CN109153967B - 植物乳杆菌的培养物的制造方法 - Google Patents

植物乳杆菌的培养物的制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种微生物的培养物的制造方法，其用于得到IL‑10与IL‑12的产生量的比例(IL‑10/IL‑12的比例)大、抗炎性优异的培养物。一种植物乳杆菌的培养物的制造方法，使用含有不饱和脂肪酸酯的培养基，将植物乳杆菌培养至不超过对数生长期终点的时刻，得到植物乳杆菌的培养物。不饱和脂肪酸酯为单或多不饱和脂肪酸与多元醇反应而成的酯、或该酯的衍生物。不饱和脂肪酸酯的优选的一例为单油酸酯。

Description

植物乳杆菌的培养物的制造方法
技术领域
本发明涉及植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的培养物的制造方法。
背景技术
白细胞介素(IL)-10是由免疫细胞(树突细胞、巨噬细胞等)产生的抗炎细胞因子，在生物体内担负抑制过度炎症的重要作用。即，通过诱导IL-10的产生，能够改善由炎症引起的疾病等。例如有通过给予IL-10的产生诱导活性高的乳酸菌来抑制肠炎的报道(非专利文献1～2)。另外，有报道通过基因重组使IL-10过量表达，由此来介导炎症的抑制、抑制心肌梗塞(非专利文献3)
另一方面，白细胞介素(IL)-12是由免疫细胞产生的细胞因子，这点上与IL-10相同，但是在生物体内发挥促进炎症的功能这点上与IL-10不同。
因此，IL-10与IL-12的产生量的比例(IL-10/IL-12的产生量的比例)也与IL-10的产生诱导活性同样地被作为抗炎活性的重要指标。即，若能筛选出IL-10的产生诱导活性高、并且IL-12的产生诱导活性低的菌株(乳酸菌等)来使用，则可提供免疫调节活性(抗炎功能)高的商品。并且，作为其结果，除了肠炎、心肌梗塞等疾病以外，还可以期待由各种炎症引起的疾病(代谢综合征、癌症、自身免疫疾病、神经改性疾病等)的改善。
作为涉及IL-10与IL-12的产生量的比例的技术，在专利文献1中记载了一种方法，其中，通过下述方法来制造白细胞介素产生调节剂，所述白细胞介素产生调节剂含有属于双歧杆菌(Bifidobacterium)属的微生物的破碎物，用于自身免疫疾病或消化道疾病的预防和/或治疗，具有维持或促进白细胞介素-10的产生的作用和维持或抑制白细胞介素-12的产生的作用，该方法包括：将属于双歧杆菌属的微生物以每1ml试样2600焦耳以上的能量进行超声波破碎的工序；和从破碎的微生物中除去未破碎物而制备破碎物的工序。
根据该方法，作为白细胞介素-10与白细胞介素-12的产生量的比例(白细胞介素-10/白细胞介素-12的产生量的比例)，能够得到10以上的值。
另外，作为用于促进白细胞介素(IL)-10的产生的试剂，在专利文献2中记载了一种白细胞介素10产生促进剂，其是(A)不具有白细胞介素12产生诱导能力的细菌或酵母或者微生物处理物与(B)具有白细胞介素12产生诱导能力的细菌组合而成的。另外，在专利文献2中，作为上述(A)的示例，记载了植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)等。
通常，在以商业规模对乳酸菌等进行培养、并将其培养物用作商品的原料的情况下，其培养条件要重视乳酸菌等的增殖性(菌体的高浓度化)来设定。即，通常，作为能够使乳酸菌等的菌体的浓度最大化的培养条件，选择能够使乳酸菌等高浓度化的培养基的组成等，在使用这样的培养基的基础上，将乳酸菌等培养至超过对数生长期的、稳定期的某一时刻。
关于乳酸菌等的培养期间，例如，在专利文献3中记载了：在面包类的制造方法中，在酵母和乳酸菌经过对数生长期直到稳定期结束的期间进行面包生坯状的生坯的发酵。
另一方面，还已知将进行培养直至稳定期的情况和进行培养至未达到稳定期的对数生长期的情况进行比较的论文。
例如，在非专利文献4中报道了：与稳定期的植物乳杆菌(L.plantarum)WCFS1相比，对数生长期的植物乳杆菌WCFS1在来源于人的外周血单核细胞(PBMC)中强烈诱导IL-10的产生。
另外，在非专利文献5中报道了：对受试者(8位)给予对数生长期和稳定期的植物乳杆菌WCFS1，利用微阵列对十二指肠粘膜的基因的表达进行网罗性分析，结果，稳定期的植物乳杆菌WCFS1诱导了与炎症介质NF-κB的活化相关的基因簇的表达，而对数生长期的植物乳杆菌WCFS1诱导了与抗炎性相关的基因簇的表达。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第4979689号公报
专利文献2：日本特开2008-31153号公报
专利文献3：日本特开2007-89497号公报
非专利文献
非专利文献1：O'Mahony L,McCarthy J,Kelly P,Hurley G,Luo F,Chen K,O'Sullivan GC,Kiely B,Collins JK,Shanahan F,Quigley EM.2005.Lactobacillus andbifidobacterium in irritable bowel syndrome:symptom responses andrelationship to cytokine profiles.Gastroenterology 128:541-551.
