CN109073588A - 使用苯二胺衍生物的电化学测定 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题是提供一种能在利用电化学测定法的测定中高灵敏度且稳定地进行测定的方法，通过提供用于标记底物的由下述通式(1)表示的标记物、以该标记物标记而成的测定用底物、使用了该测定用底物的利用电化学测定法的测定方法、以及包含该标记物和/或该测定用底物作为构件的试剂盒等，解决上述课题。在下述式(1)中，R1为H或烷基(CmH2m+1)，m为1～4的整数，R2为烷基(CnH2n+1)，n为1～4的整数。)

Description

使用苯二胺衍生物的电化学测定
技术领域
本发明涉及一种用于高灵敏度且稳定地进行利用电化学测定法的测定的方案，具体而言，涉及用于标记底物的标记物、以该标记物标记而成的测定用底物、使用了该测定用底物的利用电化学测定法的测定方法、以及包含该标记物和/或该测定用底物作为构件的试剂盒等。
背景技术
在医药、食品的卫生管理、包括人的动物的诊断中，检测来源于微生物的物质、测定微生物污染的程度的方法是重要的。作为测定微生物污染的程度的方法，鲎试验正在普及。鲎试验是以内毒素、(1→3)-β-D-葡聚糖为测定对象物质的测定微生物污染的程度的技术，是利用了鲎所具有的蛋白酶前体可被这些测定对象物质激活的性质的测定方法。鲎试验一般通过凝胶化法、比浊法、或比色法进行，但近年来也正在开发利用电化学测定法的鲎试验。
专利文献1公开了，在利用电化学测定法的鲎试验中，对甲氧基苯胺等对氨基苯酚的衍生物有助于高灵敏度且稳定地检测内毒素。
专利文献2公开了在利用电化学测定法的蛋白酶活性的测定中使用的寡肽衍生物。在该肽衍生物的C末端键合有苯胺的衍生物。
但是，不论在上述哪一个文献中，均未公开苯二胺的衍生物可用于电化学测定。另外，也没有教导苯二胺的衍生物是可比以往使用的化合物更加高灵敏度且稳定地进行蛋白酶活性的测定的化合物。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2015-187607
专利文献2：日本特表2002-542154
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题是提供一种在利用电化学测定法的测定中可高灵敏度且稳定地进行测定的方案。
用于解决课题的技术方案
本发明的发明人们为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现通过使用N-甲基对苯二胺(MPDD)或N，N-二甲基对苯二胺(DMPD)标记底物，能使底物成为适合于利用电化学测定法的测定的测定用底物，因而可使电化学测定高灵敏度且稳定地进行，从而完成了本发明。
前述上述课题可利用包括以下方案的本发明进行解决。
[1]
一种标记物，其用于标记底物而形成适合于利用电化学测定法的测定的测定用底物，其包含由下述通式(1)表示的结构。
【化1】
(在所述式(1)中，R1为H或烷基(CmH2m+1)，m为1～4的整数，R2为烷基(CnH2n+1)，n为1～4的整数。)
[2]
根据[1]所述的标记物，其中，
R1为H或甲基(CH3)，R2为甲基(CH3)。
[3]
一种适合于利用电化学测定法的测定的测定用底物，其包含以[1]或[2]所述的标记物标记而成的底物作为结构。
[4]
一种适合于利用电化学测定法的测定的测定用底物，其包含由下述通式(2)表示的、以[1]或[2]所述的标记物标记而成的底物作为结构。
【化2】
(在所述式(2)中，X1为底物，R1为H或烷基(CmH2m+1)，m为1～4的整数，R2为烷基(CnH2n+1)，n为1～4的整数。)
[5]
一种适合于利用电化学测定法的测定的具有酰胺键的测定用底物，其包含由下述通式(3)表示的、以[1]或[2]所述的标记物标记而成的底物作为结构。
【化3】
(在所述式(3)中，X2为底物(残基)，R1为H或烷基(CmH2m+1)，m为1～4的整数，R2为烷基(CnH2n+1)，n为1～4的整数。)
[6]
根据[3]～[5]中任一项所述的测定用底物，其中，
底物为肽。
[7]
根据[6]所述的测定用底物，其中，
酰胺键(-CO-NH-)为通过肽的C末端的羧基与[1]或[2]所述的标记物的氨基的反应而生成的共价键。
[8]
根据[6]或[7]所述的测定用底物，其中，
肽为在C末端具有Arg(R)残基的肽。
[9]
根据[6]～[8]中任一项所述的测定用底物，其中，
肽为由下述通式(a)～(g)中的任一式表示的肽。
Y-Asp-Pro-Arg(Y-DPR) (a)
Y-Val-Pro-Arg(Y-VPR) (b)
Y-Leu-Thr-Arg(Y-LTR) (c)
Y-Met-Thr-Arg(Y-MTR) (d)
Y-Leu-Gly-Arg(Y-LGR) (e)
Y-Ile-Glu-Gly-Arg(Y-IEGR) (f)
Y-Glu-Gly-Arg(Y-EGR) (g)
(在所述式(a)～(g)中，Y可存在也可不存在，在Y存在的情况下Y为肽的N末端的氨基酸的氨基的保护基。)
[10]
根据[9]所述的测定用底物，其中，
保护基为Cbz(苄氧羰基)或Boc(叔丁氧羰基)。
[11]
一种利用电化学测定法的测定方法，其使用[3]～[10]中任一项所述的测定用底物。
[12]
根据[11]所述的测定方法，其中，
测定方法为包括下述(1)以及(2)的工序的测定对象物质的测定方法：
