CN110366592A - 鲎b因子改变体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种与鲎B因子改变体有关的技术，进而提供一种以高灵敏度进行内毒素测定的手段。制造具有在鲎B因子的多肽的氨基酸序列中第193位的氨基酸残基被置换为半胱氨酸(Cys)残基的氨基酸序列的多肽。通过将该多肽和鲎C因子组合而构成鲎试剂，可以以高灵敏度进行内毒素测定。

Description

鲎B因子改变体
技术领域
本发明涉及一种鲎B因子改变体。
背景技术
在医药和食品的卫生管理以及包含人在内的动物的诊断中，检出源自微生物的物质、测定微生物污染的程度的手段是重要的。作为测定微生物污染的程度的手段，鲎试验正在普及。鲎试验是将内毒素(LPS)或(1→3)-β-D-葡聚糖作为测定对象物质而测定微生物污染程度的技术，是利用了鲎所具有的蛋白酶前体会被这些测定对象物质活化的性质的测定方法。
作为鲎试验，使用鲎血细胞提取液(鲎阿米巴样细胞裂解物。以下，简称为“细胞裂解物”)的方法正在普及。该方法为利用在丝氨酸蛋白酶前体(C因子、B因子及凝固酶原)接触内毒素时或在丝氨酸蛋白酶前体(G因子及凝固酶原)接触(1→3)-β-D-葡聚糖时被逐次活化而进行的级联反应的方法。
非专利文献1中公开有一种从细胞裂解物中分离的中华鲎B因子。另外，非专利文献2中公开有一种中华鲎B因子的多肽的氨基酸序列。但是，任一个文献都没有公开与B因子本身相比具有优异的酶特性的B因子改变体。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Nakamura,T.,Horiuchi,T.,Morita,T.,Iwanaga,S.(1986)J.Biochem.99,847-57
非专利文献2：Muta,T.,Oda,T.,Iwanaga,S.(1993)J.Biol.Chem.268,21384-8
发明内容
发明所要解决的技术问题
本发明的课题在于，提供一种与鲎B因子改变体有关的技术。详细而言，本发明的课题在于，提供一种鲎B因子改变体的多肽、编码该多肽的核酸、保有该核酸的载体、保有该核酸和/或该载体的细胞、该多肽的制造方法、使用有该多肽的内毒素的测定方法、含有该多肽作为构成成分的内毒素测定用试剂、及含有该多肽或该试剂作为构成成分的内毒素测定用试剂盒等。
用于解决问题的技术方案
本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现：通过在鲎B因子的多肽的氨基酸序列中改变特定部位的氨基酸残基，可得到与鲎B因子本身相比具有更优异的蛋白酶活性的B因子改变体。另外，本发明人等通过上述还发现：可得到与鲎B因子本身相比具有更优异的热稳定性的B因子改变体。本发明人等基于这些见解，完成了本发明。
上述课题可以通过包含以下的方式的本发明来解决。
[1]一种多肽，其具有在鲎B因子的多肽的氨基酸序列中第193位的氨基酸残基被置换为半胱氨酸(Cys)残基的氨基酸序列。
[2]一种多肽，其用下述(A)～(D)的任一个表示。
(A)具有下述(A1)或(A2)所示的氨基酸序列的多肽。
(A1)序列号7中的氨基酸编号1～400所示的氨基酸序列。
(A2)序列号7中的氨基酸编号24～400所示的氨基酸序列。
(B)下述(B1)或(B2)所示的具有氨基酸序列的多肽。
(B1)序列号10中的氨基酸编号1～400所示的氨基酸序列。
(B2)序列号10中的氨基酸编号24～400所示的氨基酸序列。
(C)具有在所述(A)或(B)所示的多肽的氨基酸序列中置换、缺失、插入、和/或添加1个或多个氨基酸残基而成的氨基酸序列(其中，第193位的半胱氨酸(Cys)残基既不被置换也不缺失)、且具有鲎B因子的功能的多肽。
(D)具有在所述(A)～(C)的任一个所示的多肽中添加肽标签而成的融合多肽的氨基酸序列、且具有鲎B因子的功能的多肽。
[3]一种核酸，其编码上述[1]或[2]所述的多肽。
[4]一种DNA，其用下述(a)～(d)的任一个表示。
(a)具有下述(a1)～(a4)的任一个所示的碱基序列的DNA。
(a1)序列号5中的碱基编号1～1200所示的碱基序列。
(a2)序列号5中的碱基编号70～1200所示的碱基序列。
(a3)序列号6中的碱基编号1～1200所示的碱基序列。
(a4)序列号6中的碱基编号70～1200所示的碱基序列。
(b)具有下述(b1)～(b4)的任一个所示的碱基序列的DNA。
(b1)序列号8中的碱基编号1～1200所示的碱基序列。
(b2)序列号8中的碱基编号70～1200所示的碱基序列。
(b3)序列号9中的碱基编号1～1200所示的碱基序列。
(b4)序列号9中的碱基编号70～1200所示的碱基序列。
(c)与由和上述(a)或(b)所示的DNA互补的碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交(其中，碱基编号577～579所示的碱基保守)、且编码具有鲎B因子的功能的多肽的DNA。
(d)具有在上述(a)～(c)的任一个所示的DNA中添加编码肽标签的DNA而成的融合DNA的碱基序列、且编码具有鲎B因子的功能的多肽的DNA。
[5]一种载体，其保有上述[3]所述的核酸、和/或上述[4]所述的DNA。
[6]一种细胞，其保有上述[3]所述的核酸、上述[4]所述的DNA、和/或上述[5]所述的载体。
[7]一种多肽的制造方法，其包含以下工序：
使用上述[6]所述的细胞生成具有鲎B因子的功能的多肽。
[8]一种多肽，其通过上述[7]所述的方法而得到。
[9]一种内毒素的测定方法，其包含下述(1)及(2)的工序。
(1)将上述[1]、[2]或[8]所述的多肽、鲎C因子、及待测试样进行混合的工序；
(2)测定上述多肽的蛋白酶活性的工序。
[10]一种内毒素测定用试剂，其含有上述[1]、[2]或[8]所述的多肽作为构成成分。
[11]一种内毒素测定用试剂盒，其含有上述[1]、[2]或[8]所述的多肽或上述[10]所述的试剂作为构成成分。
发明效果
根据本发明，可以提供一种与鲎B因子本身相比具有更优异的蛋白酶活性的B因子改变体。另外，根据本发明，可以提供一种与鲎B因子本身相比具有更优异的热稳定性的B因子改变体。
附图说明
图1是表示中华鲎B因子(TFB)和中华鲎B因子改变体(Murasame-TFB)的比活力(units/μmol)的图。
图2是表示中华鲎B因子(TFB)(○所示的图)和中华鲎B因子改变体(Murasame-TFB)(●所示的图)的热稳定性的图。
具体实施方式
本发明中，“鲎因子”是指：C因子、B因子及凝固酶原(凝固酶前体)中的单个或它们的总称。另外，本发明中，“鲎试剂”是指含有任意的鲎因子作为构成成分、被用于鲎试验的试剂。
本发明中，有时将接触了内毒素的C因子自催化而变成活性型(活性型C因子)、在该活性型C因子的蛋白酶活性作用下B因子被切断而变成活性型B因子的一系列的反应称为“级联反应”。另外，本发明中，除该一系列的反应之外，有时将还包含在该活性型B因子的蛋白酶活性作用下凝固酶原(凝固酶前体)被切断而变成凝固酶(凝固酶)的反应的一系列的反应称为“级联反应”。
＜1＞本发明的多肽
本发明的多肽为特征在于鲎B因子的多肽的氨基酸序列中特定部位的氨基酸残基被改变的多肽。具体而言，本发明的多肽为具有在鲎B因子的多肽的氨基酸序列中第193位的氨基酸残基被置换为半胱氨酸(Cys)残基的氨基酸序列的多肽。
已知鲎B因子的多肽的氨基酸序列中的、N末端的23残基作为信号序列起作用(非专利文献2)。因此本领域技术人员可以理解的是，在上述本发明的多肽中，除具有该信号序列的方式的多肽之外，不具有信号序列的方式的多肽(不具有N末端侧的23残基的方式的多肽)或具有其它信号序列(鲎本来具有的信号序列以外的信号序列)的方式的多肽也为上述本发明的多肽的一方式。
本发明中，鲎的种类没有特别限定。作为鲎，已知中华鲎(Tachypleustridentatus)、美洲鲎(Limulus polyphemus)、圆尾鲎(Carcinoscorpius rotundicauda)、南方鲎(Tachypleus gigas)的4种，可以将这些鲎作为本发明中的鲎来例示。本发明的多肽例如为具有在这些鲎中的B因子的多肽的氨基酸序列中第193位的氨基酸残基被置换为半胱氨酸(Cys)残基的氨基酸序列的多肽。
本发明中，鲎优选为中华鲎、美洲鲎或圆尾鲎，更优选为中华鲎或美洲鲎。
作为本发明的多肽，具体而言，可例示下述(A)～(D)的任一个所示的多肽。
(A)具有下述(A1)或(A2)所示的氨基酸序列的多肽。
(A1)序列号7中的氨基酸编号1～400所示的氨基酸序列。
(A2)序列号7中的氨基酸编号24～400所示的氨基酸序列。
(B)具有下述(B1)或(B2)所示的氨基酸序列的多肽。
(B1)序列号10中的氨基酸编号1～400所示的氨基酸序列。
(B2)序列号10中的氨基酸编号24～400所示的氨基酸序列。
(C)具有在上述(A)或(B)所示的多肽的氨基酸序列中置换、缺失、插入、和/或添加1个或多个氨基酸残基而成的氨基酸序列(其中，第193位的半胱氨酸(Cys)残基既不被置换也不缺失)、且具有鲎B因子的功能的多肽。
(D)具有在上述(A)～(C)的任一个所示的多肽中添加肽标签而成的融合多肽的氨基酸序列、且具有鲎B因子的功能的多肽。
本发明中，“具有氨基酸序列的多肽”包含“由该氨基酸序列构成的多肽”作为一方式。
上述(A)中所说的序列号7所示的氨基酸序列为中华鲎B因子的多肽的氨基酸序列(序列号2)中的第193位的氨基酸残基被置换为半胱氨酸(Cys)残基而成的氨基酸序列。