非专利文献2：Sokol H,Pigneur B,Watterlot L,Lakhdari O,Bermúdez-HumaránLG,Gratadoux JJ,Blugeon S,Bridonneau C,Furet JP,Corthier G,Grangette C,Vasquez N,Pochart P,Trugnan G,Thomas G,Blottière HM,DoréJ,Marteau P,Seksik P,Langella P.2008.Faecalibacterium prausnitzii is an anti-inflammatorycommensal bacterium identified by gut microbiota analysis of Crohn diseasepatients.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:16731-16736.
非专利文献3：Yu Y,Zhang ZH,Wei SG,Chu Y,Weiss RM,Heistad DD,FelderRB.2007.Central gene transfer of interleukin-10 reduces hypothalamicinflammation and evidence of heart failure in rats after myocardialinfarction.Circ.Res.101:304-312.
非专利文献4：van Hemert S,Meijerink M,Molenaar D,Bron PA,de Vos P,Kleerebezem M,Wells JM and Marco ML.2010.Identification of Lactobacillusplantarum genes modulating the cytokine response of human peripheral bloodmononuclear cells.BMC Microbiol.10:293.
非专利文献5：van Baarlen P,Troost FJ,van Hemert S,van der Meer C,deVos WM,de Groot PJ,Hooiveld GJ,Brummer RJ and Kleerebezem M.2008.DifferentialNF-kappaB pathways induction by Lactobacillus plantarum in the duodenum ofhealthy humans correlating with immune tolerance.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 106:2371-2376.
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供一种微生物的培养物的制造方法，其用于得到IL-10与IL-12的产生量的比例(IL-10/IL-12的比例)大、抗炎性优异的培养物。
[用于解决课题的手段]
本发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，在使用含有不饱和脂肪酸酯的培养基，将植物乳杆菌培养至不超过对数生长期终点的时刻，得到植物乳杆菌的培养物的情况下，与培养至稳定期的情况相比，在所得到的培养物中，关于IL-10与IL-12的产生量的比例(IL-10的产生量/IL-12的产生量)可得到更大的值，从而完成了本发明。
本发明提供以下的[1]～[12]项。
[1]一种植物乳杆菌的培养物的制造方法，其特征在于，使用含有不饱和脂肪酸酯的培养基，将植物乳杆菌培养至不超过对数生长期终点的时刻，得到植物乳杆菌的培养物。
[2]如上述[1]所述的植物乳杆菌的培养物的制造方法，其中，上述对数生长期终点以上述植物乳杆菌的培养时的菌数达到最高达到菌数的一半的菌数的时刻来表示。
[3]如上述[1]所述的植物乳杆菌的培养物的制造方法，其中，上述对数生长期终点以上述植物乳杆菌的中和培养时使用的中和剂的消耗量达到总消耗量的一半的量的时刻来表示。
[4]如上述[1]～[3]中任一项所述的植物乳杆菌的培养物的制造方法，其中，上述不饱和脂肪酸酯为单或多不饱和脂肪酸与多元醇反应而成的酯、或该酯的衍生物。
[5]如上述[4]所述的植物乳杆菌的培养物的制造方法，其中，上述单或多不饱和脂肪酸是碳原子数为16～23的单～三不饱和脂肪酸。
[6]如上述[4]或[5]所述的植物乳杆菌的培养物的制造方法，其中，上述不饱和脂肪酸酯为单油酸酯。
[7]如上述[6]所述的植物乳杆菌的培养物的制造方法，其中，上述不饱和脂肪酸酯为聚甘油脂肪酸酯、山梨醇酐脂肪酸酯或聚山梨醇酯。
