本发明将SH3PXD2B基因作为奶牛乳房炎抗性候选基因，研究其变异位点与奶牛乳房炎抗性性状的相关性。
具体的，本发明提供以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种与奶牛乳房炎抗性相关的SNP分子标记，所述分子标记来自奶牛SH3PXD2B基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，多态性位点位于如SEQ IDNo.1所示序列的第129位，多态性为C或T。
以上所述的SNP分子标记的多态性位点位于牛20号染色体序列(牛参考基因组版本为UMD3.1，NCBI的Assembly accession GCA_000003055.3，染色体编号为GK000020.2)的第4011529bp处。
以上所述的奶牛SH3PXD2B基因位于牛参考基因组UMD3.1的Chromosome 20:4011529，名称为rs133650873，所述的SNP分子标记的多态性位点位于转录本的第1654nt，对应的密码子为GGC或AGC，编码甘氨酸(G)或丝氨酸(S)，属于错义突变，编码对应的氨基酸位于整个蛋白质的552位(一共888个氨基酸残基)。
本发明通过PCR方法提供一个奶牛乳房炎抗性性状相关SH3PXD2B基因，通过Bovine SNP50芯片在该基因的第12个外显子上鉴定到1个SNP位点。在荷斯坦牛群体中，针对SH3PXD2B基因第12个外显子上的1个SNP的基因型与该群体牛的乳房炎抗性性状基因组育种值进行关联分析，分析结果表明该SNP分子标记与奶牛乳房炎抗性显著相关。上述SNP分子标记能够在不同遗传背景下准确预测奶牛乳房炎抗性特性，可用于鉴别高乳房炎抗性性状的奶牛，提高分子设计育种的效率。且根据上述SNP位点的鉴定结果，养殖人员可以选择有利的基因型个体留种，从而改善奶牛群体的乳房炎抗性性状，提高奶牛群体的乳房炎抗性，降低治疗成本，提高牧场经济效益。
本发明采用的SNP鉴定方法如下：通过Bovine SNP50芯片在奶牛群体中进行基因型鉴定，发现SH3PXD2B基因第12个外显子上存在1个SNP(chr20:g.4011529C>T)(图1)；通过奶牛群体基因型和奶牛乳房炎抗性性状基因组估计育种值的关联分析，证明该SNP位点与奶牛乳房炎抗性性状显著相关。
基于上述研究结果，SH3PXD2B基因第12个外显子上所述SNP分子标记可作为鉴定奶牛高乳房炎抗性性状和辅助育种的标记物，可用于筛选乳房炎抗性更高的亲本个体，有效提高母牛的使用年限，节约治疗成本，降低养殖成本，提高牧场收益。另外上述分子标记物的相关检测试剂还可以开发为中国荷斯坦奶牛繁育相关产品。
SEQ ID NO:1：
TTTGGAGATAGGTCGCAGGCTGGGCTTCTTCACCTCCTTGGCCAGCACTCTGTGGCCGCACTCCAGCCCTGTCTCATTTTTCAGCTGGAACAACTTGCTTTTCTCAGGTTTGGGCTCTGCTTTCCTGCCGTCCCGGGCTGGCAGGGCGTGTTTGGCTGGGATCATTGGCAAGATCATGCCAGGTGGCTTGGGTGAGGAACCCCTGAACTGCTCCATCCTCTGCCGCTCCTGCAGTTCCTCTTCCGACTTGATGATGGATTCTTTCCGGGGAGGGAGGCTGGGTTTCTCCTCCAGGTCGGGGTCTGAGATCTCCTCGTAGCCTGCACACGAAGACGTGTCTGAAGACGCCTTCCTCAGCACCTCCTTACCACCCTTCCAGTCTTTGGCCCACGGCGTCCCGGAGTCCCCTGCGCTGTGCGGGGCGTCGGGCAGGGGCCGGGAGGGGCCGCTGGCTTCACTGCCCGAGCTGTTTTCCATTGCTGCTGCATCCCCCAGCCGGAGCTGTGCCACCTCGTTGGGCAACGGAGCCAGGAAGTTGGGTCTTGAGGCATTGCTAGTCTTCTTATACTTGTCAATGAAGGTCGCTGGGGCCCATCCCTCCTTATCTTCAATCTGAATGTACCACCAGCCGCTTAAGTTCTTCTCAATCACCTGAAAGGGAGGGCAGAGGAAAGCTCTGAGTAAGAATGGAGGCAGGGCCA。
在本发明的一些实施例中，所述SNP分子标记为以奶牛基因组为模板、由序列如SEQ ID No.2-3所示的引物扩增得到的。
SEQ ID NO.2：5’-TTTGGAGATAGGTCGCAGGC-3’；
SEQ ID NO.3：5’-TGGCCCTGCCTCCATTCTTA-3’。
在本发明的一些实施例中，所述SNP分子标记的多态性位点为C时，对应于高乳房炎抗性。
本发明的第二个方面，提供一组用于检测奶牛乳房炎抗性的引物对，所述引物对用于检测第一个方面所述的SNP分子标记。
