CN104877915A

CN104877915A - 猴头菌诱变菌株h07在制备提高记忆力药物中的用途

Info

Publication number: CN104877915A
Application number: CN201510289920.4A
Authority: CN
Inventors: 王迪; 逯家辉; 张峻榕; 刘洋; 滕利荣; 孟庆繁; 孟令军; 权宇彤; 周毓霖
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2015-06-01
Filing date: 2015-06-01
Publication date: 2015-09-02

Abstract

本发明提供了猴头菌诱变菌株H07在制备提高记忆力药物中的用途，所述的猴头菌诱变菌株H07于2014年12月26日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址：武汉大学，分类名称：猴头菌H07 Hericium erinaceus H07；保藏登记号为CCTCC NO：M 2014669。本发明所述的猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物在提高记忆力和改善认知功能的医用用途，具有显著地医疗效果。

Description

猴头菌诱变菌株H07在制备提高记忆力药物中的用途

技术领域

本发明提供了猴头菌诱变菌株H07在制备提高记忆力药物中的用途，属于中药保健品技术领域，具体涉及猴头菌高产诱变菌株H07菌丝体提取物在制备提高记忆力和改善认知功能的药物。

背景技术

目前市面上治疗老年痴呆的药物常用的以乙酰胆碱酯酶抑制剂为主，如：他克林、多奈派齐等，但毒副作用大、费用昂贵；而在此方面我国的药用真菌有着出色的表现，药用真菌重视整体的调节和平衡，且具有毒副作用小、分布较广等优点。据《中国药用真菌》中记载，猴头菌性平、味甘、能利五脏、助消化、滋补、抗癌、治疗神经衰弱。据报道，猴头菌含有的营养成分包含丰富的蛋白质、脂肪、纤维素、多糖，还含有16种氨基酸，其中有8种人体必需氨基酸，且各种氨基酸比例与人体需求接近。因此，此发明中猴头菌诱变菌株H07与原始野生型猴头菌相比较，产量更高，在研究和广泛应用中奠定了良好的基础。

虽然国内外已有老年痴呆药物上市，但市面上尚未有将猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物作为提高记忆力和改善认知功能的药物或保健品。

发明内容

本发明提供猴头菌诱变菌株H07在制备提高记忆力药物中的用途，猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物在制备提高记忆力和改善认知功能中的应用，且提供了多种猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物的药品及保健品剂型。

本发明涉及的猴头菌诱变菌株H07，于2014年12月 26日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址：武汉大学，分类名称：猴头菌H07 Hericium erinaceus H07；保藏登记号为CCTCC NO：M 2014669。

本发明所述的一种猴头菌诱变菌株H07菌丝体的提取物，是通过以下方法制备得到的：

将猴头菌诱变菌株H07的菌丝体洗净，晾干，粉碎（过100目筛），按固液质量比1：40~60的比例，在70~80℃下水提2~4次，第1次3~4小时，第2次2~3小时，第3次1~2小时，第4次1~2小时，合并多次的水提液，4000~5000转/分钟离心5~10分钟，弃沉淀后，再用200~300目过滤布过滤得到过滤液，将过滤液在70℃~80℃条件下减压浓缩至相对密度1.00~1.20，然后再在-30~-60℃下冻干48~72小时，即得猴头菌诱变菌株H07菌丝体的提取物。

以本发明所述猴头菌诱变菌株H07菌丝体的提取物为主要活性可以制成口服片剂、咀嚼片剂、泡腾片剂、缓释胶囊或颗粒等医药及保健品制剂。

经动物行为学及细胞实验证明，本发明猴头菌诱变菌株H07菌丝体的提取物具有提高记忆力、改善认知的功能，能用于各种药物及保健品剂型的制备。在动物行为学中主要的功效学作用如下：

（1）可明显缩短小鼠在水迷宫中寻找平台的时间，增加小鼠经过平台的次数，小鼠学习记忆力明显提高；

（2）可明显延长小鼠在疲劳转棒仪试验中的时间，提高小鼠适应疲劳转棒的时间，小鼠适应学习记忆力明显提高；

而在细胞实验中，猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物对L-谷氨酸和6-OHDA诱导的记忆力衰退细胞损伤模型也具有保护作用。

二者充分说明，本发明的猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物具有提高记忆力和改善认知功能的药物或保健品的新用途，可将其制成口服片剂、咀嚼片剂、泡腾片剂、缓释胶囊、颗粒剂型。

本发明的积极效果在于：提供了猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物在提高记忆力和改善认知功能的医用用途，具有显著地医疗效果。