(1)在测定对象物质的存在下，使[3]～[10]中任一项所述的测定用底物与分解该底物的酶接触的工序；
(2)利用电化学测定法测定从所述(1)的测定用底物游离的标记物的工序。
[13]
根据[12]所述的测定方法，其中，
测定对象物质为来源于微生物的物质。
[14]
根据[13]所述的测定方法，其中，
来源于微生物的物质为内毒素和/或(1→3)-β-D-葡聚糖。
[15]
根据[12]～[14]中任一项所述的测定方法，其中，
分解酶为鲎的C因子、B因子、G因子、和/或凝固酶原。
[16]
根据[11]所述的测定方法，其中，
测定方法为包括下述(1)以及(2)的工序的酶活性的测定方法：
(1)使[3]～[10]中任一项所述的测定用底物与分解该底物的酶接触的工序；
(2)利用电化学测定法测定从所述(1)的测定用底物游离的标记物的工序。
[17]
根据[11]～[16]中任一项所述的测定方法，其中，
电化学测定法为伏安法或安培法。
[18]
一种试剂盒，其包含[1]或[2]所述的标记物、和/或[3]～[10]中任一项所述的测定用底物作为构件。
发明效果
根据本发明，能使利用电化学测定法的测定高灵敏度且稳定地进行。
具体实施方式
<1>本发明的标记物
在本发明中，提供一种标记物(以下称为“本发明的标记物”)，其可使利用电化学测定法的测定高灵敏度且稳定地进行，其用于标记底物而形成适合于利用电化学测定法的测定的测定用底物。本发明的标记物例如可用于制备后述的本发明的测定用底物。
本发明的标记物为包含苯二胺(NH2-C6H4-NH2)的一侧的氨基经1个或2个烷基修饰而成的结构的标记物(苯二胺的衍生物)。换言之，本发明的标记物为包含由上述通式(1)表示的结构的标记物。在本发明的标记物为经2个烷基修饰的苯二胺的衍生物的情况下，2个烷基彼此的结构可以相同，也可不同。
在本发明的标记物中，所谓“包含…结构”的情况包括由该结构构成的情况。
在本发明中，烷基可以是1价的烷基。另外，烷基可以是不具有支链的直链状的烷基。
关于烷基(CmH2m+1及CnH2n+1)的链长，从水性溶剂中的溶解性的观点出发，优选短链的烷基，优选m、n为1～4的整数(m、n为1、2、3、或4)。换言之，烷基优选为甲基(CH3)、乙基(C2H5)、丙基(C3H7)、或丁基(C4H9)。关于烷基(CmH2m+1及CnH2n+1)，m、n更优选为1～3的整数，进一步优选为1～2的整数，更进一步优选的是m、n为1。此处所述m、n的范围或数可以是相同范围或相同整数，也可是不同范围或不同整数。
具体而言，本发明的标记物优选为由下述通式(4)表示的N-甲基对苯二胺(MPDD)或N，N-二甲基对苯二胺(DMPD)。
【化4】
在上述式(4)中，R1为H或甲基(CH3)，R2为甲基(CH3)。
本发明的标记物特别优选为由下述通式(5)表示的N-甲基对苯二胺(MPDD)。
【化5】
在上述式(5)中，R1为H，R2为甲基(CH3)。
本发明的标记物也可作为包含本发明的标记物的试剂而提供。本发明的标记物及包含其的试剂可以是任意形状，例如可以是粉末等固体形状，也可是溶解于任意溶剂的状态的液态。
根据本发明的标记物，可使用其将底物标记而形成适合于利用电化学测定法的测定的测定用底物，可使利用电化学测定法的测定高灵敏度且稳定地进行。
<2>本发明的测定用底物
如上所述，本发明的标记物是用于标记底物而形成适合于利用电化学测定法的测定的测定用底物的化合物。底物优选通过与本发明的标记物的氨基反应而与标记物键合从而被标记，由此形成适合于利用电化学测定法的测定的测定用底物。
关于包含以本发明的标记物标记而成的底物作为结构的测定用底物(以下称为“本发明的测定用底物”)优选为由上述通式(2)表示的化合物。本发明的测定用底物能够用于进行电化学测定法、优选后述的本发明的测定对象物质的测定方法、本发明的酶活性的测定方法。本发明的测定用底物例如具有以下性质：在本发明的测定对象物质的测定方法中示出的条件下与测定对象物质共存时(存在于相同溶液中时)，本发明的标记物发生游离。
在本发明的测定用底物中，所谓的“包含以本发明的标记物标记而成的底物作为结构”的情况包括由以本发明的标记物标记而成的底物的结构构成的情况。
本发明的标记物优选经由以上述通式(1)表示的化合物的氨基(NH2基)导入至底物。因此，底物优选具有可与氨基键合的官能团。可与本发明的标记物的氨基发生键合的底物的官能团只要是可与氨基键合的官能团则没有特别限制。作为这样的官能团，可列举：羧基、硫醇基、甲酰基、马来酰亚胺基。官能团可以是通过与具有该官能团的其他分子的共价键而导入至底物的官能团，也可是底物原本具有的官能团。具体而言，作为此处所述的其他分子，可列举连接体(1inker)。此处所述的其他分子可以为分子量为1000以下、优选分子量为100以下的低分子化合物。
优选的是，可与本发明的标记物的氨基键合的底物的官能团为羧基。因此，优选本发明的标记物与底物之间的键为酰胺键。优选本发明的测定用底物为由上述通式(3)表示的具有酰胺键的化合物。
底物的种类没有特别限制。作为底物，可列举碳水化合物、糖类、核酸、脂质、蛋白质、多肽、肽、氨基酸。
在本发明的测定用底物中，底物优选为肽。例如在使用蛋白酶进行测定的情况下，肽适合用作底物。另外，在本发明的测定用底物中，优选的是，酰胺键为通过肽的C末端的羧基(肽的C末端原本具有的羧基)与本发明的标记物的氨基的反应而形成的共价键。