上述(B)中所说的序列号10所示的氨基酸序列为美洲鲎B因子的多肽的氨基酸序列(序列号4)中的第193位的氨基酸残基被置换为半胱氨酸(Cys)残基而成的氨基酸序列。
上述(C)所示的多肽的氨基酸序列为在上述(A)或(B)所示的多肽的氨基酸序列中置换、缺失、插入、和/或添加1个或多个氨基酸残基而成、但第193位的半胱氨酸(Cys)残基既不被置换也不缺失(第193位的Cys残基保守)的氨基酸序列。需要说明的是，上述第193位的半胱氨酸(Cys)残基表示在序列号7或10的氨基酸序列中保守的半胱氨酸(Cys)残基的位置。因此，在上述(A)或(B)所示的多肽的氨基酸序列中置换、缺失、插入、和/或添加1个或多个氨基酸残基而成的氨基酸序列(即，上述(C)所示的氨基酸序列)中保守的半胱氨酸(Cys)残基为在与原来的氨基酸序列(上述(A)或(B)所示的多肽的氨基酸序列)的比对中相当于上述第193位的半胱氨酸(Cys)残基的位置的半胱氨酸(Cys)残基。
上述(C)中所说的“多个”意指即使置换、缺失、插入、和/或添加、多肽也不丧失鲎B因子的功能的程度的氨基酸残基的数(总数)。例如，相对于构成多肽的氨基酸残基的总数，“多个”可以为优选10％以下、更优选5％以下、进一步优选2％以下、特别优选1％以下的数。
因此，上述(A1)或(B1)所示的多肽的氨基酸序列的情况下，氨基酸残基的总数为400个，因此，“多个”可以为优选2～40个、更优选2～20个、进一步优选2～8个、特别优选2～4个。另外，上述(A2)或(B2)所示的多肽的氨基酸序列的情况下，氨基酸残基的总数为377个，因此，“多个”可以为优选2～37个、更优选2～18个、进一步优选2～7个、特别优选2～3个。上述(C)中“多个”作为具体的各个数，可以为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个等的整数。
上述(C)中所说的“置换、缺失、插入、和/或添加”例如为保守变异。保守变异的代表的变异为保守置换。就保守置换而言，在置换部位为芳香族氨基酸的情况下，为在Phe、Trp、Tyr间相互置换的变异，在置换部位为疏水性氨基酸的情况下，为在Leu、Ile、Val间相互置换的变异，在其为极性氨基酸的情况下，为在Gln、Asn间相互置换的变异，在其为碱基性氨基酸的情况下，为在Lys、Arg、His间相互置换的变异，在其为酸性氨基酸的情况下，为在Asp、Glu间相互置换的变异，在其为具有羟基的氨基酸的情况下，为在Ser、Thr间相互置换的变异。作为被看作保守置换的置换，具体而言，可例示：从Ala向Ser或Thr的置换、从Arg向Gln、His或Lys的置换、从Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的置换、从Asp向Asn、Glu或Gln的置换、从Cys向Ser或Ala的置换、从Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的置换、从Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的置换、从Gly向Pro的置换、从His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的置换、从Ile向Leu、Met、Val或Phe的置换、从Leu向Ile、Met、Val或Phe的置换、从Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的置换、从Met向Ile、Leu、Val或Phe的置换、从Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的置换、从Ser向Thr或Ala的置换、从Thr向Ser或Ala的置换、从Trp向Phe或Tyr的置换、从Tyr向His、Phe或Trp的置换、及从Val向Met、Ile或Leu的置换。
上述(C)所示的多肽例如也可以为相对于上述(A)或(B)所示的多肽的氨基酸序列具有优选90％以上、更优选95％以上、进一步优选98％以上、特别优选99％以上的类似性、且具有鲎B因子的功能的多肽(其中，第193位的半胱氨酸(Cys)残基保守)。需要说明的是，在此所说的“类似性”(similarity)为包含“一致性”(identity)的概念，因此，可以将类似性换成一致性而用于该多肽的优选方式。
就上述(C)所示的多肽而言，只要第193位的半胱氨酸(Cys)残基既不被置换也不缺失(第193位的Cys残基保守)即可，在上述(A)或(B)所示的多肽的氨基酸序列中其它的任意氨基酸残基均可以被置换或缺失，但优选在中华鲎B因子的多肽的氨基酸序列(序列号2)及美洲鲎B因子的多肽的氨基酸序列(序列号4)之间保守(存在于相同位置)的其它Cys残基也保守(既不被置换也不缺失)。上述(C)所示的多肽具体而言优选在上述(A)或(B)所示的多肽的氨基酸序列中112位、177位、第193位、260位、307位、329位、340位、368位的Cys残基保守(既不被置换也不缺失)。
上述(D)中所说的“肽标签”意指为了容易进行检测或纯化而添加于多肽的肽。就“肽标签”的长度及氨基酸序列而言，肽标签只要使在上述(A)～(C)的任一个所示的多肽中添加肽标签而成的融合多肽具有鲎B因子的功能就没有特别限定。作为这样的肽标签，可例示：6×His肽(His标签)、FLAG肽(FLAG标签)、c-myc肽(myc标签)、蛋白A、麦芽糖结合蛋白质(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)等。
肽标签既可以直接添加在上述(A)～(C)的任一个所示的多肽中，也可以借助任意的接头来添加。在此所说的“接头”可以为由任意的氨基酸序列构成的肽接头。在此所说的“肽接头”的长度及氨基酸序列与肽标签的情况同样，只要在上述(A)～(C)的任一个所示的多肽中添加有肽标签的融合多肽具有鲎B因子的功能，就没有特别限定。
肽标签例如可以添加在多肽的N末端和/或C末端。肽标签既可以仅添加在多肽的N末端侧，也可以仅添加在C末端侧，还可以添加在两末端。添加于多肽的肽标签既可以为1种，也可以为2种或其以上。另外，添加于多肽的各种肽标签可以分别独立地为1个，也可以为2个或其以上。
本发明中“鲎B因子的功能”意指作为鲎的B因子具有的蛋白酶前体的功能。“鲎B因子的功能”具体而言意指与活性型C因子接触而变成活性型(活性型B因子)、表现出蛋白酶活性的功能。
鲎B因子的功能例如为与活性型C因子接触而变成活性型(活性型B因子)、将凝固酶前体切断而变成凝固酶的功能。另外，鲎B因子的功能例如为与活性型C因子接触而变成活性型(活性型B因子)、将成为活性型B因子的底物的检测用底物切断而使标记物游离的功能。作为在此所说的C因子及凝固酶前体以及检测用底物，例如可以优选使用后述的本发明的测定方法中所记载的方式。
多肽是否具有鲎B因子的功能例如可以通过评价是否通过与活性型C因子接触而该多肽表现出蛋白酶活性来判定。多肽是否具有鲎B因子的功能具体而言例如可以通过后述的＜实施例2＞或＜实施例5＞中所记载的方法来判定。
另外，关于多肽是否具有鲎B因子的功能这一点，例如也可以通过评价在使用与C因子组合而构成的鲎试剂的情况下且内毒素共存时是否进行级联反应来判定。
进而，关于多肽是否具有鲎B因子的功能这一点，例如也可以通过评价在使用与C因子及凝固酶前体组合而构成的鲎试剂的情况下且内毒素共存时是否进行级联反应来判定。
因此，例如可以以鲎B因子的功能为指标，从上述(A)或(B)所示的氨基酸序列中选择能够不丧失鲎B因子的功能而进行1个或多个氨基酸残基的置换、缺失、插入、和/或添加的部位而得到上述(C)所示的多肽。另外，例如可以以鲎B因子的功能为指标，在上述(A)～(C)的任一个所示的多肽中选择可以添加肽标签且不丧失鲎B因子的功能的多肽而得到上述(D)所示的多肽。
本发明的多肽的一方式为与鲎B因子本身相比表现出更高的蛋白酶活性的多肽。鲎B因子本身具体而言为由与天然的鲎B因子相同的氨基酸序列构成的多肽。更具体而言，鲎B因子本身例如为由在上述(A)或(B)所示的氨基酸序列中、第193位的氨基酸残基被置换为丙氨酸(Ala)残基的氨基酸序列构成的多肽(由序列号2或4所示的氨基酸序列构成的多肽)。本发明的多肽例如可以为具有以下特征的多肽：与活性型C因子接触而变成活性型(活性型B因子)并表现出的蛋白酶活性(比活力)与鲎B因子本身相比为2倍以上、优选5倍以上、更优选10倍以上。另外，本发明的多肽例如可以为具有以下特征的多肽：与活性型C因子接触而变成活性型(活性型B因子)并表现出的蛋白酶活性(比活力)为80units/μmol以上、优选200units/μmol以上、更优选300units/μmol以上、特别优选400units/μmol以上。在此，1unit相当于在37℃下在1分钟内将1μmol的底物(检测用底物)切断的蛋白酶活性。酶活性(units/μmol)的测定条件具体而言例如可以为＜实施例2＞或＜实施例5＞所述的条件。
本发明的多肽的一方式为与鲎B因子本身相比具有高的热稳定性的多肽。本发明的多肽例如可以为具有以下特征的多肽：使在50℃下加热了2分钟的多肽与活性型C因子接触而变成活性型(活性型B因子)时表现出的蛋白酶活性(比活力)与未进行加热的多肽相比为50％以上、优选70％以上、更优选80％以上。另外，本发明的多肽例如可以为具有以下特征的多肽：即使在60℃、70℃、80℃或90℃下加热2分钟之后也不丧失鲎B因子的功能。
本发明的多肽例如可以为具有以下特征的多肽：使在60℃下加热了2分钟的多肽与活性型C因子接触而变成活性型(活性型B因子)时表现出的蛋白酶活性(比活力)与未进行加热的多肽相比为30％以上、优选50％以上、更优选70％以上。另外，本发明的多肽例如可以为具有以下特征的多肽：使在90℃下加热了2分钟的多肽与活性型C因子接触而变成活性型(活性型B因子)时表现出的蛋白酶活性(比活力)与未进行加热的多肽相比为20％以上、优选30％以上、更优选40％以上。