[8]一种抗炎剂，其特征在于，含有利用上述[1]～[7]中任一项所述的制造方法制造的植物乳杆菌的培养物作为有效成分。
[9]一种植物乳杆菌的菌株的筛选方法，其特征在于，使用含有不饱和脂肪酸酯的培养基，将植物乳杆菌的多个菌株分别培养至不超过对数生长期终点的时刻，得到各菌株的培养物后，对所得到的各菌株的培养物进行白细胞介素-10的产生诱导活性的评价，基于该评价结果，从上述多个菌株中筛选抗炎作用的程度大的菌株。
[10]如上述[9]所述的植物乳杆菌的菌株的筛选方法，其中，除了上述白细胞介素-10的产生诱导活性的评价之外，还对白细胞介素-12的产生诱导活性进行评价，基于这些评价结果，从上述多个菌株中筛选抗炎作用的程度大的菌株。
[11]如上述[9]或[10]所述的植物乳杆菌的菌株的筛选方法，其中，上述对数生长期终点以上述植物乳杆菌的培养时的菌数达到最高达到菌数的一半的菌数的时刻来表示。
[12]如上述[9]或[10]所述的植物乳杆菌的菌株的筛选方法，其中，上述对数生长期终点以上述植物乳杆菌的中和培养时使用的中和剂的消耗量达到总消耗量的一半的量的时刻来表示。
发明的效果
根据本发明，能够得到IL-10与IL-12的产生量的比例(以下也称为“IL-10/IL-12的产生量的比例”或“IL-10/IL-12产生比例”)大的抗炎性优异的培养物(植物乳杆菌的培养物)。
附图说明
图1是示出使用含有不饱和脂肪酸酯的培养基(4种)、含有饱和脂肪酸酯的培养基(比较用；1种)、或者不含不饱和脂肪酸酯和饱和脂肪酸酯的培养基(对照用；1种)，对植物乳杆菌OLL2712进行培养的情况下的IL-10的产生量的图。
图2是示出图1所示的培养中的IL-12的产生量的图。
图3是示出图1所示的培养中的IL-10/IL-12的产生量的比例的图。
图4是示出使用含有不饱和脂肪酸酯以外的物质(抗坏血酸钠等；13种)的培养基或者不含该物质的培养基(对照用；1种)对植物乳杆菌OLL2712进行培养的情况下的IL-10的产生量的图。
图5是示出图4所示的培养中的IL-12的产生量的图。
图6是示出图4所示的培养中的IL-10/IL-12的产生量的比例的图。
图7是示出使用含有作为不饱和脂肪酸酯之一的单油酸十甘油酯的培养基(Q-17S(+))、或者不含单油酸十甘油酯的培养基(Q-17S(-))对植物乳杆菌OLL2712进行培养的情况下的、培养期间中的IL-10的产生量的经时变化的图。
图8是示出图7所示的培养中的、培养期间中的IL-12的产生量的经时变化的图。
图9是示出图7所示的培养中的、培养期间中的IL-10/IL-12的产生量的比例的经时变化的图。
图10是示出使用含有作为不饱和脂肪酸酯之一的单油酸十甘油酯的培养基(Q-17S(+))、或者不含单油酸十甘油酯的培养基(Q-17S(-))对植物乳杆菌OLL2770进行培养的情况下的、培养期间中的IL-10的产生量的经时变化的图。
图11是示出图10所示的培养中的、培养期间中的IL-12的产生量的经时变化的图。
图12是示出图10所示的培养中的、培养期间中的IL-10/IL-12的产生量的比例的经时变化的图。
具体实施方式
本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的培养物的制造方法为下述方法：使用含有不饱和脂肪酸酯的培养基，将植物乳杆菌培养至不超过对数生长期终点的时刻，得到植物乳杆菌的培养物。
作为植物乳杆菌(以下有时简称为植物乳杆菌)，可以使用任意的菌株。
作为植物乳杆菌的菌株的示例，可以列举OLL2712(保藏号：FERM BP-11262)、OLL2770等。
本发明中，作为脂肪酸酯，使用具有在分子中具有1个以上双键的化学结构(不饱和结构)的脂肪酸酯(不饱和脂肪酸酯)。在使用饱和脂肪酸酯的情况下，与使用不饱和脂肪酸酯的情况相比，IL-10与IL-12的产生量的比例(IL-10/IL-12)减小。
作为不饱和脂肪酸酯，例如可以列举单或多不饱和脂肪酸与多元醇反应而成的酯、或该酯的衍生物。
作为单不饱和脂肪酸，例如可以列举碳原子数为16～23的单不饱和脂肪酸。作为碳原子数为16～23的单不饱和脂肪酸，例如可以列举油酸(碳原子数：16)、异油酸(碳原子数：16)、棕榈油酸(碳原子数：19)、神经酸(碳原子数：23)等。
作为多不饱和脂肪酸，例如可以列举碳原子数为16～23的二～四不饱和脂肪酸。作为碳原子数为16～23的二～四不饱和脂肪酸，例如可以列举亚油酸(二元、碳原子数：16)、8,11-二十碳二烯酸(二元、碳原子数：19)、亚麻酸(三元、碳原子数：16)、桐酸(三元、碳原子数：16)、5,8,11-二十碳三烯酸(三元、碳原子数：18)、花生四烯酸(四元、碳原子数：18)等。
作为多元醇，例如可以列举聚甘油、山梨醇酐等。作为聚甘油，例如可以列举3～15个甘油结合而成的聚甘油。
作为3～15个甘油结合而成的聚甘油，例如可以列举三聚甘油、四聚甘油、五聚甘油、六聚甘油、七聚甘油、八聚甘油、九聚甘油、十聚甘油、十一聚甘油、十二聚甘油等。