本发明的测定用底物所具有的底物可以是1种，也可是2种或2种以上。本发明的测定用底物所具有的底物可以是1个，也可是2个或2个以上。例如，本发明的测定用底物也可是在本发明的标记物的氨基上键合2个肽的羧基形成酰亚胺而得的物质。
此处所述的肽的链长没有特别限制。从使用本发明的标记物的标记反应(与本发明的标记物键合的反应)由此得到的化合物的收率的观点出发，肽优选为短链，优选为寡肽。具体而言，肽优选为10残基以下。肽优选为10残基以下、8残基以下、6残基以下、5残基以下、或4残基以下。肽优选为2残基以上、或3残基以上。肽优选为2～10残基、2～8残基、2～6残基、2～5残基、2～4残基、3～10残基、3～8残基、3～6残基、3～5残基、或3～4残基。肽更优选为2～5残基，进一步优选为2～4残基，特别优选为3～4残基。
肽优选为在C末端具有Arg(R)残基的肽。在C末端具有Arg(R)残基的肽例如在使用丝氨酸蛋白酶进行测定的情况下适合用作底物。作为这样的肽，可列举：Asp-Pro-Arg(DPR)、Val-Pro-Arg(VPR)、Leu-Thr-Arg(LTR)、Met-Thr-Arg(MTR)、Leu-Gly-Arg(LGR)、Ile-Glu-Gly-Arg(IEGR)(序列编号1)、Glu-Gly-Arg(EGR)。
肽也可是在N末端等具有保护基的肽。肽可在N末端等的氨基具有保护基，也可在羧基、硫醇基具有保护基。肽例如可以是由下述通式(6)表示的化合物。
Y-Xp (6)
在上述式(6)中，Xp为肽，Y可存在也可不存在，在Y存在的情况下，Y为肽的N末端的氨基酸的氨基的保护基。
在上述式(6)中，Xp优选为Asp-Pro-Arg(DPR)、Val-Pro-Arg(VPR)、Leu-Thr-Arg(LTR)、Met-Thr-Arg(MTR)、Leu-Gly-Arg(LGR)、Ile-Glu-Gly-Arg(IEGR)(序列编号1)、或Glu-Gly-Arg(EGR)。Xp特别优选为Leu-Gly-Arg(LGR)。
具体而言，本发明的测定用底物优选为由下述通式(7)表示的化合物。
【化6】
在上述式(7)中，Y可存在也可不存在，在Y存在的情况下，Y为肽N的末端的氨基酸的氨基的保护基，R1为H或烷基(CmH2m+1)，m为1～4的整数，R2为烷基(CnH2n+1)，n为1～4的整数。
在上述通式(6)及(7)中，优选保护基Y存在。另外，在上述通式(6)中，肽可以是在羧基、硫醇基具有保护基的肽。作为保护基，可列举：Cbz(苄氧羰基)、Boc(叔丁氧羰基)、OBzl(苄基)、Bz(苯甲酰基)、Ac(乙酰基)。保护氨基的保护基优选为Cbz或Boc，更优选为Cbz。保护基Y优选为Cbz或Boc，更优选为Cbz。另外，保护羧基、硫醇基的保护基优选为OBzl。例如Asp-Pro-Arg(DPR)也可是Asp残基的羧基被OBzl保护的肽(Asp(OBzl)-Pro-Arg(D(OBzl)PR))。另外，例如Ile-Glu-Gly-Arg(IEGR)也可是Glu残基的羧基被OBzl保护的肽(Ile-Glu(OBzl)-Gly-Arg(IE(OBzl)GR))。进而，例如Glu-Gly-Arg(EGR)也可是Glu残基的羧基被OBzl保护的肽(Glu(OBzl)-Gly-Arg(E(OBzl)GR))。特别地，Glu-Gly-Arg(EGR)优选为Glu(OBzl)-Gly-Arg(E(OBzl)GR)。
进一步具体而言，本发明的测定用底物优选为由下述通式(8)表示的化合物。
【化7】
在上述式(8)中，Cbz为苄氧羰基。
在上述通式(2)、(3)、及(7)中，R1以及R2的优选方案可适用本发明的标记物中的记载并进行选择。例如在上述通式(2)、(3)、及(7)中，m及n优选为1。另外，例如在上述通式(2)、(3)、及(7)中，优选R1为H或CH3、R2为CH3。进而，例如在上述式(2)、(3)、及(7)中，优选R1为H、R2为CH3。
本发明的测定用底物可以是盐。本发明的测定用底物例如可以是碱金属盐、三氟醋酸(TFA)盐、醋酸(AcOH)盐、或盐酸(HCl)盐。
本发明的测定用底物也可作为包含本发明的测定用底物的试剂而提供。本发明的测定用底物及包含其的试剂可以是任意形状，例如，可以是粉末等固体形状，也可是溶解于任意溶剂的状态的液态。
通过使用本发明的测定用底物，可高灵敏度且稳定地进行利用电化学测定法的测定。
<3>本发明的测定对象物质的测定方法
本发明的测定对象物质的测定方法(以下称为“本发明的测定方法1”)为以使用本发明的测定用底物为特征的、利用电化学测定法对测定对象物质进行测定的方法。具体而言，本发明的测定方法1是包括以下工序的测定对象物质的测定方法：在测定对象物质的存在下，使本发明的测定用底物与分解该底物的酶(以下简称为“分解酶”)接触的工序，及测定从该测定用底物游离的标记物的工序。
在本发明中，测定用作包括检出、检测、以及定量的总称。即，本发明的测定方法1可以是测定对象物质的检出方法、测定对象物质的检测方法、或测定对象物质的定量方法。
在本发明的测定方法1中成为测定的对象的物质没有特别限制。测定对象物质例如为对具有剪切本发明的测定用底物使本发明的标记物游离的活性的分解酶的活性造成影响的物质。测定用底物被分解酶分解时，本发明的标记物游离。此处所述的分解酶例如为蛋白酶。即，由于标记物从包含肽等作为底物的本发明的测定用底物游离，由此在向电化学测定法供给试样时所得到的电流值上升，因此可测定蛋白酶等分解酶的活性。进而，在设为测定对象的物质影响分解酶的活性的情况下，可通过测定该活性来间接测定该物质的浓度。影响分解酶的活性的物质例如为具有促进或抑制分解酶的活性的作用的物质(激活剂或抑制剂)。另外，影响分解酶的活性的物质例如为具有如下性质的物质：与分解酶的前体接触时通过剪切该前体的前肽序列等而将分解酶转换为活性酶。此处所述的物质例如为来源于微生物的物质。