活性型B因子的蛋白酶活性例如可以通过后述的＜实施例2＞或＜实施例5＞中记载的、测定与活性型C因子接触而被活化的B因子(活性型B因子)的蛋白酶活性的方法来测定。
在此，在鲎的鲎因子中，多肽的氨基酸序列具有同源性，在种间具有高的类似性。氨基酸序列的类似性可以使用公知的计算机软件而算出，例如，可以使用算法BLAST(Karlin,S.,Altschul,SF.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90,5873-7)或FASTA(Pearson,WR.(1990)Methods.Enzymol.183,63-98)而算出。氨基酸序列的类似性具体而言例如可以使用GENETYX(GENETYX社制)而算出。
例如，中华鲎B因子的多肽(序列号2、NCBI编号：BAA03528.1)和美洲鲎B因子的多肽(序列号4、NCBI编号：XP_013784210.1)具有98.5％的类似性。
另外，例如，中华鲎C因子的多肽(序列号12、NCBI编号：BAA14315.1)和美洲鲎C因子的多肽(序列号14)具有99.5％的类似性，中华鲎C因子的多肽和圆尾鲎C因子的多肽(序列号16、NCBI编号：AAB34361.1)具有99.8％的类似性，美洲鲎C因子的多肽和圆尾鲎C因子的多肽具有99.4％的类似性。
进而，例如中华鲎凝固酶前体的多肽(序列号18、NCBI编号：AAA30094.1)和美洲鲎凝固酶前体的多肽(序列号20、NCBI编号：XP_013783518.1)具有96.0％的类似性。
因此本领域技术人员可以理解的是，本发明的技术已经在后述的实施例中通过中华鲎B因子及美洲鲎B因子的各多肽的改变而被证实，对其它鲎B因子的多肽也可以适用。本领域技术人员可以理解的是，例如虽然圆尾鲎B因子及南方鲎B因子的各多肽的氨基酸序列以及编码该多肽的碱基序列尚未得知，但是本发明的技术对这些B因子的多肽也可以适用。
本发明的多肽既可以为由本发明的多肽构成的方式，也可以为含有其它成分的方式。在此所说的“其它成分”只要是不使本发明的多肽丧失功能的成分，就没有特别限制。作为“其它成分”，可例示：缓冲剂、碱金属盐、碱土金属盐、表面活性剂。另外，作为“其它成分”，也可例示源自生成本发明的多肽的细胞的本发明的多肽以外的成分(核酸、蛋白质、糖质、脂质等)。
本发明的多肽可以为任意的形状。本发明的多肽例如可以为冷冻干燥物等固体状，也可以为溶解于水性溶剂等任意的溶剂的状态的液体状。
本发明的多肽中，本发明的多肽所占的重量浓度例如可以为0.001％以上、0.01％以上、0.1％以上、1％以上、5％以上、10％以上、25％以上、或50％以上。另外，本发明的多肽中，本发明的多肽所占的重量浓度例如可以为100％以下、75％以下、50％以下、25％以下、10％以下、5％以下、或1％以下。
本发明的多肽可以基于本说明书的记载、通过公知的方法来制备。本发明的多肽例如可以通过遗传工程的方法来制备。本发明的多肽具体而言例如可以通过后述的本发明的制造方法来制备。本发明的多肽例如既可以为按照该本发明的制造方法将细胞进行培养而得到的培养液本身，也可以为将该培养液纯化成所期望的程度的组分。
＜2＞本发明的核酸
本发明的核酸为编码本发明的多肽的核酸。本发明的核酸只要是编码本发明的多肽的核酸，就没有特别限定。本发明的核酸只要是编码本发明的多肽的核酸，则包含因遗传暗号(密码子)的简并(degeneracy)而不同、但具有编码相同的多肽的碱基序列的全部的核酸。在此所说的“核酸”中包含DNA及RNA。
本发明的核酸可以为双链，也可以为单链。在本发明的核酸为双链的情况下，也可以为由DNA和RNA构成的混合链。另外，由于本发明的核酸为编码本发明的多肽的核酸，因此，可以为在编码本发明的多肽的区域内具有内含子序列的核酸，也可以为在该区域内不具有内含子序列的核酸。进而，本发明的核酸可以为mRNA(mRNA前体或成熟mRNA)，也可以为由mRNA通过逆转录反应而合成的DNA(cDNA)。本发明的核酸可以为经过分离的核酸。
本发明的核酸例如为具有在编码鲎B因子的多肽的cDNA的碱基序列中、碱基编号577的碱基被置换为胸腺嘧啶(T)、碱基编号578的碱基被置换为鸟嘌呤(G)、碱基编号579的碱基被置换为胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)、且编码具有鲎B因子的功能的多肽的DNA。作为本发明的核酸，具体而言，可例示下述(a)～(d)的任一个所示的DNA。
(a)具有下述(a1)～(a4)的任一个所示的碱基序列的DNA。
(a1)序列号5中的碱基编号1～1200所示的碱基序列。
(a2)序列号5中的碱基编号70～1200所示的碱基序列。
(a3)序列号6中的碱基编号1～1200所示的碱基序列。
(a4)序列号6中的碱基编号70～1200所示的碱基序列。
(b)具有下述(b1)～(b4)的任一个所示的碱基序列的DNA。
(b1)序列号8中的碱基编号1～1200所示的碱基序列。
(b2)序列号8中的碱基编号70～1200所示的碱基序列。
(b3)序列号9中的碱基编号1～1200所示的碱基序列。
(b4)序列号9中的碱基编号70～1200所示的碱基序列。
(c)与由和上述(a)或(b)所示的DNA互补的碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交(其中，碱基编号577～579所示的碱基保守)、且编码具有鲎B因子的功能的多肽的DNA。
(d)具有在上述(a)～(c)的任一个所示的DNA中添加编码肽标签的DNA而成的融合DNA的碱基序列、且编码具有鲎B因子的功能的多肽的DNA。
本发明中“具有碱基序列的核酸”包含“由该碱基序列构成的核酸”作为一方式。因此，本发明中“具有碱基序列的DNA”包含“由该碱基序列构成的DNA”作为一方式。
上述(a)中所说的序列号5所示的碱基序列为在编码中华鲎B因子的多肽的DNA(序列号1)的碱基序列中、碱基编号577的碱基被置换为胸腺嘧啶(T)、碱基编号578的碱基被置换为鸟嘌呤(G)、碱基编号579的碱基被置换为胸腺嘧啶(T)的碱基序列。
上述(a)中所说的序列号6所示的碱基序列为在编码中华鲎B因子的多肽的DNA(序列号1)的碱基序列中、碱基编号577的碱基被置换为胸腺嘧啶(T)、碱基编号578的碱基被置换为鸟嘌呤(G)的碱基序列。
上述(b)中所说的序列号8所示的碱基序列为在编码美洲鲎B因子的多肽的DNA(序列号3)的碱基序列中、碱基编号577的碱基被置换为胸腺嘧啶(T)、碱基编号578的碱基被置换为鸟嘌呤(G)的碱基序列。
上述(b)中所说的序列号9所示的碱基序列为在编码美洲鲎B因子的多肽的DNA(序列号3)的碱基序列中、碱基编号577的碱基被置换为胸腺嘧啶(T)、碱基编号578的碱基被置换为鸟嘌呤(G)、碱基编号579的碱基被置换为胞嘧啶(C)的碱基序列。
上述(c)中所说的“严格的条件”意指：形成特异性的杂交体、不形成非特异性的杂交体的条件。因此，在此所说的“严格的条件”例如意指如下条件：相对于由与上述(a)或(b)所示的DNA互补的碱基序列构成的DNA，形成特异性的杂交体。作为严格的条件，可例示如下条件：类似性高的DNA彼此具有例如80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、进一步优选98％以上、特别优选99％以上的类似性的DNA彼此进行杂交，与其相比类似性低的DNA彼此不进行杂交。作为这样的条件，可例示例如如下条件：在相当于作为通常的印迹杂交的清洗的条件的60℃、1×SSC、0.1％SDS、优选60℃、0.1×SSC、0.1％SDS、更优选68℃、0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度及温度下清洗1次、优选2～3次。另外，作为这样的条件，也可例示如下条件：在由50％甲酰胺、4×SSC、50mM HEPES-NaOH(pH7.0)、10×Denhardt’ssolution、及100μg/mL鲑鱼精子DNA构成的溶液中在42℃下进行杂交、在由2×SSC及0.1％SDS构成的溶液中在室温下进行清洗、在由0.1×SSC及0.1％SDS构成的溶液中在50℃下进一步清洗(Sambrook J,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989))。
上述(c)所示的DNA例如可以通过对上述(a)或(b)所示的DNA在该碱基序列中的碱基编号577～579以外的区域进行核酸残基的置换、缺失、插入、和/或添加(以下，总称为“变异的导入”)而制备。在此所说的“变异的导入”例如可以通过公知的方法来进行。
作为进行“变异的导入”的方法，可例示使用限制酶及T4DNA连接酶的方法。即，将导入有变异的DNA片段的两末端利用限制酶进行限制性消化，与亚克隆有用相同限制酶进行了限制性消化的上述(a)或(b)所示的DNA的载体混合之后，利用T4DNA连接酶使两者连接，由此可以得到导入有变异的DNA。在此所说的“导入有变异的DNA片段”例如可以通过将导入有这样的变异的寡核苷酸用作引物的PCR反应而得到。