作为单或多不饱和脂肪酸与多元醇反应而成的酯的衍生物，例如可以列举聚山梨醇酯等。
聚山梨醇酯是使环氧乙烷与单或多不饱和脂肪酸和山梨醇酐反应而成的山梨醇酐脂肪酸酯缩合而成的。此处，缩合的环氧乙烷的数量例如为15～25个。
本发明中，作为不饱和脂肪酸酯的优选的一例，可以列举单油酸酯(例如，1分子油酸与1分子聚甘油、山梨醇酐或聚山梨醇酯反应而成的单油酸酯)。
从提高IL-10与IL-12的产生量的比例(IL-10/IL-12)的观点出发，培养基中的不饱和脂肪酸酯的浓度优选为0.001重量％以上、更优选为0.01重量％以上、进一步优选为0.02重量％以上、进一步优选为0.03重量％以上、进一步优选为0.04重量％以上、特别优选为0.05重量％以上。
从避免因不饱和脂肪酸酯量的增大而导致培养成本增大的观点出发，培养基中的不饱和脂肪酸酯的浓度优选为1重量％以下、更优选为0.5重量％以下、进一步优选为0.3重量％以下、进一步优选为0.1重量％以下、特别优选为0.08重量％以下。
作为不饱和脂肪酸酯以外的培养基的成分，使用乳酸菌的培养中所用的一般的成分即可。
本发明中，植物乳杆菌被培养至不超过对数生长期终点的时刻。在进行培养至超过对数生长期终点的时刻的情况下，IL-10的产生量、以及IL-10与IL-12的产生量的比例(IL-10/IL-12)降低，无法得到本发明中作为目标的培养物。
对数生长期终点例如以下述(a)或(b)来表示。
(a)植物乳杆菌的培养时的菌数达到最高达到菌数的一半的菌数的时刻
(b)植物乳杆菌的中和培养时使用的中和剂的消耗量达到总消耗量的一半的量的时刻
上述(a)中，最高达到菌数是指，在超过对数生长期终点继续进行培养的情况下推测会达到的最高(最大)的菌数。
上述(b)中，中和培养是指，为了使菌的增殖保持于最佳状态，在培养液中添加中和剂(例如氢氧化钠)，使pH保持于一定范围的同时进行培养。
另外，中和培养时使用的中和剂的总消耗量是指，从培养开始时起至得到最高达到菌数时为止，添加中和剂以使pH为一定范围的情况下所添加的中和剂的总量。
上述(a)的“最高达到菌数”和上述(b)的“总消耗量”例如可以通过在实施本发明的制造方法的一例之前，在与该一例完全相同的条件(例如，植物乳杆菌的菌株的种类、不饱和脂肪酸酯及其他培养基成分的种类、培养时的温度等)下进行培养而预先确定。
植物乳杆菌的数量例如可以以含有植物乳杆菌的培养物的悬浮液的浊度的测定值来表示。作为浊度的测定手段，例如可以列举分光光度计。
植物乳杆菌的对数生长期的长度根据温度、培养基的成分组成等而不同，例如为9～11小时。
利用本发明的制造方法制造的植物乳杆菌的培养物例如可以用作抗炎剂的有效成分。
该培养物可以在下述方面与现有品相区别：IL-10与IL-12的产生量的比例(IL-10/IL-12的产生量的比例)比利用以往的制造方法制造的培养物(现有品)中的该比例大。
关于利用本发明的制造方法制造的培养物中IL-10/IL-12的产生量的比例，以使用不混配不饱和脂肪酸酯的培养基的情况下的该比例为基准，优选大20％以上、更优选大25％以上、特别优选大30％以上。
接着，对本发明的植物乳杆菌的菌株的筛选方法进行说明。
本发明的植物乳杆菌的菌株的筛选方法(以下有时简称为本发明的筛选方法)为下述方法：使用含有不饱和脂肪酸酯(例如单油酸酯)的培养基，将植物乳杆菌的多个菌株分别培养至不超过对数生长期终点的时刻，得到各菌株的培养物后，对所得到的各菌株的培养物进行白细胞介素-10的产生诱导活性的评价，基于该评价结果，从上述多个菌株中筛选抗炎作用的程度大的菌株。
本发明的筛选方法可以为下述方法：除了白细胞介素-10的产生诱导活性的评价，还对白细胞介素-12的产生诱导活性进行评价，基于这些评价结果，从多个菌株中筛选抗炎作用的程度大的菌株。
对白细胞介素-12和白细胞介素-10各自的产生诱导活性例如可以通过免疫学测定法(例如ELISA；Enzyme-linked immuno-sorbent assay，酶联免疫吸附检测)等进行评价。
[实施例]
[1.培养基中的不饱和脂肪酸酯的有无对IL-10/IL-12的产生量的比例的影响]
使用混配有维生素类、矿物质类、饱和脂肪酸酯类或不饱和脂肪酸酯类(单油酸酯类)的培养基，对植物乳杆菌OLL2712进行培养，研究这些各成分对抗炎活性的影响。
[实验方法1-1]植物乳杆菌OLL2712的制备方法
使用MRS培养基(Becton Dickinson公司)，对植物乳杆菌OLL2712进行静置培养(37℃、18小时、2次)，制备出植物乳杆菌OLL2712的赋活培养液。然后，使用乳清分解培养基，相对于乳清分解培养基100重量％，以1重量％的量添加植物乳杆菌OLL2712的赋活培养液后，静置培养(37℃、9小时)，制备出植物乳杆菌OLL2712的培养液。