具体实施方式

下面结合实例对本发明作进一步详细说明，但本发明的范围并不受这些实例的限制。

实施例1：

将1000g的猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物（菌株编号：CCTCC NO：M 2014669）粉碎，过100目筛后，按固液质量比1:40，温度为70℃，水提3次，第1次4小时，第2次3小时，第3次2小时，合并三次水提液，4000转/分钟离心5分钟，弃沉淀后，再用200目过滤布过滤得到过滤液，将过滤液减压浓缩至相对密度1.00（70℃），将浓缩液以-30℃冻干72小时，即得猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物93.40g。

实施例2：

将1000g猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物（菌株编号：CCTCC NO：M 2014669）粉碎，过100目筛后，按固液质量比1:60，温度为80℃，水提3次，第1次3小时，第2次2小时，第3次1小时，合并三次水提液，5000转/分钟离心10分钟，弃沉淀后，再用300目过滤布过滤得到过滤液，将过滤液减压浓缩至相对密度1.20（80℃），将浓缩液以-60℃冻干48小时，即得猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物101.91g。

为证明本发明猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物是否具有提高记忆力和改善认知功能这一功能，将通过以下实验来表明此新用途：

实验例1：

小鼠Morris水迷宫（Morris water maze, MWM）实验

将实施例2中所制备的猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物用去离子水配成浓度为0.3g/kg、1g/kg、3g/kg的低剂量组、中剂量组、高剂量组。受试小鼠的经口灌胃剂量，即20±2g体重受试小鼠经口灌胃剂量为0.2mL/20g，而空白对照组受试小鼠经口灌胃等体积的生理盐水，每天都灌胃给药，连续灌胃7天后，将小鼠置于水迷宫测试仪中，训练数次后，测定各组小鼠找寻平台的时间。将世界上已得到广泛认可的水迷宫测试仪（Morris）内设置4个盲端，按照离出口由近及远依次是4区、3区、2区、1区，终点有一高出水面的安全平台，水深10cm，温度25±2℃。实验时由计算机自动记录动物从起点游到终点登陆安全平台所需的时间，并设定3min为游出的最后时限，观察各组小鼠在3min内的游出率。测试前5天每天对小鼠进行训练，保证训练环境安静，每次训练的时间、地点相同，操作者站于相同位置。训练第一天将受试小鼠放在出口处，使之爬上安全平台3次，让其了解逃离方式，以后每次实验前让小鼠从出口处自行爬上1次，然后放入离出口最近的4区，引导小鼠至出口；之后两天一次由3区、2区将小鼠引导至出口；第四、五天将小鼠放入1区，引导至出口。第六天当各组的小鼠从1区至出口3min通过时，对各组小鼠进行测试，观察各组小鼠3min内自行游出率。结果见表1。

表1.不同剂量猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物对小鼠在水迷宫实验的影响

组别	寻找时间（s）
		空白组	37.50±6.05
低剂量组	42.82±6.32*
		中剂量组	49.03±7.01*
高剂量组	59.89±7.22**

*与空白组比P＜0.05，**与空白组比＜0.01

由表1可见，猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物的低、中、高剂量组小鼠在Morris水迷宫测试仪中的寻找时间与空白组相比有显著性的差异，这说明猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物能够改善小鼠寻找平台的时间，提高了小鼠学习记忆寻找平台位置的时间，即说明猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物具有提高记忆力的作用。

实验例2：

小鼠疲劳转棒实验

将实施例2中所制备的猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物用去离子水配成浓度为0.3g/kg、1g/kg、3g/kg的低剂量组、中剂量组、高剂量组。受试小鼠的经口灌胃剂量，即20g体重受试小鼠经口灌胃剂量为0.2mL/只，而空白对照组受试小鼠经口灌胃等体积的生理盐水，每天都灌胃给药，连续灌胃7天后，将每组小鼠分别放在转棒上，使肌肉处在静力紧张的状态。调节转棒的速度为20rpm/min，记录各组小鼠由于肌肉疲劳从玻璃棒上跌下的时间，实验前训练2次，第3次开始计时，跌落时终止实验，第3次的时间作为小鼠爬杆时间，并记录。结果见表2。

表2.不同剂量猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物对小鼠在疲劳转棒实验的影响

组别	停留时间（s）
		空白组	49.02±6.37
低剂量组	51.23±6.56*
		中剂量组	61.91±6.72*
高剂量组	71.32±6.90**

*与空白组比P＜0.05，**与空白组比＜0.01

由表2可见，猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物的低、中、高剂量组小鼠在转棒上的停留时间与空白组相比有显著性的差异，这说明猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物能够明显延长小鼠在疲劳转棒仪试验中的时间，提高小鼠适应疲劳转棒旋转的时间，小鼠适应学习记忆力明显提高。

