CN109112108A - 一种HepG2细胞高脂模型的构建方法及应用 - Google Patents

一种HepG2细胞高脂模型的构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种HepG2细胞高脂模型的构建方法，将HepG2细胞接种于6孔板，孵育20‑30h后取出，设置对照组和模型组；对照组加含8‑10v％FBS的高糖DMEM培养基，模型组加含终浓度2.5mmol/L油酸的8‑10v％FBS高糖DMEM培养基；将6孔板置于37℃、5v％CO2的培养箱孵育后去除培养液，再充分裂解细胞，得细胞裂解液；将细胞裂解液离心，取上清液测定TG和LDL‑C含量，当模型组比对照组细胞的TG和LDL‑C含量高时，HepG2细胞高脂模型构建成功。本发明通过构建HepG2细胞高脂模型有效模拟人体高血脂的情况，可以更加简便快捷有效的来测定食物或药物是否能有效降脂。

Description

一种HepG2细胞高脂模型的构建方法及应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种HepG2细胞高脂模型的构建方法。
背景技术
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种遗传-环境-代谢应激相关性疾病，包括单纯性脂肪性肝病、脂肪性肝炎、肝纤维化及肝硬化等多种类型。随着生活水平的提高，NAFLD的患病率逐年上升，成为慢性肝病的首要原因。NAFLD本身会向肝硬化、甚至是肝癌进展，同时也会加速慢性肝炎等其他肝病向肝硬化、肝癌进展；NAFLD还可通过加剧机体代谢紊乱促进糖尿病、冠心病的发展，导致代谢综合征相关肿瘤及心血管事件的高发。此外，NAFLD患者的肝脏对很多药物和毒物的敏感性增加，这增加了临床用药风险。因此，加强NAFLD的相关研究有着重要的意义。
目前，非酒精性脂肪性肝病的发病机制尚未完全明确，只知道NAFLD的发病与胰岛素抵抗、线粒体功能障碍、氧化应激和肥胖等因素密切相关,且线粒体损伤引起的能量代谢障碍在NAFLD发病机制中起关键作用。建立合适的动物模型，对于研究非酒精性脂肪性肝病的发病机制及治疗方法均有着重要的意义。目前大鼠、小鼠等动物模型是研究NAFLD发病的重要实验载体,但存在实验周期长、个体差异大、影响因素众多和实验条件不易控制等缺点。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中动物实验耗时长、个体差异大、实验条件不易控制等的问题，提供一种HepG2细胞高脂模型的构建方法。该体外脂肪变性细胞模型具有培养环境相对稳定、影响因素较少、实验条件易于控制和实验周期较短等优点。
技术方案
一种HepG2细胞高脂模型的构建方法，包括如下步骤：
(1)将HepG2细胞接种于6孔板，孵育20-30h后取出，设置对照组和模型组；
其中，对照组加含8-10v％FBS的高糖DMEM培养基，模型组加含终浓度2.5mmol/L油酸的8-10v％FBS高糖DMEM培养基；
(2)将6孔板置于37℃、5v％CO2的培养箱孵育20-30h后去除培养液，接着用PBS清洗，然后进行消化，消化后离心，弃去上清液，往沉淀中再次加入PBS清洗，然后离心，弃去上清液，得到细胞沉淀，充分裂解细胞，得到细胞裂解液；
(3)将细胞裂解液离心，取上清液，测定TG和LDL-C含量，当模型组细胞比对照组细胞的TG和LDL-C的含量高时，模型组细胞即为HepG2细胞高脂模型。
步骤(1)中，高糖DMEM培养基为市售购得，品牌是Gibco，但不限于此。
进一步，步骤(1)中，含终浓度2.5mmol/L油酸的8-10v％FBS高糖DMEM培养基的制备方法：70℃振荡水浴下将油酸溶于0.1mmol/L NaOH中，配成2.5mol/L的储存液，55℃振荡水浴下将上述储存液滴入20％BSA的PBS溶液中，配成浓度250mmol/L的使用液，过滤除菌，-20℃冷冻保存，使用前55℃水浴15min并冷却至室温,用完全培养基稀释至2.5mmol/L，即得；所述完全培养基为含有8-10v％FBS的高糖DMEM培养基，完全培养基还含有1％的青霉素和链霉素混合液。
进一步，步骤(2)中，离心转速为1000r/min，时间为3min。
进一步，步骤(2)中，充分裂解细胞的方式是：采用Western及IP细胞裂解液。
进一步，步骤(3)中，离心转速为10000r/min，时间为3-5min。
上述HepG2细胞高脂模型用于筛选降脂药物或食物的用途。利用该HepG2细胞高脂模型，可以评价哪些食物或药物对降脂有效果，给人们提供指导建议。