此处，乳清分解培养基的组成(重量基准)为：乳清粉6.25％、乳清蛋白浓缩物(WPC80；蛋白质的含量：80％)、蛋白酶0.12％、酵母提取物0.50％、鱼肉提取物0.50％、硫酸锰四水合物0.01％、其他副原料0.05％(后添加；详细情况如后所述)或0％(对照用)、蒸馏水90.82％或90.87％(对照用)。
然后，对植物乳杆菌OLL2712的培养液进行离心分离处理(8000×g、15分钟)，收集植物乳杆菌OLL2712的菌体。然后，使用生理盐水将植物乳杆菌OLL2712的菌体清洗2次，接着使用蒸馏水将植物乳杆菌OLL2712的菌体清洗1次，然后将所得到的菌体悬浮于蒸馏水中，制备出植物乳杆菌OLL2712的悬浮液。接着，对植物乳杆菌OLL2712的悬浮液进行加热处理(75℃、60分钟)后，进行冷冻干燥处理(FD)，制备出植物乳杆菌OLL2712的冷冻干燥菌体。
然后，将植物乳杆菌OLL2712的冷冻干燥菌体悬浮于磷酸缓冲液(PBS)中后，使用细胞培养用的培养基进行稀释使其为10mg/mL，制备出植物乳杆菌OLL2712的稀释液。
此处，在上述乳清分解培养基(不包括上述副原料)中，以0.05重量％的量混配以下所示的副原料(全部18种类中的任意1种)，制备出全部18种类的乳清分解培养基。然后，通过与上述同等条件的处理制备出多种的植物乳杆菌OLL2712的稀释液。
[乳清分解培养基的副原料的种类]
(a)不饱和脂肪酸酯：4种
(a-1)单油酸十甘油酯：SUNSOFT Q-17S(商品名)、亲水性、太阳化学公司制
(a-2)单油酸五甘油酯：SUNSOFT A-171E(商品名)、亲水性、太阳化学公司制
(a-3)单油酸山梨醇酐酯：SUNSOFT No.81S(商品名)、亲油性、太阳化学公司制(a-4)单油酸聚氧乙烯山梨醇酐酯：Tween80(商品名)、亲水性、和光纯药工业公司制
(b)饱和脂肪酸酯：1种
(b-1)单硬脂酸十甘油酯：SUNSOFT Q-18S(商品名)、两亲性、太阳化学公司制
(c)维生素类：9种(抗坏血酸钠、硫胺盐酸盐、核黄素、烟酸、烟酰胺、泛酸钙、吡多辛盐酸盐、生物素、叶酸)
(d)矿物质类：4种(硫酸镁、氯化钙、硫酸铁、硫酸铁铵)
[实验方法1-2]免疫细胞的IL-10和IL-12的产生诱导活性的评价方法
使用自动磁细胞分离装置(auto MACS、Miltenyi Biotec公司)，从8周龄的雄性BALB/c小鼠(日本SLC公司)的骨髄中仅分离出未分化的树突细胞。然后，使用含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor；以下简称为GM-CSF)的RPMI培养基(Invitrogen公司)，对未分化的树突细胞进行培养(37℃、CO2(5％)的环境下、8天)，使其充分分化，由此制备出骨髄来源的树突细胞(BMDC；免疫细胞)。
然后，回收该树突细胞(BMDC)，以2.5×105细胞/孔的浓度接种到48孔板中后，按照以干燥重量计为50μg/mL的方式添加在上述各种乳清培养基中培养的植物乳杆菌OLL2712。然后，使用含有GM-CSF的RPMI培养基对上述48孔板进行培养(37℃、CO2(5％)的环境下、24小时)后，回收该培养上清。
然后，使用“小鼠IL-10ELISA套组”(Becton Dickinson公司)，测定该培养上清的IL-10浓度，并且使用“小鼠IL-12(p70)ELISA套组”(Becton Dickinson公司)，测定该培养上清的IL-12浓度。此处，关于IL-12浓度，对作为活性型的IL-12(p70)浓度进行测定。
[实验结果1]免疫细胞的IL-10和IL-12的产生诱导活性的评价结果
将上述实验的结果(4次实验的平均值和标准偏差等)示于表1～表6和图1～图6。
表1～表3(图1～图3)示出使用不饱和脂肪酸酯(4种中的任1种)、或饱和脂肪酸酯(1种；Q-18S)作为副原料的情况下的结果、以及未使用副原料的情况下(control)的结果。表4～表6(图4～图6)示出使用维生素类(9种中的任1种)或矿物质类(4种中的任1种)作为副原料的情况下的结果、以及未使用副原料的情况下(control)的结果。
[表1]
IL-10的产生量(单位：pg/mL)
副原料的种类 副原料的商品名 平均值 标准偏差 标准误差
未使用(control) - 3122 316 158
不饱和脂肪酸酯 Q-17S 2880 158 79
饱和脂肪酸酯 Q-18S 3157 303 152
不饱和脂肪酸酯 A171E 3128 95 48
不饱和脂肪酸酯 No.81S 3514 114 57
不饱和脂肪酸酯 Tween80 3146 277 139
[表2]
IL-12(p70)的产生量(单位：pg/mL)
副原料的种类 副原料的商品名 平均值 标准偏差 标准误差
未使用(control) - 312 15 8
不饱和脂肪酸酯 Q-17S 91 8 4
饱和脂肪酸酯 Q-18S 248 21 10