实验例3：

猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物对L-谷氨酸所致PC12细胞损伤的保护作用

取对数生长期的PC12细胞，吹打制成单细胞悬液后离心，用DMEM完全培养液（由体积百分数为10%的胎牛血清、体积百分数为5%的马血清、体积百分数为1%的双抗和DMEM无血清培养基配制）稀释成1×10⁵个细胞/mL的细胞悬液，每孔100μL接种于提前用Ⅰ型胶原蛋白处理过的铺有多聚赖氨酸的96孔板中，即每孔细胞数量为1×10⁴个，置于温度为体积浓度为5%的CO₂培养箱中，培养24h后，具体操作如下:

正常对照组：将PC12细胞接种于每孔体积为100μL的无血清培养基中培养24h；

L-谷氨酸组：将PC12细胞培养孔中体积为100μL的无血清培养基吸干净后，加入100μL的L-谷氨酸溶液，作用24h（L-谷氨酸是用无血清培养基配制成终浓度为25Mm/L的溶液）；

猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物：将10μL不同浓度的猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物（本样品采用的是实施例2中的猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物，100μg，200μg，400μg）加入到每孔体积为100μL的无血清培养液所培养的PC12细胞孔中，预处理3小时后，将上述所有液体吸干净，每孔中加入已含有10μL不同浓度的猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物溶液以及100μL的L-谷氨酸（25mM）溶液，此时这组每孔的总体积为110μL，让上述二者共同处理24h。

共同处理24h后，每孔加入5mg/mL的MTT20μL，37℃培养箱中培养2h，弃上清后每孔加入DMSO10μL，自动酶标读数仪比色（主波长490nm，次波长540nm），测定其吸光度值。并计算各组PC12细胞的存活率。细胞存活率＝实验组吸光度均值/阴性对照组吸光度均值×100%。结果见表3。

表3.不同浓度猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物对L-谷氨酸所致细胞损伤的保护作用

组别	细胞存活率
		空白组	100±8.52
L-谷氨酸所致的记忆力衰退细胞模型组	39.23±7.96*
		低浓度组	46.23±8.06*
中浓度组	70.76±8.24*^#
		高浓度组	65.92±8.43*^#

*与空白组比P＜0.01，*#与损伤组相比，P＜0.05

由表3可见，由于加入不同浓度的猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物样品预处理时，与空白组以及与L-谷氨酸所致的记忆力衰退细胞模型组相比存在着显著的差异，细胞存活率都会有所改变；当加入浓度为200μg的猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物样品时，PC12细胞存活率已超过50%，说明猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物对L-谷氨酸所致的记忆力衰退的细胞损伤模型具有保护作用。

实验例4：

猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物对6-OHDA所致PC12细胞损伤的保护作用

取对数生长期的PC12细胞，吹打制成单细胞悬液后离心，用DMEM培养液稀释成1×10⁵个细胞/mL的细胞悬液，每孔100μL接种于提前用collagenⅠ处理过的铺有多聚赖氨酸的96孔板中，即每孔细胞数量为1×10⁴个，置于37℃，5%的CO₂培养箱中，培养24h后，具体操作如下:

6-OHDA组：将10μL的6-OHDA溶液加入到每孔体积为100μL的无血清培养液所培养的PC12细胞孔中，作用24h（6-OHDA是用无血清培养基配制成终浓度为100μmol/L的溶液）；

猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物：将10μL不同浓度的猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物（本样品采用的是实施例2中的猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物，100μg，200μg，400μg）加入到每孔体积为100μL的无血清培养液所培养的PC12细胞孔中，预处理3小时后，再向每孔中补加10μL的6-OHDA(100μmol/L)溶液，使上述二者共同作用24h。

共同处理24h后，每孔加入5mg/mL的MTT20μL，37℃培养箱中培养2h，弃上清后每孔加入DMSO10μL，自动酶标读数仪比色(主波长490nm，次波长540nm)，测定其吸光度值。并计算各组PC12细胞的存活率。细胞存活率＝实验组吸光度均值/阴性对照组吸光度均值×100%，结果见表4。

表4.不同浓度猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物对6-OHDA所致细胞损伤的保护作用

组别	细胞存活率
		空白组	100±8.52
6-OHDA所致记忆力衰退细胞模型组	39.23±7.96*
		低浓度组	63.08±6.78**
中浓度组	70.22±6.92**
		高浓度组	78.95±7.01**

*与空白组比P＜0.01，**与损伤组相比，P＜0.05。

由表4可见，由于加入不同浓度的猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物样品预处理时，与空白组以及与6-OHDA所致的记忆力衰退细胞模型组相比存在着显著的差异，随着猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物样品浓度的增高，细胞存活率也会随之增加；与空白组比较，损伤组细胞存活率明显下降；与损伤组比较，猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物样品组细胞存活率明显升高，说明猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物对6-OHDA所致的记忆力衰退细胞模型组具有保护作用。