本发明的有益效果：是通过构建HepG2细胞高脂模型有效模拟人体高血脂的情况，从而以更加简便快捷有效的方法来测定食物或药物中能有效降脂的成分。
附图说明
图1是实施例1对照组HepG2细胞形态图；
图2是实施例1模型组HepG2细胞油红染色后的形态图；
图3是实施例1对照组和模型组HepG2细胞的甘油三酯含量；
图4是实施例1对照组和模型组HepG2细胞的低密度脂蛋白含量；
图5是实施例1加药组HepG2细胞的甘油三酯含量；
图6是实施例1加药组HepG2细胞的低密度脂蛋白含量。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。下述实施例中，在构建HepG2细胞高脂模型的同时，并利用其来评价薏米、红豆、青稞、荞麦是否具有降脂效果。实施例中所用的高糖DMEM培养基为市售购得，品牌是Gibco。
实施例1
(1)将HepG2细胞接种于6孔板，孵育24h后取出，设置对照组、模型组和加药组(加药组有4个，分别为薏米、红豆、青稞、荞麦加药组)，每组均设3个平行孔；
其中，对照组加含8-10v％FBS的高糖DMEM培养基，模型组加含终浓度2.5mmol/L油酸的8-10v％FBS高糖DMEM培养基；加药组是在模型组培养基的基础上，还加入了2.5mg/ml的待测杂粮消化后的样品；所述待测杂粮为薏米、红豆、青稞、荞麦，分别对应薏米、红豆、青稞、荞麦加药组；
含终浓度2.5mmol/L油酸的8-10v％FBS高糖DMEM培养基的制备方法：70℃振荡水浴下将油酸溶于0.1mmol/L NaOH中，配成2.5mol/L的储存液，55℃振荡水浴下将上述储存液滴入20％BSA的PBS溶液中，配成浓度250mmol/L的使用液，过滤除菌，-20℃冷冻保存，使用前55℃水浴15min并冷却至室温,用完全培养基稀释至2.5mmol/L，即得；所述完全培养基为含有8-10v％FBS的高糖DMEM培养基，完全培养基还含有1％的青霉素和链霉素混合液。
(2)将6孔板置于37℃、5v％CO2的培养箱孵育24h后去除培养液，用PBS轻洗两遍，加入300μL胰酶消化1-3min后，加入1ml完全培养液终止其消化,将贴壁细胞吹打后移入离心管中1000r/min,离心3min，弃去上清液，加入PBS再次清洗洗去残留培养液，再次1000r/min,离心3min后弃去上清液,往细胞沉淀里加入细胞裂解液充分裂解细胞，得到细胞裂解液；
(3)将细胞裂解液离心(转速为10000r/min，时间为3-5min)，取上清液，用TG(甘油三酯)、LDL-C(低密度脂蛋白)试剂盒分别测定TG(甘油三酯)和LDL-C(低密度脂蛋白)含量。
步骤(1)中，待测杂粮消化后的样品的制备方法：
A.称取40g的各杂粮加入360g的水放入锅中蒸煮25min后焖制10min(额定功率为270W)，冷却至室温后用料理机匀浆3min(额定功率为500-600W)，取200ml放入消化瓶置于4℃中备用。
B.将消化瓶置于37℃的恒温水浴摇床中(100rpm/min)，加入10mg的α-淀粉酶，所述α-淀粉酶溶解在1.25ml的CaCl2溶液(1mmol/L、pH7.0)中，此过程模拟人口腔消化过程，消化30min后取出消化液。
C.将步骤B中的消化液用6mol/LHCl把pH值调节至2.00，加入0.24g的胃蛋白酶，所述胃蛋白酶溶解在5mLHCl溶液(0.1mol/L)中，此过程模拟胃消化过程，消化120min后取出消化液。
D.将步骤C中的消化液使用低浓度的缓冲液1mol/L的NaHCO3将pH值调节至6.80，随后加入0.22g的胰酶和0.70g的胆酸，所述胰酶和胆酸一起溶解在10ml的NaHCO3溶液中(0.5mol/L)，此过程模拟肠道消化过程，消化180min后取出一定体积的消化液。离心后冷冻干燥，得到杂粮消化后的样品。
对照组和模型组HepG2细胞的TG含量见图3，LDL-C含量见图4，由图3和4可以以看出，模型组HepG2细胞的TG含量和LDL-C含量显著高于对照组(正常HepG2细胞)，HepG2细胞高脂模型构建成功，模型组细胞即为HepG2细胞高脂模型。
图1为对照组即正常HepG2细胞的形态图；图2为模型组即高脂HepG2细胞油红染色后的形态图，脂溶性染料可溶于组织和细胞中的脂类，其在脂类中的溶解度远比在溶剂中大，当细胞置入染液时，染料则离开染液而溶于组织内的脂质中，使细胞内的脂滴呈橘红色，图2表明细胞经油酸处理后已有大量脂质存在，进一步说明了HepG2细胞高脂模型构建成功。
图5为加药组HepG2细胞的TG含量，图6为加药组HepG2细胞的LDL-C含量，可以看出，荞麦具有很好的降脂效果。