本发明的测定方法1例如通过将来源于微生物的物质设为测定对象物质，可以适合地用作检出微生物污染的方法。在该目的中，从对微生物污染的程度进行全面测定的目的考虑，成为测定对象的来源于微生物的物质优选为在各种微生物种中共同存在的包含相同结构的成分。具体而言，来源于微生物的物质优选为内毒素、(1→3)-β-D-葡聚糖(以下简称为“葡聚糖”)。
对于内毒素、葡聚糖，例如可使用鲎血细胞提取液(鲎·阿米巴状细胞·裂解物)进行测定。鲎血细胞提取液也称为鲎试剂或鲎·阿米巴状细胞·裂解物(LAL)试剂，使用其测定来源于微生物的物质的试验也称为鲎试验。
具体而言，鲎试验可通过使包含来源于微生物的物质的试样(被检物)、鲎试剂、及鲎试验的检出用底物(以下简称为“检出用底物”)接触来进行。在被检物中存在来源于微生物的物质(具体而言，内毒素、葡聚糖)的情况下，包含于鲎试剂的各因子(C因子、B因子、G因子、凝固酶原。以下，个别称为或总称为“鲎因子”)被依次激活而进行级联反应。
例如当被检物中存在内毒素时，进行连续发生内毒素引起的C因子的激活(活性型C因子的生成)、活性型C因子引起的B因子的激活(活性型B因子的生成)、及活性型B因子引起的凝固酶原的激活(凝固酶的生成)的级联反应。另外，例如当被检物中存在葡聚糖时，进行连续发生葡聚糖引起的G因子的激活(活性型G因子的生成)、及活性型G因子引起的凝固酶原的激活(凝固酶的生成)的级联反应。因此，可通过对激活的任意鲎因子的量、级联反应的进行予以测定来测定鲎试验的测定对象物质。级联反应的进行的测定例如可通过测定凝固酶的量来进行。
本发明的测定方法1例如可使用包含鲎的鲎因子(分解酶的前体)的测定用试剂进行。该测定用试剂只要含有鲎因子就没有特别限制。作为这样的试剂可列举鲎试剂。鲎试剂可以是以鲎的血细胞为原料并按照常规方法获取的试剂。另外，鲎试剂也可是将该获取物进行适当分离和/或精制等而获取的试剂。
本发明中的鲎可以是任意的种。作为鲎，例如可列举：作为亚洲产鲎的中国鲎(Tachypleus tridentatus)、作为美洲产鲎的美洲鲎(Limulus polyphemus)、以及作为东南亚产鲎的圆尾鲎(Carcinoscorpius rotundicauda)及巨鲎(Tachypleus gigas)，可以是它们中任意的种。鲎优选为中国鲎(Tachypleus tridentatus)或美洲鲎(Limuluspolyphemus)，更优选为美洲鲎(Limulus polyphemus)。
鲎试剂例如可以是市售的试剂。例如，作为鲎试剂，市售有：ENDOSPECY(生化学工业株式会社)、Pyrochrome(Associates of Cape Cod，Inc.)、Pyrotell-T(Associates ofCape Cod，Inc.)、Pyrotell Multi Test(Associates of Cape Cod，Inc.)、Kinetic-QCL(Lonza Walkersville，Inc.)、End chrome-K(Charles River Laboratories，Inc.)等，可在本发明的测定方法1中使用。
另外，鲎试剂例如也可是按照仅包含任意鲎因子的方式人为地进行重构而得的鲎试剂(以下称为“重构鲎试剂”)。重构鲎试剂只要以包含可与鲎试验的测定对象物质反应的鲎因子的方式构成就没有特别限制。
例如当鲎试验的测定对象物质为内毒素时，重构鲎试剂只要含有C因子作为鲎因子即可，可含有也可不含有其他鲎因子(B因子、G因子、凝固酶原)。另外，例如当鲎试验的测定对象物质为葡聚糖时，重构鲎试剂只要含有G因子作为鲎因子即可，可包含也可不包含其他鲎因子(C因子、B因子、凝固酶原)。
再构成重构鲎试剂例如可以通过进行精制、分离从鲎试剂除去任意鲎因子由此制备。另外，例如可将从鲎试剂分离的1种鲎因子作为重构鲎试剂，也可将2种以上的分离的鲎因子混合后作为重构鲎试剂。
再构成重构鲎试剂的制备可适当组合公知的方法进行。重构鲎试剂的制备例如可参照文献(Nakamura T，Horiuchi T，Morita T，Iwanaga S.J Biochem.1986Mar；99(3)：847-57.)中记载的方法进行。
再构成重构鲎试剂所包含的鲎因子可以是从鲎获得的天然蛋白质，也可以是重组蛋白质。
天然的鲎因子可从上述鲎血细胞提取液获取。另外，重组的鲎因子可通过在使用编码鲎因子的核酸转化的宿主细胞中将该鲎因子表达来获取。宿主细胞的种类没有特别限制，例如可使用哺乳动物细胞、昆虫细胞。宿主细胞优选为哺乳动物细胞。作为哺乳动物细胞，可列举：来源于中国仓鼠卵巢的细胞系(CHO细胞)、来源于人胚肾细胞的细胞系(HEK细胞)。作为HEK细胞可列举HEK293细胞。
利用宿主细胞的重组蛋白质的表达可按照常规方法进行。例如可参照文献(国际公开第2012/118226号、国际公开第2014/092079)中公开的方法进行。鲎因子的氨基酸序列、编码其的基因的碱基序列可从公知的数据库获取。作为公知的数据库，例如可列举NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。对于被表达的各重组蛋白质而言，例如可将培养宿主细胞而得到的培养液原样用作鲎因子，也可根据需要进行期望的程度的精制后用作鲎因子。