不饱和脂肪酸酯 A171E 106 11 6
不饱和脂肪酸酯 No.81S 96 13 6
不饱和脂肪酸酯 Tween80 104 7 4
[表3]
IL-10/IL-12(p70)的产生量的比例
副原料的种类 副原料的商品名 平均值 标准偏差 标准误差
未使用(control) - 10 1 1
不饱和脂肪酸酯 Q-17S 32 2 1
饱和脂肪酸酯 Q-18S 13 1 0
不饱和脂肪酸酯 A171E 30 3 1
不饱和脂肪酸酯 No.81S 37 6 3
不饱和脂肪酸酯 Tween80 30 4 2
由表1(图1)可以确认，即使在乳清分解培养基中混配脂肪酸酯(不饱和、饱和)来对植物乳杆菌OLL2712进行培养，免疫细胞的IL-10的产生诱导活性与对照(control)相比也未提高。
由表2(图2)可以确认，在乳清分解培养基中混配脂肪酸酯中作为饱和脂肪酸酯的单硬脂酸十甘油酯来对植物乳杆菌OLL2712进行培养时，免疫细胞的IL-12的产生诱导活性与对照(control)相比未大幅降低；并且，在乳清分解培养基中混配脂肪酸酯中不饱和脂肪酸酯(4种中的任1种)来对植物乳杆菌OLL2712进行培养时，免疫细胞的IL-12的产生诱导活性与对照(control)相比大幅降低。
由表3(图3)可以确认，在乳清分解培养基中混配不饱和脂肪酸酯(4种中的任1种)来对植物乳杆菌OLL2712进行培养时，与对照(control)或饱和脂肪酸酯相比，免疫细胞的IL-10/IL-12产生比例大幅增大。
[表4]
IL-10的产生量(单位：pg/mL)
副原料的种类 平均值 标准偏差
未使用(control) 3800 80
抗坏血酸钠 2967 76
硫铵盐酸盐 3697 189
核黄素 3683 244
烟酸 3519 223
烟酰胺 3198 114
泛酸钙 3184 219
吡多辛盐酸盐 3172 259
生物素 3257 236
叶酸 3091 97
硫酸镁 3810 105
氯化钙 3057 150
硫酸铁 2751 169
硫酸铁铵 3047 199
[表5]
IL-12(p70)的产生量(单位：pg/mL)
副原料的种类 平均值 标准偏差
未使用(control) 160 9
抗坏血酸钠 113 7
硫铵盐酸盐 185 3
核黄素 238 35
烟酸 245 16
烟酰胺 166 4
泛酸钙 194 15
吡多辛盐酸盐 173 6
生物素 147 9
叶酸 150 6
硫酸镁 135 7
氯化钙 139 14
硫酸铁 102 4
硫酸铁铵 112 13
[表6]
IL-10/IL-12(p70)的产生量的比例
副原料的种类 平均值 标准偏差
未使用(control) 24 2
抗坏血酸钠 26 2
硫铵盐酸盐 20 1
核黄素 16 3
烟酸 14 1
烟酰胺 19 1
泛酸钙 16 1
吡多辛盐酸盐 18 2
生物素 22 2
叶酸 21 1
硫酸镁 28 1
氯化钙 22 2
硫酸铁 27 1
硫酸铁铵 27 4
由表4(图4)可以确认，即使在乳清分解培养基中混配维生素类或矿物质类来对植物乳杆菌OLL2712进行培养，免疫细胞的IL-10的产生诱导活性与对照(control)相比也未发生大幅变化。
由表5(图5)可以确认，即使在乳清分解培养基中混配维生素类或矿物质类来对植物乳杆菌OLL2712进行培养，免疫细胞的IL-12的产生诱导活性与对照(control)相比也未发生大幅变化。
由表6(图6)可以确认，即使在乳清分解培养基中混配维生素类或矿物质类来对植物乳杆菌OLL2712进行培养，免疫细胞的IL-10/IL-12产生比例与对照(control)相比也未发生大幅变化。
由以上结果可以确认，使用混配有不饱和脂肪酸酯的培养基对植物乳杆菌OLL2712进行培养时，IL-10/IL-12产生比例显著增大，例如可以期待抗炎活性的提高；并且，在使用不饱和脂肪酸酯以外的物质(饱和脂肪酸酯、维生素类、矿物质类)时，无法期待这样的效果(IL-10/IL-12产生比例的显著增大等)。
[2.改变培养期间的长度对IL-10/IL-12的产生量的比例的影响(使用植物乳杆菌OLL2712的情况下)]
[实验方法2-1]植物乳杆菌OLL2712的制备方法
与实验方法1-1同样地制备出植物乳杆菌OLL2712的赋活培养液。然后，使用与实验方法1-1中使用的乳清分解培养基相同的培养基，以4重量％添加植物乳杆菌OLL2712的赋活培养液后，使用K2CO3(40重量％)作为中和剂，将pH控制于5.8的同时进行搅拌培养(33℃、上表面N2通气下、200rpm)，制备出植物乳杆菌OLL2712的高浓度培养液。需要说明的是，在该搅拌培养中，事先对培养条件进行研究，并设定于可得到最高菌体浓度的培养条件。
然后，与实验方法1-1同样地制备出植物乳杆菌OLL2712的冷冻干燥菌体。