Claims (6)

1.一种HepG2细胞高脂模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将HepG2细胞接种于6孔板，孵育20-30h后取出，设置对照组和模型组；
其中，对照组加含8-10v％FBS的高糖DMEM培养基，模型组加含终浓度2.5mmol/L油酸的8-10v％FBS高糖DMEM培养基；
(2)将6孔板置于37℃、5v％CO2的培养箱孵育20-30h后去除培养液，接着用PBS清洗，然后进行消化，消化后离心，弃去上清液，往沉淀中再次加入PBS清洗，然后离心，弃去上清液，得到细胞沉淀，充分裂解细胞，得到细胞裂解液；
(3)将细胞裂解液离心，取上清液，测定TG和LDL-C含量，当模型组细胞比对照组细胞的TG和LDL-C的含量高时，模型组细胞即为HepG2细胞高脂模型。
2.如权利要求1所述HepG2细胞高脂模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，含终浓度2.5mmol/L油酸的8-10v％FBS高糖DMEM培养基的制备方法：70℃振荡水浴下将油酸溶于0.1mmol/L NaOH中，配成2.5mol/L的储存液，55℃振荡水浴下将上述储存液滴入20％BSA的PBS溶液中，配成浓度250mmol/L的使用液，过滤除菌，-20℃冷冻保存，使用前55℃水浴15min并冷却至室温,用完全培养基稀释至2.5mmol/L，即得；所述完全培养基为含有8-10v％FBS的高糖DMEM培养基，完全培养基还含有1％的青霉素和链霉素混合液。
3.如权利要求1所述HepG2细胞高脂模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，离心转速为1000r/min，时间为3min。
4.如权利要求1所述HepG2细胞高脂模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，充分裂解细胞的方式是：采用Western及IP细胞裂解液。
5.如权利要求1至4任一项所述HepG2细胞高脂模型的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，离心转速为10000r/min，时间为3-5min。
6.权利要求1至5任一项所述HepG2细胞高脂模型用于筛选降脂药物或食物的用途。
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