另外，作为进行“变异的导入”的方法，也可例示定点诱变法。作为定点诱变法，可例示：使用PCR反应的方法(Higuchi,R.(1989)in PCR technology(Erlich,H.A.,ed.)Stockton Press,New York,pp.61-70、Carter,P.(1987)Methods Enzymol.154,382-403)、或使用噬菌体的方法(Kramer,W.,Fritz,H.J.(1987)Methods Enzymol.154,350-67、Kunkel,T.A.,Roberts,J.D.,Zakour,R.A.(1987)Methods Enzymol.154,367-82)。定点诱变法具体而言例如可以利用KOD-Plus-Mutagenesis Kit(东洋纺社制)而进行。
上述(c)所示的DNA优选为如下DNA：只要在碱基编号577～579所示的部位上不进行变异的导入(碱基编号577～579所示的碱基保守)，则可以在上述(a)或(b)所示的DNA的碱基序列中在任意的部位上进行变异的导入，并且编码在中华鲎B因子的多肽的氨基酸序列(序列号2)及美洲鲎B因子的多肽的氨基酸序列(序列号4)之间保守(存在于相同位置)的其它Cys残基也保守(既不被置换也不缺失的)的多肽。上述(c)所示的DNA具体而言优选碱基编号334～336、碱基编号529～531、碱基编号577～579、碱基编号778～780、碱基编号919～921、碱基编号985～987、碱基编号1018～1020、碱基编号1102～1104所示的碱基序列(密码子)保守(为TGT或TGC)。
上述(d)中所说的“肽标签”的方式与上述“＜1＞本发明的多肽”中的方式相同。因此，在DNA所编码的多肽具有鲎B因子的功能的限度内，将编码肽标签的DNA添加于上述(a)、(b)或(c)所示的DNA的融合DNA也作为本发明的核酸来例示。
这样的“添加有编码肽标签的DNA的融合DNA”例如可以通过使用限制酶及T4DNA连接酶的方法来制备。即，将编码肽标签的DNA片段的两末端利用限制酶进行限制性消化，与亚克隆有用相同限制酶进行了限制性消化的上述(a)～(c)的任一个所示的DNA的载体混合之后，利用T4DNA连接酶使两者连接，由此可以得到该DNA。
另外，这样的“添加有编码肽标签的DNA的融合DNA”例如也可以通过将具有编码该肽标签的DNA的碱基序列的寡核苷酸用作引物、将上述(a)～(c)的任一个所示的DNA用作模板的PCR反应而得到。
本发明的核酸所编码的多肽例如可以通过后述的本发明的制造方法来制备。作为本发明的制造方法，具体而言，可例示后述的＜实施例1＞或＜实施例4＞中记载的使用哺乳类细胞的方法。
本发明的核酸所编码的多肽为具有鲎B因子的功能的多肽。在此所说的“鲎B因子的功能”的定义如上述“＜1＞本发明的多肽”中的记载的那样。因此，通过按照上述“＜1＞本发明的多肽”中所记载的方法判定核酸所编码的多肽是否具有鲎B因子的功能，可以选择上述(c)或(d)所示的DNA。
本发明的核酸可以基于本说明书的记载、通过公知的方法来制备。本发明的核酸可以通过遗传工程的方法而制备。本发明的核酸具体而言例如可以通过后述的＜实施例1＞或＜实施例4＞中记载的PCR反应来制备。另外，本发明的核酸例如也可以通过将其碱基序列用化学手段全合成来制备。
＜3＞本发明的载体
本发明的载体为保有本发明的核酸的载体。本发明的载体所保有的本发明的核酸的种类、数量没有特别限定。本发明的载体所保有的本发明的核酸既可以为1种，也可以为2种或其以上。另外，本发明的载体所保有的各种本发明的核酸可以分别独立地为1个(1拷贝)，也可以为2个(2拷贝)或其以上。
在此所说的“载体”意指用于本发明的核酸的扩增和/或本发明的核酸所编码的多肽的表达的核酸分子。本发明中，载体只要是在导入其的细胞中可进行本发明的核酸或该载体的扩增或本发明的核酸所编码的多肽的表达的载体，就没有特别限定。作为这样的载体，可例示噬菌体、质粒、病毒等。
载体可以根据导入其的细胞的种类或本发明的核酸所编码的多肽的所期望的表达量等各种条件适当选择。例如，利用细菌细胞等原核细胞作为细胞的情况下，作为载体，可以优选利用噬菌体或质粒。另外，例如利用昆虫细胞或哺乳类细胞等真核细胞作为细胞的情况下，作为载体，可以优选利用质粒或病毒。
作为哺乳类细胞中可以利用的质粒，可例示例如pCA7(Takeda,M.,Ohno,S.,Seki,F.,Nakatsu,Y.,Tahara,M.,Yanagi,Y.(2005)J.Virol.79,14346-54.)、pCI-neo(Promega社制)。作为昆虫细胞中可以利用的质粒，可例示pIZ-V5(Life Technologies社制)。作为细菌细胞中可以利用的质粒，可例示pBlue Script II SK(+)(安捷伦科技社制)、pET(TakaraBio社制)。
作为哺乳类细胞中可以利用的病毒，可例示动物病毒。作为动物病毒，可例示仙台病毒。作为昆虫细胞中可以利用的病毒，可例示杆状病毒(Baculovirus)。作为杆状病毒，可例示核多角体病毒(Nuclear Polyhedrosis Virus；NPV)。
作为细菌细胞中可以利用的噬菌体，可例示细菌噬菌体(Bacteriophage)。作为细菌噬菌体，可例示lambda噬菌体(λ噬菌体)或T4噬菌体。
本发明的载体例如通过向载体导入本发明的核酸而得到。向载体的本发明的核酸的导入可以按照常规方法而进行。
作为向载体导入本发明的核酸的方法，可例示利用载体具有的多克隆位点的方法。例如，从存在于载体所具有的多克隆位点的限制酶位点中选择任意的两个，将载体和本发明的核酸用这些限制酶进行限制性消化之后进行连接，由此可以得到本发明的载体。作为该用途中的本发明的核酸，例如可以使用通过将在5’末端侧添加有限制酶位点的寡核苷酸用作引物、将本发明的核酸用作模板的PCR反应而得到的DNA。另外，例如通过以插入有编码鲎B因子的多肽的DNA的载体为模板的反向PCR反应在该多肽的氨基酸序列中以第193位的氨基酸残基成为半胱氨酸(Cys)残基的方式进行变异的导入，由此也可以得到本发明的载体。作为制造本发明的载体的方法，具体而言可例示后述的＜实施例1＞或＜实施例4＞中所记载的方法。
＜4＞本发明的细胞
本发明的细胞为保有本发明的核酸和/或本发明的载体(以下，总称为“本发明的载体等”)的细胞。由于本发明的载体为具有本发明的核酸的载体，因此，保有本发明的载体的细胞也相当于保有本发明的核酸的细胞。
本发明的细胞例如可以通过将本发明的载体等导入于细胞而得到。因此，本发明的细胞例如可以通过使用本发明的载体等对细胞进行转化(基因导入)而得到。本发明中，细胞只要可以进行本发明的载体等的导入或使用其的转化，就没有特别限定。本发明中细胞优选为经过分离的细胞。
本发明的细胞所保有的本发明的载体等的种类或数量没有特别限定。本发明的细胞所保有的本发明的载体等既可以为1种，也可以为2种或其以上。另外，本发明的细胞所保有的各种本发明的载体等可以分别独立地为1个(1拷贝)，也可以为2个(2拷贝)或其以上。
本发明的细胞可以在染色体上保有本发明的载体等，也可以在染色体外保有本发明的载体等，还可以在染色体上和染色体外这两者中保有本发明的载体等。具体而言，本发明的细胞可以为导入了本发明的载体等或使用其转化后的细胞。
本发明的细胞中，“细胞”例如为宿主细胞。在此所说的“宿主细胞”意指作为用于使本发明的载体等扩增的宿主、和/或作为使本发明的载体等所编码的本发明的多肽表达的宿主使用的细胞。
本发明中，细胞可以根据使用本发明的载体等目的而适当选择。
例如，以本发明的载体等的扩增为目的的情况下，细胞优选为原核细胞，具体而言，优选为细菌细胞，其中，优选为大肠杆菌(Escherichia coli)。作为大肠杆菌，可例示JM109株或DH5α株。
另外，例如以本发明的载体等所编码的多肽的表达为目的的情况下，作为细胞，例如可以利用通常为了表达该细胞本来不具有的多肽而使用的细胞。这样的细胞例如优选为真核细胞，具体而言，优选为哺乳类细胞、昆虫细胞、植物细胞或酵母细胞。真核细胞优选为哺乳类细胞或昆虫细胞，更优选为哺乳类细胞。
哺乳类细胞优选为灵长类的细胞或啮齿类的细胞。作为灵长类，可例示人、猴、黑猩猩。作为灵长类的细胞，可例示人的细胞。作为人的细胞，具体而言，可例示人胎肾细胞源细胞株(HEK细胞)。作为HEK细胞，可例示HEK293细胞。作为HEK293细胞，可例示HEK293S细胞。作为HEK293S细胞，可例示HEK293S GnTI-细胞。另外，作为啮齿类，可例示仓鼠、小鼠、大鼠、天竺鼠。作为啮齿类的细胞，可例示仓鼠的细胞。作为仓鼠的细胞，可例示中国仓鼠的细胞。作为中国仓鼠的细胞，可例示CHO细胞。作为CHO细胞，可例示CHO DG44细胞、CHO-K1细胞、CHO-S细胞。
向细胞导入核酸可以按照常规方法而进行。本发明中，向细胞导入核酸的方法只要是可以向细胞导入本发明的载体等的方法，就没有特别限定。作为向细胞导入核酸的方法，具体而言，可例示磷酸钙法、脂质转染法、DEAE葡聚糖法、电穿孔法、显微注射法。细胞的转化例如可以通过后述的＜实施例1＞或＜实施例4＞中所记载的方法而进行。
＜5＞本发明的制造方法
本发明的制造方法为使用本发明的细胞制造本发明的多肽的方法。本发明的制造方法具体而言为包含使用本发明的细胞生成本发明的多肽的工序(以下，称为“生成工序”)的多肽的制造方法。生成工序例如为将本发明的细胞进行培养而使本发明的多肽表达的工序。
在本发明的制造方法中，将本发明的细胞进行培养的条件(以下，简称为“培养条件”)只要是可以使本发明的多肽在细胞中表达的条件，就没有特别限制。培养条件可以根据细胞的种类或本发明的载体等所编码的本发明的多肽的所期望的表达量等各种条件而适当选择。细胞的培养例如可以通过使用通常用于该细胞的培养的培养基而进行。作为培养条件，具体而言，可例示后述的＜实施例1＞或＜实施例4＞中记载的条件。