然后，将植物乳杆菌OLL2712的冷冻干燥菌体悬浮于磷酸缓冲液(PBS)中后，使用细胞培养用的培养基进行稀释以使其为10mg/mL，制备出植物乳杆菌OLL2712的稀释液。
[实验方法2-2]免疫细胞的IL-10和IL-12的产生诱导活性的评价方法
使用实验方法1-1中制备的乳清分解培养基中含有单油酸十甘油酯(SUNSOFT Q-17S(商品名))作为副原料的乳清分解培养基、或者不含副原料的乳清分解培养基，与实验方法1-2同样地对免疫细胞的IL-10和IL-12的产生诱导活性进行评价。
此时，在对数生长期的中期(从对数生长期的起点起算4小时后)、对数生长期的后期(从对数生长期的起点起算8小时后)、稳定期的初期(从对数生长期的起点起算12小时后)、稳定期的中期(从对数生长期的起点起算16小时后)的各时刻，对免疫细胞的IL-10和IL-12的产生诱导活性进行评价。
需要说明的是，该培养中的对数生长期终点是从对数生长期的起点起算经过10小时后的时刻(达到最高达到菌数的一半的菌数的时刻)。
[实验结果2]免疫细胞的IL-10和IL-12的产生诱导活性的评价结果
将上述实验的结果(4次实验的平均值和标准偏差)示于表7～表9和图7～图9。
[表7]
IL-10的产生量(单位：pg/mL)
Figure BDA0001856665640000141
[表8]
IL-12(p70)的产生量(单位：pg/mL)
Figure BDA0001856665640000151
[表9]
IL-10/IL-12(p70)的产生量的比例
Figure BDA0001856665640000152
由表7(图7)可以确认，与不在乳清分解培养基中混配不饱和脂肪酸酯而将植物乳杆菌OLL2712培养至对数生长期(4小时、8小时)的情况相比，在乳清分解培养基中混配不饱和脂肪酸酯并将植物乳杆菌OLL2712培养至对数生长期(4小时、8小时)时，免疫细胞的IL-10的产生诱导活性提高。
另外可以确认，与不在乳清分解培养基中混配不饱和脂肪酸酯而将植物乳杆菌OLL2712培养至稳定期(12小时、18小时)的情况相比，在乳清分解培养基中混配不饱和脂肪酸酯并将植物乳杆菌OLL2712培养至稳定期(12小时、18小时)时，免疫细胞的IL-10的产生诱导活性降低。
由表8(图8)可以确认，与不在乳清分解培养基中混配不饱和脂肪酸酯而将植物乳杆菌OLL2712培养至对数生长期(4小时、8小时)的情况相比，在乳清分解培养基中混配不饱和脂肪酸酯并将植物乳杆菌OLL2712培养至对数生长期(4小时、8小时)时，免疫细胞的IL-12的产生诱导活性降低。
另外可以确认，与不在乳清分解培养基中混配不饱和脂肪酸酯而将植物乳杆菌OLL2712培养至稳定期(12小时、18小时)的情况相比，在乳清分解培养基中混配不饱和脂肪酸酯并将植物乳杆菌OLL2712培养至稳定期(12小时、18小时)时，免疫细胞的IL-12的产生诱导活性不发生变化。
由表9(图9)可以确认，与不在乳清分解培养基中混配不饱和脂肪酸酯而将植物乳杆菌OLL2712培养至对数生长期(4小时、8小时)的情况相比，在乳清分解培养基中混配不饱和脂肪酸酯并将植物乳杆菌OLL2712培养至对数生长期(4小时、8小时)时，免疫细胞的IL-10/IL-12产生比例提高。
另外可以确认，与不在乳清分解培养基中混配不饱和脂肪酸酯而将植物乳杆菌OLL2712培养至稳定期(12小时、18小时)的情况相比，在乳清分解培养基中混配不饱和脂肪酸酯并将植物乳杆菌OLL2712培养至稳定期(12小时、18小时)时，免疫细胞的IL-10/IL-12产生比例降低。
由以上可以确认，在乳清分解培养基中混配不饱和脂肪酸酯，并且将植物乳杆菌OLL2712不是培养至稳定期的范围内的时刻、而是在对数生长期的范围内的时刻结束培养时，IL-10/IL-12产生比例显著增大，可以期待抗炎活性的提高。
[3.改变培养期间的长度对IL-10/IL-12的产生量的比例的影响(使用植物乳杆菌OLL2770的情况下)]
代替植物乳杆菌OLL2712，使用植物乳杆菌OLL2770；并且，将免疫细胞的IL-10和IL-12的产生诱导活性的测定时刻从4个时刻变更为对数生长期的中期(培养开始起5小时后)、稳定期的中期(培养开始起16小时后)这2个时刻，除此以外，与上述“2.改变培养期间的长度对IL-10/IL-12的产生量的比例的影响(使用植物乳杆菌OLL2712的情况下)”同样地进行实验。
需要说明的是，该培养中的对数生长期终点是从培养开始起经过7小时后的时刻(中和剂达到总消耗量的一半的时刻)。
将上述实验的结果(4次实验的平均值和标准偏差)示于表10～表12和图10～图12。
[表10]
IL-10的产生量(单位：pg/mL)
Figure BDA0001856665640000171
[表11]
IL-12(p70)的产生量(单位：pg/mL)
Figure BDA0001856665640000172
[表12]
IL-10/IL-12(p70)的产生量的比例