通过实验结果表明猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物的确具备提高记忆力、改善认知的功能，针对这一新用途，本发明提供了以下剂型来制备猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物的药品及保健品：

实施例3：

口服片剂的制备

按制备猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物口服分散片100片投料计算，猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物100g（实施例1产物），淀粉65g，微晶纤维素20g，甘露醇20g，羧甲基淀粉钠30g，葡萄糖50g，硬脂酸镁500mg。

制备方法如下：

（1）将100g猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物、65g淀粉、20g微晶纤维素、20g甘露醇、30g羧甲基淀粉钠、50g葡萄糖,分别干燥2小时，100目筛过滤；

（2）将（1）充分混合，30目筛过滤，50℃干燥，过20目筛。

（3）取（2）与500mg硬脂酸镁充分混合均匀后，使压片机的压力控制在60kN，转速5rpm/min时，以0.5g/片的重量规格，进行压片。

实施例4：

咀嚼片剂的制备

按制备猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物咀嚼分散片100片投料计算，猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物100g（实施例1产物），葡萄糖50g、低聚果糖40g、微晶纤维素20g、脱脂奶粉50g、硅酸镁30g，硬脂酸镁500mg、维生素D 30g。

制备方法如下：

（1）将100g猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物、葡萄糖50g、低聚果糖40g、微晶纤维素20g、脱脂奶粉50g，经过50℃干燥，100目筛过滤；

（2）将（1）中的100g猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物与水按照质量比1:1混匀制备成浆液；

（3）将该浆液以4.0×10⁶Pa的压力在喷雾干燥塔中进行60℃雾化干燥成颗粒状；

（4）加入（1）中干燥过滤好的葡萄糖50g、低聚果糖40g、微晶纤维素20g、脱脂奶粉50g后，加入硅酸镁30g、硬脂酸镁500mg、维生素D 30g，混合均匀；

（5）将（4）进行50℃干燥，使压片机的压力控制在60kN，转速5rpm/min时，按0.5g/片重量规格压制成咀嚼片。

实施例5：

泡腾片剂的制备

按制备猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物泡腾片100片投料计算，猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物100g， NaHCO₃10g，柠檬酸20g，甜菊糖甙3g，羟丙基甲基纤维素(HPMC)50g，聚乙二醇8000 3g，木糖醇6g。

制备方法如下：

（1）将猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物100g（实施例1产物），NaHCO₃10g，柠檬酸20g，甜菊糖甙3g，羟丙基甲基纤维素(HPMC)50g，聚乙二醇8000 3g，木糖醇6g分别进行60℃干燥，过100目筛；

（2）将（1）中的猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物100g， NaHCO₃10g，柠檬酸20g，甜菊糖甙3g，木糖醇6g充分混匀后，加入羟丙基甲基纤维素(HPMC)50g，聚乙二醇8000 3g搅拌，过16目筛，50℃干燥；

（3）将（2）在压片机压力为60kN，转速5rpm/min时，按0.8g/片重量规格压制成泡腾片剂。

实施例6：

颗粒剂的制备

猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物（实施例1产物），150g淀粉，糊精50g。

制备方法如下：

（1）将猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物1000g，150g淀粉，用100L的去离子水搅拌混匀；

（2）将混匀后的混悬液在4℃、12000r/min条件下离心15min后取上清液；

（3）流化床喷雾制粒:在上述上清液中加入50g的糊精，流化床设置参数设定如下:蠕动泵转速70r/min、进风温度为120℃，辅风温度80℃，雾化压力3.0MPa，既得猴头菌诱变菌株H07菌丝体提取物的颗粒剂。

Claims

1.猴头菌诱变菌株H07在制备提高记忆力药物中的用途；所述的猴头菌诱变菌株H07于2014年12月26日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址：武汉大学，分类名称：猴头菌H07 Hericium erinaceus H07；保藏登记号为CCTCC NO：M 2014669。

2. 根据权利要求1所述的猴头菌诱变菌株H07菌丝体的提取物，是由如下方法制备得到：将猴头菌诱变菌株H07的菌丝体洗净，晾干，粉碎（过100目筛），按固液质量比1：40~60的比例，在70~80℃下水提2~4次，第1次3~4小时，第2次2~3小时，第3次1~2小时，第4次1~2小时，合并多次的水提液，4000~5000转/分钟离心5~10分钟，弃沉淀后，再用200~300目过滤布过滤得到过滤液，将过滤液在70℃~80℃条件下减压浓缩至相对密度1.00~1.20，然后再在-30~-60℃下冻干48~72小时，即得。

3. 以权利要求1所述猴头菌诱变菌株H07菌丝体的提取物为主要活性可以制成口服片剂、咀嚼片剂、泡腾片剂、缓释胶囊或颗粒等医药及保健品制剂。