本发明的制造方法只要包含生成工序即可，也可以进一步含有其它工序。在此所说的“其它工序”例如为收集在生成工序中所生成的本发明的多肽的工序(以下，称为“收集工序”)。在此所说的“收集工序”例如为从细胞的培养液中得到含有本发明的多肽的组分的工序。
例如，本发明的多肽以被分泌到细胞外的方式表达的情况下，收集工序可以为收集培养液本身、离心分离后的上清液、或将这些液体供于柱等而纯化之后的组分作为本发明的多肽的工序。
另外，例如本发明的多肽以被蓄积于细胞内的方式进行表达的情况下，收集工序可以为收集细胞本身、将细胞进行破碎而得到的破碎物(细胞残渣)或提取液、或将这些供于柱等而纯化之后的组分作为本发明的多肽的工序。
上述中“破碎”可以通过根据细胞的种类而适当选择的方法来实施。作为破碎的方法，可例示进行匀浆的方法、进行超声波处理的方法、进行冻融的方法、添加表面活性剂的方法。用于破碎的这些方法可以适当组合而使用。
上述中“纯化”可以通过通常用于多肽的纯化的方法来进行。作为这样的方法，可例示：硫酸铵沉淀、凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法、羟基磷灰石色谱法、亲和色谱法。这些方法可以适当组合而使用。
关于在这样收集的组分中是否含有本发明的多肽这一点，例如可以按照上述“＜1＞本发明的多肽”中记载的方法、测定具有鲎B因子的功能的多肽的有无而进行判定。另外，关于在这样收集的组分中是否含有本发明的多肽这一点，例如也可以通过使用与本发明的多肽结合的抗体的方法来判定。
＜6＞本发明的测定方法
本发明的测定方法为使用本发明的多肽进行内毒素的测定的方法。在本发明中，测定作为含有检测、检出、及定量的总称使用。因此，本发明的测定方法例如也可以为内毒素的检测方法、内毒素的检出方法、或内毒素的定量方法。
本发明的测定方法例如为包含下述(1)及(2)的工序的内毒素的测定方法。
(1)将本发明的多肽、鲎C因子、及待测试样进行混合的工序。
(2)测定上述多肽的蛋白酶活性的工序。
上述(1)的工序为将本发明的多肽、鲎C因子及待测试样进行混合的工序。待测试样为含有内毒素的试样的情况下，进行与该内毒素接触的C因子变成活性型C因子、接着B因子变成活性型B因子的级联反应。
在上述(1)的工序中，只要含有将本发明的多肽、C因子及待测试样进行混合的操作即可，也可以进一步含有将其它物质进行混合的操作。作为在此所说的“其它物质”，可例示：凝固酶前体、缓冲剂、碱金属盐、碱土金属盐、表面活性剂、检测用底物。上述(1)的工序为将本发明的多肽、C因子、凝固酶前体及待测试样进行混合的工序，且待测试样为含有内毒素的试样的情况下，进行与该内毒素接触的C因子变成活性型C因子、B因子变成活性型B因子、凝固酶前体变成凝固酶的级联反应。
本发明中“C因子”只要是具有鲎C因子的功能的C因子，就没有特别限定。在此所说的“鲎”的定义如上述“＜1＞本发明的多肽”中的记载的那样。“鲎C因子的功能”意指鲎的C因子所具有的、作为蛋白酶前体的功能。“鲎C因子的功能”具体而言意指在内毒素的共存下变成活性型(活性型C因子)、表现出蛋白酶活性的功能。鲎C因子的功能例如为在内毒素的共存下变成活性型(活性型C因子)、将B因子切断而变成活性型(活性型B因子)的功能。
本发明中“凝固酶前体”只要是具有鲎凝固酶前体的功能的凝固酶前体，就没有特别限定。在此所说的“鲎”的定义如上述“＜1＞本发明的多肽”中的记载的那样。“鲎凝固酶前体的功能”意指鲎的凝固酶前体所具有的、作为蛋白酶前体的功能。“鲎凝固酶前体的功能”具体而言意指在活性型B因子的共存下变成活性型(凝固酶)、表现出蛋白酶活性的功能。鲎凝固酶前体的功能例如为在活性型B因子的共存下变成活性型(凝固酶)、将凝固蛋白原切断而形成凝固蛋白凝胶的功能。另外，鲎凝固酶前体的功能例如为在活性型B因子的共存下变成活性型(凝固酶)、将成为凝固酶的底物的检测用底物切断而使标记物游离的功能。
本发明中C因子及凝固酶前体分别独立地可以为由鲎得到的天然的鲎因子，也可以为通过遗传工程的方法制备的重组鲎因子，还可以为以任意的比例含有天然的鲎因子和重组鲎因子的混合物。
天然的鲎因子可以为将以鲎的血细胞为原料按照常规方法取得的细胞裂解物适当纯化而进行分离制备的物质。鲎因子的分离制备例如可以参照文献(Nakamura,T.,Horiuchi,T.,Morita,T.,Iwanaga,S.(1986)J.Biochem.99,847-57)中所记载的方法而进行。
重组鲎因子可以通过在导入有编码鲎因子的多肽的核酸的细胞中使该鲎因子生成而取得。编码鲎因子的核酸的碱基序列可以从NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)等公知的数据库中取得。
利用细胞的鲎因子的生成可以通过公知的方法来进行。利用细胞的鲎因子的生成具体而言可例示后述的＜实施例1＞或＜实施例4＞中记载的使用哺乳类细胞的方法。另外，利用细胞的鲎因子的生成例如也可以参照文献(国际公开第2012/118226号、或国际公开第2014/092079号)中所记载的方法而进行。进而，利用细胞的鲎因子的生成例如也可以援用上述“＜5＞本发明的制造方法”中所记载的方法而进行。
本发明中C因子及凝固酶前体的具体的方式可以援用上述“＜1＞本发明的多肽”的记载而表示。例如，本发明中鲎因子优选为重组体。另外，例如，本发明中用于鲎因子的生成的细胞优选为哺乳类细胞或昆虫细胞，优选为哺乳类细胞。
作为本发明中的C因子，具体而言，可例示下述(1)～(5)的任一个所示的多肽。
(1)具有序列号12所示的氨基酸序列的多肽。
(2)具有序列号14所示的氨基酸序列的多肽。
(3)具有序列号16所示的氨基酸序列的多肽。
(4)具有在上述(1)～(3)的任一个所示的氨基酸序列中置换、缺失、插入、和/或添加1个或多个氨基酸残基而成的氨基酸序列、且具有鲎C因子的功能的多肽。
(5)具有在上述(1)～(4)的任一个所示的多肽中添加有肽标签的融合多肽的氨基酸序列、且具有鲎C因子的功能的多肽。
作为本发明中的凝固酶前体，具体而言，可例示下述(6)～(9)的任一个所示的多肽。
(6)具有序列号18所示的氨基酸序列的多肽。
(7)具有序列号20所示的氨基酸序列的多肽。
(8)具有在上述(6)或(7)所示的氨基酸序列中置换、缺失、插入、和/或添加1个或多个氨基酸残基而成的氨基酸序列、且具有鲎凝固酶前体的功能的多肽。
(9)具有在上述(6)～(8)的任一个所示的多肽上添加有肽标签的融合多肽的氨基酸序列、且具有鲎凝固酶前体的功能的多肽。
上述(1)中所说的序列号12所示的氨基酸序列为中华鲎C因子的多肽的氨基酸序列。
上述(2)中所说的序列号14所示的氨基酸序列为美洲鲎C因子的多肽的氨基酸序列。
上述(3)中所说的序列号16所示的氨基酸序列为圆尾鲎C因子的多肽的氨基酸序列。
上述(6)中所说的序列号18所示的氨基酸序列为中华鲎凝固酶前体的多肽的氨基酸序列。
上述(7)中所说的序列号20所示的氨基酸序列为美洲鲎凝固酶前体的多肽的氨基酸序列。
上述(4)及(8)中所说的“多个”及“置换、缺失、插入、和/或添加”的方式与上述“＜1＞本发明的多肽”中的方式相同。
上述(4)所示的多肽例如可以为相对于上述(1)～(3)的任一个所示的氨基酸序列整体具有优选90％以上、更优选95％以上、进一步优选98％以上、特别优选99％以上的类似性、且具有鲎C因子的功能的多肽。另外，上述(8)所示的多肽例如可以为相对于上述(6)或(7)所示的氨基酸序列整体具有优选90％以上、更优选95％以上、进一步优选98％以上、特别优选99％以上的类似性、且具有鲎凝固酶前体的功能的多肽。需要说明的是，这些中所说的“类似性”(similarity)为包含“一致性”(identity)的概念，因此，可以将类似性换成一致性而用于该多肽的优选方式。
上述(4)及(8)中所说的“肽标签”的方式与上述“＜1＞本发明的多肽”中的方式相同。
本发明中“检测用底物”为用于测定活化的鲎因子的有无或其量、级联反应的进行的底物。检测用底物可以为用于测定活性型B因子的底物，也可以为用于测定凝固酶的底物。检测用底物只要是成为活化的鲎因子的底物的底物，就没有特别限定。检测用底物例如可以为蛋白质、肽、或它们的衍生物。
上述蛋白质可以为天然的蛋白质，也可以为重组的蛋白质。作为上述蛋白质，可例示作为凝固酶的底物的凝固蛋白原。例如，天然的凝固蛋白原可以从细胞裂解物中分离制备而制备。另外，例如重组的凝固蛋白原可以参照文献(宫田等、蛋白质核酸酶增刊No.29；P30-43；1986)中所记载的方法而制备。
上述肽例如可以为用化学手段合成的合成底物。合成底物只要是适于测定活化的鲎因子的有无或其量、级联反应的进行的底物，就没有特别限制。合成底物优选为肽的衍生物。
作为合成底物，可例示通式Y-X-Z(式中，Y可以存在，也可以不存在，Y存在的情况下，Y为保护基，X为肽，Z为标记物。)所示的底物。这样的合成底物只要具有在已活化的鲎因子作用下X-Z间的共价键会被切断、游离出标记物Z的性质即可。上述通式中，保护基(Y)优选为针对肽的N末端的氨基的保护基。上述通式中，Y-X间的键优选为在保护基的羧基和肽的N末端的α氨基之间所形成的酰胺键。另外，上述通式中，X-Z间的键优选为在肽的C末端的羧基和标记物Z的氨基之间所形成的酰胺键。
保护基(Y)没有特别限制，可以使用可用于肽的保护的公知的保护基。作为保护基(Y)，可例示：叔丁氧基羰基(Boc)、苄氧基羰基(Cbz)、苄基(Bzl)、苯甲酰基(Bz)、乙酰基(Ac)。
肽(X)只要是具有成为被活化的鲎因子的底物的氨基酸序列的肽，就没有特别限定。肽优选为适于丝氨酸蛋白酶的测定的底物，优选为在C末端具有Arg(R)残基的肽。