对于重构鲎试剂中包含的鲎因子而言，全部鲎因子可以均为天然蛋白质，全部鲎因子也可以均为重组蛋白质，也可是天然蛋白质与重组蛋白质适当组合而得的蛋白质。另外，重构鲎试剂例如也可是将鲎试剂本身或将鲎试剂适当进行分离和/或精制等后与天然和/或重组的鲎因子适当组合而得的鲎试剂。
检出用底物优选为用于对激活的鲎因子的量、级联反应的进行予以测定的鲎因子的底物。检出用底物只要可作为鲎因子的底物发挥作用就没有特别限制。检出用底物优选为包含蛋白质、多肽、或肽作为底物的本发明的测定用底物。检出用底物可以是包含天然蛋白质等作为底物的本发明的测定用底物，也可是包含重组蛋白质等作为底物的本发明的测定用底物。作为蛋白质，可列举作为级联反应的最终产物的凝固酶的底物、即凝固蛋白原(Coagulogen)。例如，天然的凝固蛋白原可从鲎血细胞提取液制备。另外，例如，重组的凝固蛋白原可参照文献(宫田等，蛋白质核酸酶分卷No.29；P30-43；1986)中公开的方法制备。
另外，当底物为多肽、肽时，底物也可是化学合成的合成底物。合成底物只要是适合于对激活的鲎因子的量、级联反应的进行予以测定的底物就没有特别限制。这样的底物可以是用于测定凝固酶的底物，也可是用于对在级联反应的中途阶段存在的被激活的鲎因子进行测定的底物。合成底物优选为肽。
作为包含合成底物的检出用底物，可列举由通式Y-Xp-Z(式中，Y为保护基，Xp为肽、Z为与Xp键合的标记物质(残基))表示的底物。这样的合成底物只要具有如下性质即可：可利用被激活的鲎因子而将Xp-Z间的键切断从而标记物质Z发生游离。Xp-Z间的键优选为酰胺键。
保护基Y没有特别限制，可适当使用可适用于肽的公知的保护基。作为这样的保护基，可列举：苄氧羰基、叔丁氧羰基、苄基、苯甲酰基、乙酰基。作为肽Xp，可列举：Asp-Pro-Arg(DPR)、Val-Pro-Arg(VPR)、Leu-Thr-Arg(LTR)、Met-Thr-Arg(MTR)、Leu-Gly-Arg(LGR)、Ile-Glu-Gly-Arg(IEGR)(序列编号1)、Glu-Gly-Arg(EGR)。标记物质Z可使用本发明的标记物中的任意化合物。
对于合成底物而言，可根据作为检出对象的鲎因子的种类来适当选择使用合适的合成底物。例如，作为肽Xp，从底物特异性的观点出发，包含LGR或IEGR的底物可适合地用于凝固酶的测定，包含LTR或MTR的底物可适合地用于活性型B因子的测定，包含VPR或DPR的底物可适合地用于活性型C因子的测定，包含EGR的底物可适合地用于活性型G因子的测定。
在使用重构鲎试剂的鲎试验中，在使用2种以上的鲎因子的情况下，各鲎因子可从与被检物接触的工序的最初起就全部包含于反应液中，也可逐步添加至反应液中。
检出用底物可以以任意顺序添加至反应液中。例如，检出用底物可从使被检物与鲎试剂接触的工序之前起就包含于反应液中，也可在该工序之中或之后添加至反应液中。另外，在使用预先含有检出用底物的鲎试剂的情况下，可以不向反应液中另外添加检出用底物。
在本发明中电化学测定法可以是任意方法。作为电化学测定法，可列举：伏安法、安培法。电化学测定法优选为安培法。电化学测定法例如可参照文献(特开2015-187607)中公开的方法进行。
本发明的测定方法1可包括其他的任意工序。例如，如上所述，本发明的测定方法1可包括向反应液中添加检出用底物的工序。另外，本发明的测定方法1例如也可包括向反应液中添加鲎试剂的工序。本发明的测定方法1例如可以是包括如下工序的测定对象物质的测定方法：使作为本发明的测定用底物的检出用底物、测定对象物质、及鲎试剂接触的工序；以及用电化学测定法测定从该测定用底物游离的标记物的工序。
进而，本发明的测定方法1例如也可包括将通过测定得到的数据转换为其他数据的工序。作为将通过测定得到的数据转换为其他数据的工序，例如可列举：基于通过测定得到的数据算出测定对象物质的量的工序。具体而言，这样的工序例如为，基于将被检物置换为浓度已知的标准物质进行测定时所得到的测定值与标准物质的浓度的关系(标准曲线)，将测定被检物时得到的测定值转换为测定对象物质的量的工序。
在本发明的测定方法1中，优选反应在水或缓冲液等水性溶剂中进行。
通过进行本发明的测定方法1，能够高灵敏度且稳定地对测定对象物质进行测定。
<4>本发明的酶活性的测定方法
本发明的酶活性的测定方法(以下称为“本发明的测定方法2”)是以使用本发明的测定用底物为特征的利用电化学测定法测定分解酶的活性的方法。本发明的测定方法2例如是包括如下工序的酶活性的测定方法：使本发明的测定用底物与分解酶接触的工序；及测定从该测定用底物游离的标记物的工序。本发明的测定方法2与本发明的测定方法1同样可包括其他任选工序。其他工序例如可以是基于标准曲线将通过测定得到的数据(测定值)转换为分解酶的量的工序。本发明的测定方法2中的分解酶、各工序等的说明可以适用上述<3>本发明的测定对象物质的测定方法的记载。
<5>本发明的试剂盒
本发明的试剂盒为包含本发明的标记物、和/或本发明的测定用底物作为构件的试剂盒。本发明的试剂盒例如可用于制备本发明的测定用底物、和/或进行本发明的测定方法1或本发明的测定方法2。