根据以上提供的SNP分子标记所在基因组的位置及其上下游序列，本领有技术人员可以开发用于扩增该SNP分子标记的各种类型的引物。
上述引物可以为任何能够用于检测SNP分子标记基因型的引物类型。
优选的，所述引物对包含SEQ ID No.2-3所示的引物，其中，SEQ ID No.2为上游引物，SEQ ID No.3为下游引物。
以上所述的引物能够针对上述SNP分子标记实现高效的扩层和基因分型。
本发明的第三个方面，提供一种用于检测奶牛乳房炎抗性的试剂盒，所述试剂盒包括以上所述的引物对。
以上所述的试剂盒还可以包含采样工具、用于PCR扩层的试剂，所述试剂包括但不限于、DNA聚合酶、PCR反应缓冲溶液、探针、dNTP、Mg2+、水等。
上述试剂可单独包装或经混合后作为预混液提供。
本发明的第四个方面，提供以上所述的SNP分子标记或其检测试剂在以下1)-4)中的任意一种应用；
1)在检测或辅助检测奶牛乳房炎抗性中的应用；
2)在筛选或鉴定奶牛乳房炎抗性优势品系中的应用；
3)在奶牛乳房炎抗性分子标记辅助育种中的应用；
4)在奶牛乳房炎抗性的种质资源改良中的应用。
所述检测试剂为以上所述的引物对或试剂盒。
优选的，以上所述的应用，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，多态性位点位于如SEQ ID No.1所示序列的第129位，多态性为C或T。
具体的，所述SNP分子标记为以奶牛基因组为模板、由序列如SEQ ID No.2-3所示的引物扩增得到。
以上所述SNP分子标记的多态性位点为C时，对应于高乳房炎抗性。
优选的，所述引物对包含序列如SEQ ID No.2-3所示的引物，其中，SEQ ID No.2为上游引物，SEQ ID No.3为下游引物。
本发明的第五个方面，提供一种筛选或鉴定奶牛乳房炎抗性优势品系的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测奶牛的基因组DNA；
(2)以待测奶牛的基因组DNA为模版，采用以上所述的引物对，通过PCR反应扩增奶牛SH3PXD2B基因的外显子区域；
(3)检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中129bp处的碱基为C，则待测奶牛属于乳房炎抗性高的奶牛优势品系。
优选的，所述待测奶牛为中国荷斯坦奶牛、三河牛、新疆褐牛或草原红牛中的一种，进一步优选为中国荷斯坦奶牛。
优选的，所述引物对包含序列如SEQ ID No.2-3所述的引物，其中，SEQ ID No.2为上游引物，SEQ ID No.3为下游引物。
本发明的第六个方面，提供一种奶牛辅助育种的方法，包括以下步骤：
采用通过第五个方面所述的方法获得优势基因型的奶牛个体作为亲本进行育种。
本发明的第七个方面，提供一种鉴定高乳房炎抗性奶牛的方法，包括如下步骤：
检测与奶牛乳房炎抗性相关的SNP分子标记的基因型；所述SNP分子标记的多态性位点位于UMD3.1参考基因组第20号染色体序列的第4011529bp处，多态性为C或T；
所述SNP分子标记的多态性位点为C，对应于高乳房炎抗性。
优选的，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，多态性位点位于如SEQ ID No.1所示序列的第129位，多态性为C或T。
具体的，所述SNP分子标记为以奶牛基因组为模板、由序列如SEQ ID No.2-3所示的引物扩增得到。
上述方法中，检测SNP分子标记的基因型优选采用以下方法：
以待测奶牛的基因组为DNA模板，采用序列如SEQ ID No.2-3所示的引物进行PCR扩增，对PCR扩增产物基因型进行检测。
本发明的有益效果为：
本发明首次公开了与奶牛乳房炎抗性相关的SNP分子标记，其来自奶牛SH3PXD2B基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，多态性位点位于如SEQ ID No.1所示序列的第129位，多态性为C或T，其能够提高增加奶牛乳房炎抗性，可作为鉴定奶牛高乳房炎抗性性状和辅助育种的标记物，可用于筛选乳房炎抗性更高的亲本个体，有效提高母牛的使用年限，节约治疗成本，降低养殖成本，提高牧场收益。另外上述分子标记物的相关检测试剂还可以开发为中国荷斯坦奶牛繁育相关产品。
本发明利用牛SH3PXD2B基因第12个外显子上的1个SNP位点的信息，采用分子生物学相关技术鉴别奶牛在该位点的基因型，实现对具有高乳房炎抗性的基因型个体的早期选择。本发明鉴别了1个SNP位点，通过分子生物学相关技术检测个体奶牛SH3PXD2B基因在此位点的基因型，并且通过和奶牛乳房炎抗性性状的估计育种值的关联分析，选择有利的基因型个体留种，可以提高SH3PXD2B基因高乳房炎抗性基因型在奶牛群体中的频率，从而降低奶牛群体乳房炎的发病率，提高奶牛群体的使用年限，降低养殖成本，增加牧场的经济效益，为提高奶牛的乳房炎抗性提供了一种新的方法。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为SH3PXD2B基因第12个外显子序列上的chr20:g.4011529C>T突变位点的Sanger测序峰图。