鲎因子为B因子的情况下，肽优选为具有通式X-Thr-Arg(式中，X为任意的氨基酸。)表示的氨基酸序列的肽。具体而言，鲎因子为B因子的情况下，肽优选为具有Leu-Thr-Arg(LTR)或Met-Thr-Arg(MTR)表示的氨基酸序列的肽。
鲎因子为凝固酶前体的情况下，肽优选为具有通式X-Gly-Arg(式中，X为任意的氨基酸。)所示的氨基酸序列的肽。具体而言，鲎因子为凝固酶前体的情况下，肽优选为具有Leu-Gly-Arg(LGR)或Glu-Gly-Arg(EGR)表示的氨基酸序列的肽。
标记物(Z)没有特别限制，可以使用可用于蛋白酶活性的测定的公知的标记物。作为标记物，例如可以使用从肽中游离时可检测到显色或荧光的标记物。作为这样的标记物，可例示：对硝基苯胺(pNA)、7-甲氧基香豆素-4-醋酸(MCA)、2,4-二硝基苯胺(DNP)。另外，作为标记物，例如可以使用从肽中游离时可以通过电化学测定法(伏安法、电流分析法等)检测的标记物。作为这样的标记物，可例示：对氨基苯酚(pAP)、对甲氧基苯胺(pMA)、N-甲基-对苯二胺(MPDD)、N,N’-二甲基-对苯二胺(DMPD)。
在上述本发明的测定方法中的(1)的工序中，本发明的多肽、鲎因子、待测试样、检测用底物及其它物质(缓冲剂等)可以以任意的顺序添加并混合。例如，在上述(1)的工序中，可以相对于本发明的多肽、鲎因子、检测用底物、其它物质的混合物添加待测试样并混合。另外，例如在上述(1)的工序中，可以向待测试样中添加本发明的多肽、鲎因子、检测用底物、其它物质的混合物并混合。在上述(1)的工序中，混合例如可以在一端具有开口的容器(试管、玻璃瓶等)的内部(容器内)进行。上述待测试样没有特别限定，除了注射用水、医药品、输液、血液制剂、医疗设备(医疗用具)、医药部外品、化妆品等之外，还可以列举食品、饮料水、空气、河川、土壤等环境试样；天然的蛋白质或基因重组蛋白质、核酸、酶、糖质、电解质；以及，血液、体液、组织等生物体成分等。
上述(2)的工序为测定本发明的多肽的蛋白酶活性的工序。该工序例如为测定从检测用底物中游离的标记物的工序。该工序中，与本发明的多肽的蛋白酶活性(总活力)对应的量(摩尔数)的标记物从检测用底物中游离，因此，可以通过测定从检测用底物中游离的标记物而测定本发明的多肽的蛋白酶活性。从检测用底物中游离的标记物例如可以利用分光光度计或荧光光度计等光学设备进行测定。另外，从检测用底物中游离的标记物例如可以利用伏安计或电流分析计等电化学测定设备进行测定。例如，通过将该工序所示出的测定值与空白值(以无内毒素的待测试样为测定对象的情况的测定值)进行比较，可以判定待测试样中的内毒素的有无。
本发明的测定方法除了包含上述(1)及(2)的工序以外，还可以进一步含有其它工序。本发明的测定方法例如可以包含：通过将在上述(2)的工序中得到的测定与空白值进行比较而判定待测试样中有无内毒素的工序。另外，本发明的测定方法例如可以包含通过判定混合液的凝胶化的有无而判定待测试样中的内毒素的有无的工序。进而，本发明的测定方法例如可以包含将在上述(2)的工序中得到的测定值变换为其它值的工序。作为将测定值变换为其它值的工序，可例示例如基于测定值算出内毒素的量的工序。这样的工序具体而言例如为：基于在将待测试样置换为浓度已知的标准物质而测定时得到的测定值和标准物质的浓度的关系(标准曲线)、将在测定待测试样时得到的测定值变换为内毒素的量的工序。
本发明的测定方法中，鲎反应优选在水或缓冲液等水性溶剂中进行。
＜7＞本发明的试剂
本发明的试剂为以含有本发明的多肽作为构成成分为特征的内毒素测定用试剂。本发明的试剂可以优选用于进行本发明的测定方法。
本发明的试剂只要含有本发明的多肽作为构成成分即可，可以进一步含有其它构成成分。作为在此所说的其它构成成分，可例示例如：鲎C因子、鲎凝固酶前体、检测用底物、缓冲剂、碱金属盐、碱土金属盐、表面活性剂。
本发明的试剂优选除本发明的多肽之外还含有鲎C因子作为构成成分，更优选还含有鲎凝固酶前体作为构成成分。另外，本发明的试剂优选以冷冻干燥品形式来提供。
＜8＞本发明的试剂盒
本发明的试剂盒为以含有本发明的多肽或本发明的试剂作为构成成分为特征的内毒素测定用试剂盒。本发明的试剂盒可以优选用于进行本发明的测定方法。
本发明的试剂盒只要含有本发明的多肽或本发明的试剂作为构成成分，则可以进一步含有其它构成成分。作为在此所说的其它构成成分，可例示例如：鲎C因子、鲎凝固酶前体、检测用底物、缓冲液、蒸馏水、内毒素标准品、微孔板、记载有制品信息的添加说明书。
本发明的试剂盒可以分别单独地含有各构成成分，也可以将各构成成分作为任意地组合而成的混合物含有。本发明的试剂盒例如可以分别地含有各鲎因子，可以以预先混合的方式含有，进而检测用底物也可以以预先混合的方式含有。
实施例
以下，通过实施例具体地说明本发明的一方式，但本发明的技术的范围并不仅限定于这些实施例。
在本发明的实施例中，有时使用以下的简写符号。
(a)TFC：中华鲎C因子
(b)TFB：中华鲎B因子
(c)Murasame-TFB：中华鲎B因子改变体
(d)LFC：美洲鲎C因子
(e)LFB：美洲鲎B因子
(f)Murasame-LFB：美洲鲎B因子改变体
在本发明的实施例中，表达载体的制备、鲎因子的制备、及鲎因子的活性测定可以参照文献(Kobayashi,Y.,Takahashi,T.,Shibata,T.,Ikeda,S.,Koshiba,T.,Mizumura,H.,Oda,T.,Kawabata,S.(2015)J.Biol.Chem.290,19379-86)中所记载的方法而进行。
在本发明的实施例中，PCR反应除特殊说明的情况之外均使用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(New England Biolabs社制)并按照附带的说明书进行操作而实施。
在本发明的实施例中，源自PCR反应液的DNA的纯化使用Wizard SV Gel and PCRClean-Up System(Promega社制)并按照附带的说明书进行操作而实施。
在本发明的实施例中，就DNA的分离制备而言，将含有DNA的试样供于琼脂糖凝胶电泳，将目标DNA片段用刀切取而回收后，使用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega社制)，按照附带的说明书进行操作而实施。
在本发明的实施例中，连接反应除特殊说明的情况之外均使用T4DNA ligase(NewEngland Biolabs社制)并按照附带的说明书进行操作而实施。
在本发明的实施例中，载体的扩增和纯化如下实施：将使用载体进行转化的大肠杆菌进行培养后，使用Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System(Promega社制)，按照附带的说明书进行操作而实施。具体而言，将使用载体进行转化的大肠杆菌DH5α株涂布于含氨苄青霉素的LB(LB/Amp)琼脂培养基的板上而静置培养整夜，将得到的单菌落接种于含氨苄青霉素的LB培养基，在37℃下振荡培养整夜而进行载体的扩增，由上述培养液中的大肠杆菌的菌体来纯化载体。
在本发明的实施例中，DNA的脱磷酸化使用碱性磷酸酶(E.coli C75)(Takara Bio社制)并按照附带的说明书进行操作而实施。
在本发明的实施例中，蛋白质浓度的测定使用Micro BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific社制)并按照附带的说明书进行操作而实施。另外，在本发明的实施例中，鲎因子的摩尔浓度用通过上述测定得到的蛋白质浓度除以鲎因子的分子量而算出。
＜参考例1＞TFC的制备
(1)TFC表达载体的制作
中华鲎C因子(TFC)的表达载体按照以下的步骤制作。
通过PCR反应制备编码除去N末端的信号序列的TFC的全长的DNA(具有序列号11中的碱基编号76～3057所示的碱基序列的DNA)。PCR反应的模板使用在pSecTag2A载体(Invitrogen社制)上插入有编码TFC的DNA的载体(Koshiba,T.,Hashii,T.,Kawabata,S.(2007)J.Biol.Chem.282,3962-7)。另外，PCR反应的引物使用引物1(序列号21)及BGHreverse引物(序列号28)。
将通过上述PCR反应得到的DNA进行纯化，对上述DNA进行利用限制酶(Age I及KpnI)的限制性消化和分离制备。对pHLsec载体(Aricescu,AR.,Lu,W.,Jones,EY.(2006)ActaCrystallogr.D Biol.Crystallogr.62,1243-50)，与上述同样地进行利用限制酶的限制性消化和分离制备之后，进行与上述DNA的连接反应。
使用上述连接反应液对大肠杆菌进行转化之后，进行载体的扩增和纯化。对上述载体进行利用限制酶(EcoR I)的限制性消化和分离制备，得到DNA片段1(具有编码源自pHLsec载体的分泌信号的氨基酸序列的碱基序列及序列号11中的碱基编号76～2298所示的碱基序列、在5’末端及3’末端具有EcoR I的粘末端的DNA)。另外，对上述载体进行利用限制酶(EcoR I及Xho I)的限制性消化和分离制备，得到DNA片段2(具有序列号11中的碱基编号2299～2545所示的碱基序列、在5’末端具有EcoR I的粘末端、在3’末端具有Xho I的粘末端的DNA)及DNA片段3(具有序列号11中的碱基编号2546～3057所示的碱基序列及编码源自pHLsec载体的His标签的氨基酸序列的碱基序列、在5’末端及3’末端具有Xho I的粘末端的DNA)。