本发明的试剂盒只要包含本发明的标记物、和/或本发明的测定用底物作为构件就可以进一步包含其他构件。作为此处所述的其他构件，例如可列举：缩合剂、鲎试剂、缓冲液、蒸馏水、标准物质(蛋白酶标准品、内毒素、葡聚糖等来源于微生物的物质等)、微板、及记载有产品信息的文档附件。
鲎试剂所包含的各鲎因子、本发明的测定用底物可作为混合物包含于本发明的试剂盒中，也可分别单独地或以任意组合单独地包含于本发明的试剂盒中。
通过使用这样的本发明的试剂盒，可简便地进行本发明的测定用底物的制备、利用电化学测定法的测定。
实施例
以下，基于实施例对本发明进行具体说明，但本发明的技术范围并不仅限于这些实施例。
<参考例1>标记物及测定用底物的获得
作为标记物的对氨基苯酚(pAP)、N，N-二甲基对苯二胺(DMPD)、及N-甲基对苯二胺(MPDD)由和光纯药工业株式会社购入。使这些标记物与Cbz-Leu-Gly-Arg(Cbz-LGR)进行酰胺键合得到的测定用底物、即Cbz-LGR-pAP、Cbz-LGR-DMPD、Cbz-LGR-MPDD为委托渡边化学工业株式会社合成而获得。在本申请的实施例中，使用制备为TFA(三氟醋酸)盐的测定用底物。
以下，将Cbz-LGR-pAP、Cbz-LGR-DMPD、Cbz-LGR-MPDD分别缩写为LGR-pAP、LGR-DMPD、LGR-MPDD。
<参考例2>定量性的评价
阶段性地改变底物与游离分子(标记物)的混合比例进行循环伏安法测定，结果在LGR-pAP与pAP的混合溶液的伏安曲线中确认到0.15V与0.49V这2个氧化峰。根据底物分子及游离分子的单独的伏安曲线，认为0.49V附近的峰来源于LGR-pAP的氧化、0.15V附近的峰来源于pAP的氧化。同样地，根据LGR-DMPD与DMPD的混合溶液的伏安曲线，在0.45V附近确认到来源于LGR-DMPD的氧化峰、在0.19V附近确认到来源于的DMPD的氧化峰。进而，根据LGR-MPDD与MPDD的混合溶液的伏安曲线，在0.46V附近确认到来源于LGR-MPDD的氧化峰、在0.14V附近确认到来源于MPDD的氧化峰。进而，无论采用哪种底物，游离分子的氧化峰电流值均随游离分子的比例提高而增大。由此认为，在安培法中可在相对于Ag/AgCl为0.3V的电位下对各混合溶液中的游离分子的浓度进行定量。接着，在各混合溶液中进行计时安培法测定。使作用电极的电位变为相对于Ag/AgCl为0.3V，基于紧随其后(第0秒)开始的电流值的时间变化，相对于混合溶液中的游离分子的浓度标绘第20秒的电流值，结果pAP的决定系数为R2＝0.9973、DMPD的决定系数为R2＝0.9986、MPDD的决定系数为R2＝0.9972，确认到较高的线性。
<实施例1>标记物及测定用底物的稳定性的评价
针对由上述<参考例1>获得的标记物及测定用底物，对化合物的稳定性进行评价。
将标记物(pAP、MPDD、DMPD)及测定用底物(LGR-pAP、LGR-MPDD、LGR-DMPD)分别溶解于0.1M的HEPES(pH为7.8)从而制备为1mM，在37℃的培养箱中静置1～24小时。此后，按照以下步骤进行试验。
<电化学测定法>
作为电化学测定法，使用了循环伏安法和电位阶跃计时伏安法。测定仪器、工作电极、参比电极、及对电极使用了下述的<测定条件>中记载的物品。在不论哪次测定时，均将工作电极、参比电极、及对电极插入溶液中，分别与恒电位仪的工作电极、参比电极及对电极端子连接。工作电极每完成1次测量，以0.05μm研磨用氧化铝研磨电极表面，以超纯水进行充分洗净。在循环伏安法测定中，将初始电位和结束电位设定为0V、将第1折返电位设定为0.4V(对于LGR-pAP、LGR-DMPD为0.6V、对于LGR-MPDD为0.7V)、将第2折返电位设定为-0.2V进行电位扫描，对电流进行监测。在电位阶跃计时安培法测定中，对工作电极施加10秒钟0.0V后使电位瞬间变为0.3V，监测电流35秒钟。
<测定条件>
测定仪器：恒电位仪(CompactStat、IVIUM公司制造)
工作电极：直径1mm玻碳盘电极(BAS公司制造)
参比电极：银-氯化银电极
对电极：铂电极
<底物及游离分子的稳定性的确认>
使用0.1M的HEPES(pH＝7.8)制备各底物(LGR-pAP、LGR-MPDD、LGR-DMPD)及游离分子(pAP、MPDD、DMPD)的试验溶液(1.0mM)50mL，投入到容积50mL的塑料离心管(IWAKI公司制造)在遮光条件下以37℃静置。经过规定时间(0.5小时、1小时、2小时、4小时、24小时)时从试验溶液采样5mL进行循环伏安法测定。对于MPDD，也进行经过6小时及8小时时的测定。另外，使用刚制备完的试验溶液进行规定时间为0小时的测定。
<游离分子的定量评价>
使用0.1M的HEPES(pH＝7.8)制备1.0mM的LGR-pAP溶液与1.0mM的pAP溶液，将它们以100：0、75：25、50：50、25：75、或0：100的比率混合，制备pAP的浓度阶段性变化的混合溶液。LGR-DMPD溶液与DMPD溶液的混合溶液及LGR-MPDD溶液与MPDD溶液的混合溶液也同样制备。对这些混合溶液进行循环伏安法测定。
对在遮光条件下以37℃静置的各合成底物及游离分子进行循环伏安法测定的结果是，根据合成底物的测定结果，合成底物其伏安曲线的形状24小时内几乎不变，可知其稳定。认为在实际的内毒素检出中的1小时的反应时间内，合成底物不会劣化。另一方面，根据游离分子的测定结果，游离分子其伏安曲线的形状在24小时内逐渐变化，可知其与合成底物相比稳定性低。结果示于表1。
【表1】
表1