具体实施方式
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
以下实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可以从商业途径得到。
实施例1
下面对本发明的影响奶牛乳房炎抗性SH3PXD2B基因的第12个外显子及其分子标记与应用作以下详细说明。具体方案是：
1.筛选SH3PXD2B基因作为奶牛乳房炎抗性候选基因
(1)在4个规模化养殖场中采集1069头中国荷斯坦母牛血液或毛囊样本
在全国4个牧场采集中国荷斯坦牛样品，牧场所在地点和每个牧场采集的样品数见表1。
表1.采集样品的牧场所在地点及采集样品数目
牧场所在地点 样品数目 牧场所在地点 样品数目
山东东营 268 广东华美 196
新疆沙湾 200 内蒙古通辽 399
(2)使用Illumina BovineSNP50芯片测定所采集样品的基因型。基因型的测定由纽勤生物科技(上海)有限公司执行，共获得47843个SNP标记位点的基因型。
(3)根据基因型估计每个个体的乳房炎抗性基因组育种值。基因组估计育种值由纽勤生物科技(上海)有限公司执行。
(4)使用GEMMA软件基于基因型数据，针对乳房炎抗性基因组育种值进行全基因组关联分析，分析模型使用混合线性模型，牧场和牛月龄作为协变量。使用FDR方法进行多重检验校正。关联分析结果显示最为显著的1个SNP位点位于SH3PXD2B基因上的第12位外显子上，显著性P值为1.172e-21。
2.SH3PXD2B基因第12位外显子上优势基因型的鉴定
在采集到的1069头中国荷斯坦牛中，鉴定到具有CC纯和基因型的个体有288个，其乳房炎抗性基因组估计育种值的均值为0.77；具有CT基因型的个体有488个，其乳房炎抗性基因组估计育种值的均值为0.33；具有TT基因型的个体有286个，其乳房炎抗性基因组估计育种值的均值为-0.0056。在基因组遗传评估中，乳房炎抗性基因组估计育种值越高越好，因此CC基因型为优势基因型。
3.牛SH3PXD2B基因部分序列扩增
(1)牛尾部静脉血液采集
选择高乳房炎抗性的牛和低乳房炎抗性的牛为试验材料，采集牛的尾部静脉血液。
(2)基因组DNA提取
取全血500μL，加入500μL STE裂解缓冲液，依次加入50μL 10％SDS、5μL蛋白酶K(20mg/mL)，56℃裂解约3h，至裂解液澄清。加入同体积饱和酚(250μL)，氯仿/异戊醇(24:1)(250μL)，轻轻晃动20min，12000rpm离心10min。取上清，重复上述步骤，直至水相与有机相之间无蛋白质层。取上清，加入同体积氯仿/异戊醇，轻晃20min，12000rpm离心10min。取上清，加入1/10体积3M NaAc(pH5.2)和2倍体积冷无水乙醇，摇匀后-20℃静置20min，12500rpm离心20min。将核酸沉淀于管底。弃上清，70％乙醇洗涤沉淀。收集沉淀，空气中干燥至乙醇全部挥发。加入20μL TE(含RNaseA)溶解DNA，37℃静置约30min后，4℃保存。1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品，紫外分光光度计检测浓度及纯度。
(3)引物设计
根据牛SH3PXD2B基因的基因序列，设计一对特异引物。其中，
正向引物为SH3PXD2B-5F(SEQ ID NO.2)：
5’-TTTGGAGATAGGTCGCAGGC-3’；
反向引物为SH3PXD2B-3R(SEQ ID NO.3)：
5’-TGGCCCTGCCTCCATTCTTA-3’；
(4)复合酶链式反应
用此引物进行PCR扩增，反应体系如下：10×Buffer 1μL，2.5mM dNTP 0.8μL，2.5mM MgCl2，0.6μL，正向引物(10μM)0.1μL，反向引物(10μM)0.5μL，Taq酶(5U/μL)0.1μL，模板0.5μL，LCGreen饱和荧光染料0.7μL，加H2O补足至10μL。
扩增反应在Applied Biosystem PCR系统上完成，反应条件如下：95℃5min；95℃30s，59℃30s，72℃1min；35个循环；72℃5min。
通过Sanger测序测定PCR产物的基因型。
选择奶牛核心群个体，利用上述分子生物学相关技术检测SH3PXD2B基因chr20:g.4011529C>T位点的基因型，选择有利的基因型个体留种，可改良奶牛群体的乳房炎抗性性状，降低奶牛群体乳房炎发病率，降低养殖成本，增加养殖收益，为培育高乳房炎抗性的优良奶牛新品系奠定基础。