Figure BDA0001856665640000173
由表10(图10)可以确认，与不在乳清分解培养基中混配不饱和脂肪酸酯而将植物乳杆菌OLL2770培养至对数生长期(5小时)的情况相比，在乳清分解培养基中混配不饱和脂肪酸酯并将植物乳杆菌OLL2770培养至对数生长期(5小时)时，免疫细胞的IL-10的产生诱导活性提高。
另外可以确认，与不在乳清分解培养基中混配不饱和脂肪酸酯而将植物乳杆菌OLL2770培养至稳定期(16小时)的情况相比，在乳清分解培养基中混配不饱和脂肪酸酯并将植物乳杆菌OLL2770培养至稳定期(16小时)时，免疫细胞的IL-10的产生诱导活性未发生变化。
由表11(图11)可以确认，与不在乳清分解培养基中混配不饱和脂肪酸酯而将植物乳杆菌OLL2770培养至对数生长期(5小时)的情况相比，在乳清分解培养基中混配不饱和脂肪酸酯并将植物乳杆菌OLL2770培养至对数生长期(5小时)时，免疫细胞的IL-12的产生诱导活性显著降低。
另外可以确认，与不在乳清分解培养基中混配不饱和脂肪酸酯而将植物乳杆菌OLL2770培养至稳定期(16小时)的情况相比，在乳清分解培养基中混配不饱和脂肪酸酯并将植物乳杆菌OLL2770培养至稳定期(16小时)时，免疫细胞的IL-12的产生诱导活性未发生变化。
由表12(图12)可以确认，与不在乳清分解培养基中混配不饱和脂肪酸酯而将植物乳杆菌OLL2770培养至对数生长期(5小时)的情况相比，在乳清分解培养基中混配不饱和脂肪酸酯并将植物乳杆菌OLL2770培养至对数生长期(5小时)时，免疫细胞的IL-10/IL-12产生比例提高。
另外可以确认，与不在乳清分解培养基中混配不饱和脂肪酸酯而将植物乳杆菌OLL2770培养至稳定期(16小时)的情况相比，在乳清分解培养基中混配不饱和脂肪酸酯并将植物乳杆菌OLL2770培养至稳定期(16小时)时，免疫细胞的IL-10/IL-12产生比例显著降低。
由以上可以确认，在乳清分解培养基中混配不饱和脂肪酸酯，并且将植物乳杆菌OLL2770不是培养至稳定期的范围内的时刻(16小时)、而是在对数生长期的范围内的时刻(5小时)结束培养时，IL-10/IL-12产生比例提高，可以期待抗炎活性的提高。
因此可以确认，不受植物乳杆菌的种类的影响，在植物乳杆菌中共通的是，在乳清分解培养基中混配不饱和脂肪酸酯，并且将植物乳杆菌不是培养至稳定期的范围内的时刻、而是在对数生长期的范围内的时刻结束培养时，IL-10/IL-12产生比例提高，可以期待抗炎活性的提高。

Claims (11)

1.一种植物乳杆菌的培养物的制造方法，其特征在于，使用含有单油酸聚氧乙烯山梨醇酐酯以外的不饱和脂肪酸酯的培养基，将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)培养至不超过对数生长期终点的时刻，得到植物乳杆菌的具有抗炎活性的培养物。
2.如权利要求1所述的植物乳杆菌的培养物的制造方法，其中，通过使用含有所述不饱和脂肪酸酯的培养基在不超过对数增殖期终点的时刻的上述培养，降低植物乳杆菌的培养物的对免疫细胞产生白细胞介素(IL)-12的诱导活性。
3.如权利要求1或2所述的植物乳杆菌的培养物的制造方法，其中，与使用不含不饱和脂肪酸酯的培养基得到的对照培养物相比，具有抗炎活性的所述培养物提高了免疫细胞的白细胞介素-10/白细胞介素-12的产生比例。
4.如权利要求1～3中任一项所述的植物乳杆菌的培养物的制造方法，其中，所述对数生长期终点以所述植物乳杆菌的培养时的菌数达到最高达到菌数的一半的菌数的时刻来表示。
5.如权利要求1～3中任一项所述的植物乳杆菌的培养物的制造方法，其中，所述对数生长期终点以所述植物乳杆菌的中和培养时使用的中和剂的消耗量达到总消耗量的一半的量的时刻来表示。
6.如权利要求1～5中任一项所述的植物乳杆菌的培养物的制造方法，其中，所述不饱和脂肪酸酯为单或多不饱和脂肪酸与多元醇反应而成的酯、或该酯的衍生物。
7.如权利要求6所述的植物乳杆菌的培养物的制造方法，其中，所述单或多不饱和脂肪酸是碳原子数为16～23的单～三不饱和脂肪酸。
8.如权利要求6或7所述的植物乳杆菌的培养物的制造方法，其中，所述不饱和脂肪酸酯为单油酸酯。
9.如权利要求8所述的植物乳杆菌的培养物的制造方法，其中，所述不饱和脂肪酸酯为聚甘油脂肪酸酯、山梨醇酐脂肪酸酯或聚山梨醇酯。
10.如权利要求1～9中任一项所述的植物乳杆菌的培养物的制造方法，其中，所述不饱和脂肪酸酯为选自由单油酸十甘油酯、单油酸五甘油酯以及单油酸山梨醇酐酯组成的组。
11.一种抗炎剂的制造方法，其特征在于，所述制造方法中，利用权利要求1～10中任一项所述的制造方法制造植物乳杆菌的培养物，并制造含有该植物乳杆菌的培养物作为有效成分的抗炎剂。
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