表1所示的数值为，在各游离分子的伏安曲线中，将刚制备完(0小时)的氧化峰电流值设为100％的情况下，将经过规定时间后的各游离分子的伏安曲线中的峰的高度相对性地表示的数值。由于内毒素的检出通常在1小时以内结束，因此对于制备后1小时的pAP、DMPD及MPDD的伏安曲线的氧化峰电流值，以溶液刚制备完时为基准进行比较，结果分别为95.0％、94.3％及102.3％。
如表1所示，在作为由于鲎反应而从测定用底物游离的物质的标记物之中，确认pAP与DMPD的检出值倾向于在制备后2小时以内随时间的经过而降低。但是未发现MPDD的检出值在制备后2小时以内降低。
由上可知，与pAP相比，MPDD稳定，因此是可稳定地进行测定的标记物。
<实施例2>鲎试验(1)
使用由上述<参考例1>获得的测定用底物实施鲎试验，利用安培法测定内毒素。作为鲎试剂，使用了由美洲鲎(Limulus polyphemus)制备的裂解物试剂即ENDOSPECY ES-24S(生化学工业株式会社制造)。在以下记载的步骤中，将ENDOSPECY ES-24S缩写为ES-24S。试验步骤如下所述。
<鲎反应>
按照日本药典规定的方法，将标准内毒素试样(USP-RSE)溶解于注射用水(大塚制药株式会社制造)，制备成20000EU/L、2000EU/L、200EU/L、20EU/L、2EU/L、0EU/L的内毒素溶液。另外，使用ES-24S附属的缓冲液制备1.0mM的LGR-pAP的溶液，使用该溶液将ES-24S鲎试剂溶解。将各浓度的内毒素溶液与包含LGR-pAP的鲎试剂以1：1的体积比混合，在37℃下反应1小时后，进行计时安培法测定。对于LGR-DMPD及LGR-MPDD以同样的步骤进行试验。此外，20000EU/L的溶液仅进行1次测定，2000EU/L、200EU/L、20EU/L、2EU/L、0EU/L的溶液则改变测定日进行3次从溶液的制备到测定的试验。
<测定条件>
与上述<实施例1>的<测定条件>中记载的条件相同。
结果示于表2。
【表2】
表2
表2所示的数值为使用各底物进行3次鲎试验时的测定值(电流图中20秒后的电流值/μA)的平均值与标准偏差。在本实施例中，将0EU/L的试样的测定值的平均值加上标准偏差的3倍的值而算出的值作为检出限，对在使用了各底物的情况下可测定的内毒素浓度的范围进行了评价。
由表2可知，在使用以往的测定用底物(LGR-pAP)的情况下，1EU/L的试样的测定值在检出限以下。另外，100EU/L的试样的测定值比1000EU/L的试样的测定值高。即，在使用以往的测定用底物(LGR-pAP)的情况下，内毒素浓度的可定量的范围为10～100EU/L。
与之相对，在使用了本发明的测定用底物(LGR-MPDD、LGR-DMPD)的情况下，1EU/L的试样的测定值超过检出限，且在1～1000EU/L的内毒素浓度的范围内测定值与内毒素浓度成比例增加。即，表明了在使用本发明的测定用底物(LGR-MPDD、LGR-DMPD)的情况下，内毒素浓度的可定量的范围为1～1000EU/L，与使用以往的测定用底物(LGR-pAP)的情况相比，可定量范围广的内毒素浓度。
另外发现，使用本发明的测定用底物(LGR-MPDD、LGR-DMPD)进行测定的情况下的标准偏差的值倾向于小于使用以往的测定用底物(LGR-pAP)进行测定的情况下的标准偏差的值。即，表明通过使用MPDD、DMPD作为标记分子可进行降低了日间误差的稳定的测定。进而，在使用本发明的测定用底物(LGR-MPDD、LGR-DMPD)进行测定的情况下，0EU/L的试样的测定值比使用LGR-pAP进行测定的情况下小，表明可将测定值的本底抑制为较低。
<实施例3>鲎试验(2)
使用由上述<参考例1>获得的测定用底物实施鲎试验，利用伏安法测定内毒素。试验步骤如下所述。
<鲎反应>
除了进行循环伏安法测定来代替计时安培法测定以外，与上述<实施例2>的<鲎反应>中记载的条件相同。
<测定条件>
与上述<实施例1>的<测定条件>中记载的条件相同。
利用伏安法进行测定的结果为，在使用LGR-pAP、LGR-DMPD、及LGR-MPDD中的任一个作为底物的情况下，在内毒素不存在(0EU/L)时均仅观察到底物的氧化峰。另一方面，在内毒素存在时，确认到随着内毒素浓度的上升，游离分子引起的氧化峰增大。另外，在使用以往的测定用底物(LGR-pAP)作为底物时，与以100EU/L的试样为测定对象的情况下相比，以1000EU/L的试样为测定对象的情况下游离分子引起的氧化峰减少。与之相对，在使用本发明的测定用底物(LGR-MPDD、LGR-DMPD)时，在1～1000EU/L的内毒素浓度的范围中，游离分子引起的氧化峰与内毒素浓度成比例地增大。即，表明在使用伏安法作为电化学测定法的情况下，可与使用安培法的情况同样地测定内毒素浓度。
在此时的伏安曲线中，以1000EU/L的试样作为测定对象的情况下的游离分子引起的氧化峰的电流值在以LGR-DMPD为底物时为0.31μA、在以LGR-MPDD为底物时为0.60μA。另一方面，在专利文献1的图9中公开了作为以对甲氧基苯胺(pMA)标记的底物的LGR-pMA的伏安曲线，其中，当以1000EU/L的试样作为测定对象时游离分子引起的氧化峰的电流值约为0.3μA。即表明通过使用本发明的标记物(MPDD或DMPD)可得到与使用以往的标记物(pMA)的情况下同等以上的电流值。特别是在使用MPDD作为标记物的情况下，可知与使用pMA的情况相比可得到约2倍的电流值，因此可对内毒素进行高灵敏度的测定。