对pCA7载体(Takeda,M.,Ohno,S.,Seki,F.,Nakatsu,Y.,Tahara,M.,Yanagi,Y.(2005)J.Virol.79,14346-54.)进行利用限制酶(EcoR I及Xho I)的限制性消化和分离制备之后，进行与上述DNA片段2的连接反应。
使用上述连接反应液对大肠杆菌进行转化之后，进行载体的扩增和纯化。对上述载体进行利用限制酶(Xho I)的限制性消化、脱磷酸化、分离制备之后，进行与上述DNA片段3的连接反应。
使用上述连接反应液对大肠杆菌进行转化之后，进行载体的扩增和纯化。对上述载体进行利用限制酶(EcoR I)的限制性消化、脱磷酸化、分离制备之后，进行与上述DNA片段1的连接反应。
使用上述连接反应液对大肠杆菌进行转化之后，进行载体的扩增和纯化。这样，得到编码在C末端具有His标签的TFC的载体。
以上述载体为模板，进行使用有引物8(序列号29)及引物2(序列号22)的PCR反应，对所扩增的DNA进行纯化。对上述DNA进行利用限制酶(EcoR I)的限制性消化和分离制备，得到DNA片段1。另外，对上述DNA进行利用限制酶(EcoR I及Xho I)的限制性消化和分离制备，得到DNA片段2及DNA片段4(具有序列号11中的碱基编号2546～3057所示的碱基序列、在5’末端及3’末端具有Xho I的粘末端的DNA)。
对pCA7载体进行利用限制酶(EcoR I及Xho I)的限制性消化和分离制备之后，进行与上述DNA片段2的连接反应。
使用上述连接反应液对大肠杆菌进行转化之后，进行载体的扩增和纯化。对上述载体进行利用限制酶(Xho I)的限制性消化、脱磷酸化、分离制备之后，进行与上述DNA片段4的连接反应。
使用上述连接反应液对大肠杆菌进行转化之后，进行载体的扩增和纯化。对上述载体进行利用限制酶(EcoR I)的限制性消化、脱磷酸化、分离制备之后，进行与上述DNA片段1的连接反应。
使用上述连接反应液对大肠杆菌进行转化之后，进行载体的扩增和纯化。这样，得到编码在C末端不具有His标签的TFC的载体。
对上述载体进行利用限制酶(EcoR I)的限制性消化、脱磷酸化、分离制备，得到DNA片段5(具有序列号11中的碱基编号2299～3057所示的碱基序列及pCA7载体的碱基序列、在5’末端及3’末端具有EcoR I的粘末端的DNA)。
以在pPSC8载体(Protein Sciences社制)上插入有编码包含N末端的信号序列的TFC的全长的DNA(具有序列号11中的碱基编号1～3057所示的碱基序列的DNA)的载体为模板，进行使用有引物3(序列号23)及引物2(序列号22)的PCR反应，对所扩增的DNA进行纯化。对上述DNA进行利用限制酶(EcoR I)的限制性消化和分离制备，得到DNA片段6(具有序列号11中的碱基编号1～2298所示的碱基序列、在5’末端及3’末端具有EcoR I的粘末端的DNA)。接着，进行与上述DNA片段5的连接反应。
使用上述连接反应液将大肠杆菌转化之后，进行载体的扩增和纯化。这样，得到编码含有N末端的信号序列的TFC全长的载体。
以上述载体为模板，进行使用有被磷酸化的引物(引物4(序列号24)及引物5(序列号25))的反向PCR反应。反向PCR反应使用Q5High-Fidelity DNA Polymerase(New EnglandBiolabs社制)、按照附带的说明书进行操作而实施。在上述PCR反应液中添加限制酶(DpnI)将模板分解，进行苯酚/氯仿提取及乙醇沉淀并进行DNA的分离制备之后，使用DNALigation Kit＜Mighty Mix＞(Takara Bio社制)，按照附带的说明书进行操作，进行连接反应(自连接)。
使用上述连接反应液将大肠杆菌转化之后，进行载体的扩增和纯化。这样，得到编码在信号序列后紧接着插入有6×His标签和Factor Xa切断序列(IEGR)的氨基酸序列的TFC的载体。
以上述载体为模板，进行使用有引物6(序列号26)及引物7(序列号27)的PCR反应，对所扩增的DNA进行纯化。PCR反应使用Q5High-Fidelity DNA Polymerase、按照附带的说明书进行操作而实施。对上述DNA进行利用限制酶(Age I及Nhe I)的限制性消化和分离制备，得到DNA片段7(具有编码6×His标签的碱基序列、编码IEGR的碱基序列、及序列号11中的碱基编号76～2236所示的碱基序列、在5’末端具有Age I的粘末端、在3’末端具有Nhe I的粘末端的DNA)。
对上述编码在C末端不具有His标签的TFC的载体进行利用限制酶(Age I及Nhe I)的限制性消化、脱磷酸化、分离制备，得到DNA片段8(具有序列号11中的碱基编号2237～3057所示的碱基序列及pCA7载体的碱基序列、在5’末端具有Nhe I的粘末端、在3’末端具有Age I的粘末端的DNA)。接着，进行与上述DNA片段7的连接反应。
使用上述连接反应液将大肠杆菌转化之后，进行载体的扩增和纯化。对上述载体的碱基序列进行序列分析，确认没有PCR错误导致的变异的导入。这样，得到在除去N末端的信号序列的TFC序列的N末端侧具有6×His标签和Factor Xa切断序列(IEGR)的多肽的表达载体(以下，称为“TFC/pCA7”)。
(2)TFC的制备
中华鲎C因子(TFC)按照以下的步骤、利用哺乳类细胞表达系统而制备。细胞培养在37℃、5％CO2的条件下实施。
使用上述(1)中得到的TFC的表达载体(TFC/pCA7)，对HEK293S GnTI-细胞(ATCC：CRL-3022)进行转化。具体而言，对达到80％～90％汇合的上述细胞，以成为0.22mL/cm2的方式添加转化培养基(含有TFC/pCA7(1.8μg/mL)、聚乙烯亚胺(2.7μg/mL)、1％青霉素-链霉素-L-谷氨酰胺溶液(和光纯药工业社制)、及2％胎牛血清的DMEM培养基)，以终浓度成为2mM的方式添加苯甲脒并静置培养120小时。这样，得到含有由细胞分泌的TFC的培养液。
将上述培养液以6,000×g离心30分钟，回收上清液。将上述上清液和0.1倍量的缓冲溶液(0.5M NaH2PO4-NaOH(pH8.0)、1.5M NaCl、0.1M咪唑)混合之后，上样到镍柱(nickel-nitrilotriacetic acid-agarose column、内径：1.0cm×长度：5.0cm)。将柱用清洗溶液(50mM NaH2PO4-NaOH(pH8.0)、150mM NaCl、10mM咪唑)清洗之后，使用洗脱溶液(50mMNaH2PO4-NaOH(pH8.0)、150mM NaCl、20～200mM咪唑)使TFC洗脱。TFC的洗脱组分利用凝胶电泳(SDS-PAGE)进行确认。
回收TFC的洗脱组分，通过超滤将溶液置换为反应溶液(20mM Tris-HCl(pH8.0)、150mM NaCl、10mM CaCl2)。接着，以成为3.3μg/mL的方式添加因子Xa，在37℃下静置16小时而使His标签从TFC的N末端游离。
将上述反应溶液上样到琼脂糖凝胶柱(benzamidine-Sepharose column、内径：0.25cm×长度：1.5cm)，使因子Xa吸附于柱而除去。接着，将上述柱的过而不停组分(穿透)上样到镍柱(nickel-nitrilotriacetic acid-agarose column、内径：0.25cm×长度：1.5cm)，使从TFC游离的His标签吸附于柱而除去。将上述柱的过而不停组分作为TFC用于以后的试验。
＜参考例2＞TFB的制备
(1)TFB表达载体的制作
中华鲎B因子(TFB)的表达载体按照以下的步骤制作。
通过PCR反应制备编码除去N末端的信号序列的TFB的全长的DNA(具有序列号1中的碱基编号70～1200所示的碱基序列的DNA)。PCR反应的模板使用在pPSC8载体上插入有编码TFB的DNA的载体。另外，PCR反应的引物使用引物9(序列号30)及引物10(序列号31)。
将通过上述PCR反应得到的DNA进行纯化，对上述DNA进行利用限制酶(Age I及XhoI)的限制性消化和分离制备。对pCA7载体进行利用限制酶(Age I及Xho I)的限制性消化和分离制备之后，进行与上述DNA的连接反应。使用上述连接反应液将大肠杆菌转化之后，进行载体的扩增和纯化。将上述载体的碱基序列进行序列分析，确认没有PCR错误导致的变异的导入。这样，得到除去N末端的信号序列的TFB的表达载体(TFB/pCA7)。
(2)TFB的制备
中华鲎B因子(TFB)按照以下的步骤、利用哺乳类细胞表达系统而制备。细胞培养在37℃、5％CO2的条件下实施。
使用上述(1)中得到的TFB的表达载体(TFB/pCA7)取代TFC的表达载体(TFC/pCA7)，不添加苯甲脒，除此之外，进行与上述＜参考例1＞中的“(2)TFC的制备”相同的操作，得到含有由细胞分泌的TFB的培养液。
将上述培养液以6,000×g离心30分钟，回收上清液。在上述上清液中添加50mMNaH2PO4-NaOH(pH6.8)并稀释5倍之后，上样到SP柱(SP-Sepharose column、内径：1.0cm×长度：10cm)。将柱用50mM NaH2PO4-NaOH(pH6.8)清洗之后，使用洗脱溶液(50mM NaH2PO4-NaOH(pH6.8)、50～500mM NaCl)使TFB洗脱。TFB的洗脱组分利用凝胶电泳(SDS-PAGE)进行确认。
回收TFB的洗脱组分，通过超滤将溶液置换为20mM Tris-HCl(pH8.0)。将上述溶液上样到DEAE柱(DEAE-Sepharose column、内径：1.0cm×长度：1.0cm)之后，使用洗脱溶液(20mM Tris-HCl(pH8.0)、10～200mM NaCl)使TFB洗脱。TFB的洗脱组分利用凝胶电泳(SDS-PAGE)进行确认。将上述TFB的洗脱组分作为TFB用于以后的试验。