实施例2
采用Sanger测序方法对SH3PXD2B基因第12个外显子的1个SNP位点在中国荷斯坦牛群体中的基因型与等位基因频率分布情况进行了检测，其结果见表2，其包括多个牧场中的中国荷斯坦牛。检测结果表明在中国荷斯坦奶牛群体中存在3种基因型；在所有检测的群体中，CC基因频率为62.6％，CT基因型频率为33.5％，TT基因型频率为3.9％，CC基因型为优势基因型(见表2)。
表2牛SH3PXD2B基因在中国荷斯坦牛群体中的分布结果
表2说明：上述群体材料均为中国荷斯坦牛群体，其中：群体1为甘肃某牧场的中国荷斯坦牛群体，群体2为河北某牧场的中国荷斯坦牛群体，群体3为山东某牧场的中国荷斯坦牛群体。
为了确定牛SH3PXD2B基因型与牛乳房炎抗性是否相关，选择971头中国荷斯坦牛用于SH3PXD2B基因型与乳房炎抗性基因组估计育种值的关联分析。CC基因型个体的平均基因组育种值为0.4097，CT基因型个体的平均基因组育种值为0.067，TT基因型个体的平均基因组育种值为-0.1601。使用PLINK v1.90软件分析不同基因型与奶牛乳房炎抗性性状的相关性，结果显示基因型与基因组育种值之间为显著相关(P值为1.974e-05)。
综上，本发明鉴别了1个SNP位点，通过分子生物学相关技术检测个体奶牛SH3PXD2B基因在此位点的基因型，并且通过和奶牛乳房炎抗性性状的基因组估计育种值的关联分析，选择有利的基因型个体留种，可以提高SH3PXD2B基因乳房炎抗性优势基因型在奶牛群体中的频率，从而提高奶牛群体的乳房炎抗性，降低奶牛群体的乳房炎发病率，降低乳房炎治疗成本，降低养殖成本，提高养殖效益，为奶牛的乳房炎抗性遗传改良提供了一种新的方法。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种与奶牛乳房炎抗性相关的SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记来自奶牛SH3PXD2B基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，多态性位点位于如SEQ ID No.1所示序列的第129位，多态性为C或T。
2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记为以奶牛基因组为模板、由序列如SEQ ID No.2-3所述的引物扩增得到的。
3.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的多态性位点为C，对应于高乳房炎抗性。
4.一组用于检测奶牛乳房炎抗性的引物对，其特征在于，所述引物对用于检测权利要求1-3任一所述的SNP分子标记。
5.如权利要求4所述的引物对，其特征在于，所述引物对包含SEQ ID No.2-3所示的引物，其中，SEQ ID No.2为上游引物，SEQ ID No.3为下游引物。
6.一种用于检测奶牛乳房炎抗性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求4或5所述的引物对。
7.权利要求1-3任一所述的SNP分子标记或权利要求4或5所述的引物对或权利要求6所述的试剂盒在以下1)-4)中的任意一种应用；
1)在检测或辅助检测奶牛乳房炎抗性中的应用；
2)在筛选或鉴定奶牛乳房炎抗性优势品系中的应用；
3)在奶牛乳房炎抗性分子标记辅助育种中的应用；
4)在奶牛乳房炎抗性的种质资源改良中的应用。
8.一种筛选或鉴定奶牛乳房炎抗性优势品系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测奶牛的基因组DNA；
(2)以待测奶牛的基因组DNA为模版，采用权利要求4或5所述的引物对，通过PCR反应扩增奶牛SH3PXD2B基因的外显子区域；
(3)检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中129bp处的碱基为C，则待测奶牛属于乳房炎抗性高的奶牛优势品系；
优选的，所述待测奶牛为中国荷斯坦奶牛、三河牛、新疆褐牛或草原红牛中的一种，进一步优选为中国荷斯坦奶牛。
9.一种奶牛辅助育种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用通过权利要求8所述的方法获得优势基因型的奶牛个体作为亲本进行育种。
10.一种鉴定高乳房炎抗性奶牛的方法，其特征在于，包括如下步骤：
检测与奶牛乳房炎抗性相关的SNP分子标记的基因型；所述SNP分子标记的多态性位点位于UMD3.1参考基因组第20号染色体序列的第4011529bp处，多态性为C或T；
所述SNP分子标记的多态性位点为C，对应于高乳房炎抗性。
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