另外，<参考例2>中显示的结果表明，0.5mM的DMPD及MPDD引起的氧化峰电流值分别为约0.9μA及约1.1μA。另一方面，在专利文献1的图4中示出1mM的pMA引起的氧化峰电流值为约3.0μA，因此0.5mM的pMA引起的氧化峰电流值为约1.5μA。即，根据游离分子本身的测定结果，推测本发明的测定用底物的制备中使用的标记物即MPDD及DMPD中的任意一个与以往的标记物即pMA相比都显示较低的电流值。但是，专利文献1的图8中表明，在与底物(LGR)键合并提供给鲎试验时所得到的氧化峰电流值的最大值(上限)在使用LGR-pMA的情况下为约0.28μA，与之相对，在使用本发明的测定用底物即LGR-DMPD及LGR-MPDD时为0.31μA及0.60μA。这些数值示于表3。
【表3】
表3
在表3中，测定值A表示将0.5mM的各标记物本身以伏安法进行测定时的氧化峰电流值，测定值B表示将各标记物与肽(LGR)键合而成的测定用底物(0.5mM)提供给鲎试验所得到的氧化峰电流值的最大值。
即，不论在使用哪个标记物的情况下，与根据摩尔浓度推测的氧化峰电流值相比，与肽键合并提供给鲎试验后所得到的氧化峰电流值的最大值(上限)都倾向于降低，但是与使用以往的标记物即pMA的情况下相比，在使用本发明的标记物即MPDD及DMPD的情况下降低的程度缓和，表明可高效地在电化学测定法中予以检测。本领域技术人员根据标记物单独的测定值考虑，会预期将pMA用于测定用底物时能更高效地在电化学测定法中予以检测，但是结果是MPDD及DMPD的情况下能更高效地予以检测，这是预料外的。该结果对于MPDD尤为显著。
产业上的可利用性
根据本发明，能够高灵敏度且稳定地进行利用电化学测定法的测定。因此，本发明在临床上、在研究上都非常有用。
日本专利申请第2016-026925号(申请日：2016年2月16日)的公开内容通过引用而整体并入本说明书。本说明书中记载的全部文献、专利申请、以及技术标准通过引用与各个文献、专利申请、以及技术标准通过引用而具体且分别记载的情况相同程度地并入本说明书。

Claims (18)

1.一种标记物，其用于标记底物而形成适合于利用电化学测定法的测定的测定用底物，其包含由下述通式(1)表示的结构，
在所述式(1)中，R1为H或烷基即CmH2m+1，m为1～4的整数，R2为烷基即CnH2n+1，n为1～4的整数。
2.根据权利要求1所述的标记物，其中，
R1为H或甲基即CH3，R2为甲基即CH3。
3.一种适合于利用电化学测定法的测定的测定用底物，
其包含以权利要求1或2所述的标记物标记而成的底物作为结构。
4.一种适合于利用电化学测定法的测定的测定用底物，其包含由下述通式(2)表示的以权利要求1或2所述的标记物标记而成的底物作为结构，
在所述式(2)中，X1为底物，R1为H或烷基即CmH2m+1，m为1～4的整数，R2为烷基即CnH2n+1，n为1～4的整数。
5.一种适合于利用电化学测定法的测定的具有酰胺键的测定用底物，其包含由下述通式(3)表示的、以权利要求1或2所述的标记物标记而成的底物作为结构，
在所述式(3)中，X2为底物，R1为H或烷基即CmH2m+1，m为1～4的整数，R2为烷基即CnH2n+1，n为1～4的整数。
6.根据权利要求3～5中任一项所述的测定用底物，其中，
底物为肽。
7.根据权利要求6所述的测定用底物，其中，
酰胺键即-CO-NH-为通过肽的C末端的羧基与权利要求1或2所述的标记物的氨基的反应而生成的共价键。
8.根据权利要求6或7所述的测定用底物，其中，
肽为在C末端具有Arg残基的肽，Arg也记作R。
9.根据权利要求6～8中任一项所述的测定用底物，其中，
肽为由下述通式(a)～(g)中的任一式表示的肽，
在所述式(a)～(g)中，Y存在或不存在，在Y存在的情况下Y为肽的N末端的氨基酸的氨基的保护基。
10.根据权利要求9所述的测定用底物，其中，
保护基为Cbz即苄氧羰基、或Boc即叔丁氧羰基。
11.一种利用电化学测定法的测定方法，其使用权利要求3～10中任一项所述的测定用底物。
12.根据权利要求11所述的测定方法，其中，
测定方法为包括下述(1)以及(2)的工序的测定对象物质的测定方法：
(1)在测定对象物质的存在下，使权利要求3～10中任一项所述的测定用底物与分解该底物的酶接触的工序；
(2)利用电化学测定法测定从所述(1)的测定用底物游离的标记物的工序。
13.根据权利要求12所述的测定方法，其中，
测定对象物质为来源于微生物的物质。
14.根据权利要求13所述的测定方法，其中，
来源于微生物的物质为内毒素和/或(1→3)-β-D-葡聚糖。
15.根据权利要求12～14中任一项所述的测定方法，其中，
分解酶为鲎的C因子、B因子、G因子、和/或凝固酶原。
16.根据权利要求11所述的测定方法，其中，
测定方法为包括下述(1)以及(2)的工序的酶活性的测定方法：
(1)使权利要求3～10中任一项所述的测定用底物与分解该底物的酶接触的工序；
(2)利用电化学测定法测定从所述(1)的测定用底物游离的标记物的工序。
17.根据权利要求11～16中任一项所述的测定方法，其中，
电化学测定法为伏安法或安培法。
18.一种试剂盒，其包含权利要求1或2所述的标记物、和/或权利要求3～10中任一项所述的测定用底物作为构件。
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