＜实施例1＞Murasame-TFB的制备
中华鲎B因子改变体(Murasame-TFB)的表达载体按照以下的步骤而制作。
(1)Murasame-TFB表达载体的制作
以上述TFB/pCA7为模板，进行使用有被磷酸化的引物(引物11(序列号32)及引物12(序列号33))的反向PCR反应。反向PCR反应使用Tks Gflex DNA polymerase(Takara Bio社制)、按照附带的说明书进行操作而实施。在上述PCR反应液中添加限制酶(Dpn I)而将模板分解，进行苯酚/氯仿提取及乙醇沉淀并进行DNA的分离制备之后，使用DNA Ligation Kit＜Mighty Mix＞，按照附带的说明书进行操作，进行连接反应(自连接)。
使用上述连接反应液将大肠杆菌转化之后，进行载体的扩增和纯化。将上述载体的碱基序列进行序列分析，确认没有PCR错误导致的变异的导入。这样，得到Murasame-TFB的表达载体(Murasame-TFB/pCA7)。
(2)Murasame-TFB的制备
中华鲎B因子改变体(Murasame-TFB)按照以下的步骤、利用哺乳类细胞表达系统而制备。细胞培养在37℃、5％CO2的条件下实施。
使用上述(1)中得到的Murasame-TFB的表达载体(Murasame-TFB/pCA7)取代TFC的表达载体(TFC/pCA7)，不添加苯甲脒，除此之外，进行与上述＜参考例1＞中的“(2)TFC的制备”相同的操作，得到含有由细胞分泌的Murasame-TFB的培养液。
进行与上述＜参考例2＞中的“(2)TFB的制备”相同的操作，得到含有Murasame-TFB的洗脱组分。将上述Murasame-TFB的洗脱组分作为Murasame-TFB用于以后的试验。
＜参考例3＞TFB的蛋白酶活性(比活力)的测定
制备160nM TFC、3.2μM LPS(源自明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)R595、重均分子量1,700Da、List Biological Laboratories社制)、20mM Tris-HCl(pH8.0)、150mMNaCl的溶液，在37℃下静置20分钟而使TFC活化。以下，将活化的TFC称为“α-TFC”。
制备50nM TFB、0.2nMα-TFC、20mM Tris-HCl(pH8.0)、150mM NaCl、100μg/mL BSA的溶液20μL，在37℃下静置1小时。对该溶液，加入溶解于20％DMF的2mM Boc-Leu-Thr-Arg-MCA(肽研究所社制)5μL，在37℃下静置5分钟。添加0.6M醋酸(75μL)而使酶反应结束后，用荧光检测器测定从肽中游离的MCA的量(与活化的TFB的蛋白酶活性(总活力)成比例)。检测在激发波长380nm、荧光波长440nm的条件下进行。
上述的结果，TFB的蛋白酶活性(比活力)为31.07±2.50units/μmol。
＜实施例2＞Murasame-TFB的蛋白酶活性(比活力)的测定
使用Murasame-TFB取代TFB，进行与上述＜参考例3＞相同的操作，测定Murasame-TFB的蛋白酶活性。
上述试验的结果，Murasame-TFB的蛋白酶活性(比活力)为416.87±20.50units/μmol。
将＜参考例3＞及＜实施例2＞的结果示于图1。由上述试验的结果显示：Murasame-TFB与TFB相比，具有13.4倍的蛋白酶活性(比活力)。
＜参考例4＞TFB的热稳定性的评价
制备100nM TFB、20mM Tris-HCl(pH8.0)、150mM NaCl、100μg/mL BSA的溶液10μL，在给定的温度(40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、或90℃)下静置2分钟。其后，在该溶液中添加0.4nMα-TFC、20mM Tris-HCl(pH8.0)、150mM NaCl、100μg/mL BSA的溶液10μL，在37℃下静置1小时。以后，进行与上述＜参考例3＞相同的操作，测定TFB的蛋白酶活性。将上述试验的结果示于表1。
[表1]
表1
表1中“比活力”为以百分率表示在各温度下静置了2分钟的TFB的蛋白酶活性(比活力)除以上述＜参考例3＞所示的TFB的蛋白酶活性(比活力)所得的值的数值(％)。
＜实施例3＞Murasame-TFB的热稳定性的评价
使用Murasame-TFB取代TFB，进行与上述＜参考例4＞相同的操作，评价Murasame-TFB的热稳定性。将上述试验的结果示于表2。
[表2]
表2
表2中，比活力为以百分率表示在各温度下静置了2分钟的Murasame-TFB的蛋白酶活性(比活力)除以上述＜实施例2＞所示的Murasame-TFB的蛋白酶活性(比活力)所得的值的数值(％)。
将＜参考例4＞及＜实施例3＞的结果示于图2。由上述试验的结果显示：TFB通过在60℃以上加热2分钟，完全丧失蛋白酶活性(失活)。另一方面显示：Murasame-TFB即使在90℃下加热2分钟，也维持40％以上的蛋白酶活性，与TFB相比具有高的热稳定性。
＜参考例5＞LFC的制备
(1)LFC表达载体的制作
美洲鲎C因子(LFC)的表达载体按照以下的步骤制作。
通过使用有Tks Gflex DNA polymerase(Takara Bio社制)的PCR反应制备编码除去N末端的信号序列的LFC的全长的DNA(具有序列号13中的碱基编号76～3060所示的碱基序列的DNA)。PCR反应的模板使用在pBluescript II SK(+)(安捷伦科技社制)上插入有编码LFC的DNA的载体。另外，PCR反应的引物使用引物13(序列号34)及引物14(序列号35)。
进行苯酚/氯仿提取而回收通过上述PCR反应得到的DNA，对上述DNA进行利用限制酶(Age I及Xho I)的限制性消化和分离制备。对TFC/pCA7，与上述同样地进行利用限制酶的限制性消化和分离制备之后，进行与上述DNA的连接反应。
使用上述连接反应液将大肠杆菌转化之后，进行载体的扩增和纯化。将上述载体的碱基序列进行序列分析，确认没有PCR错误导致的变异的导入。这样，得到在除去N末端的信号序列的LFC序列的N末端侧具有6×His标签和Factor Xa切断序列(IEGR)的多肽的表达载体(以下，称为“LFC/pCA7”)。
(2)LFC的制备
美洲鲎C因子(LFC)按照以下的步骤、利用哺乳类细胞表达系统而制备。细胞培养在37℃、5％CO2的条件下实施。
使用上述(1)中得到的LFC的表达载体(LFC/pCA7)，对HEK293S GnTI-细胞(ATCC：CRL-3022)进行转化。具体而言，对达到80％～90％汇合的上述细胞，以成为0.22mL/cm2的方式添加转化培养基(含有LFC/pCA7(1.8μg/mL)、聚乙烯亚胺(2.7μg/mL)、1％青霉素-链霉素-L-谷氨酰胺溶液、及2％胎牛血清的DMEM培养基)，以终浓度成为2mM的方式添加苯甲脒并静置培养120小时。这样，得到含有由细胞分泌的LFC的培养液。
将上述培养液以6,000×g离心30分钟，回收上清液。将上述上清液和0.1倍量的缓冲溶液(0.5M NaH2PO4-NaOH(pH8.0)、1.5M NaCl、0.1M咪唑)混合之后，上样到镍柱(nickel-nitrilotriacetic acid-agarose column、内径：1.0cm×长度：2.0cm)。将柱用清洗溶液(50mM NaH2PO4-NaOH(pH8.0)、150mM NaCl、10mM咪唑)清洗之后，使用洗脱溶液(50mMNaH2PO4-NaOH(pH8.0)、150mM NaCl、20～200mM咪唑)使LFC洗脱。LFC的洗脱组分利用凝胶电泳(SDS-PAGE)进行确认。
回收LFC的洗脱组分，通过超滤而将溶液置换为反应溶液(20mM Tris-HCl(pH8.0)、150mM NaCl、10mM CaCl2)。接着，以成为3.3μg/mL的方式添加因子Xa，在室温下静置2天，使His标签从LFC的N末端游离。
将上述反应溶液上样到琼脂糖凝胶柱(benzamidine-Sepharose column、内径：0.25cm×长度：1.5cm)，使因子Xa吸附于柱而除去。接着，将上述柱的过而不停组分(穿透)上样到镍柱(nickel-nitrilotriacetic acid-agarose column、内径：0.25cm×长度：1.5cm)，使从LFC中游离的His标签吸附于柱而除去。将上述柱的过而不停组分作为LFC用于以后的试验。
＜参考例6＞LFB的制备
(1)LFB表达载体的制作
美洲鲎B因子(LFB)的表达载体按照以下的步骤而制作。
通过使用有Tks Gflex DNA polymerase的PCR反应制备编码LFB全长序列的DNA(具有序列号3中的碱基编号1～1200所示的碱基序列的DNA)。PCR反应的模板使用在pBluescript II SK(+)上插入有编码LFB的DNA的载体。另外，PCR反应的引物使用引物15(序列号36)及引物18(序列号39)。
将通过上述PCR反应得到的DNA进行纯化，对上述DNA进行利用限制酶(EcoR I及Xho I)的限制性消化和分离制备。对pCA7载体进行利用限制酶(EcoR I及Xho I)的限制性消化和分离制备之后，进行与上述DNA的连接反应。使用上述连接反应液将大肠杆菌转化之后，进行载体的扩增和纯化。将上述载体的碱基序列进行序列分析，确认没有PCR错误导致的变异的导入。这样，得到具有LFB全长序列的多肽的表达载体。
以上述载体为模板，进行使用有引物15(序列号36)及引物19(序列号40)的PCR反应，对所扩增的DNA进行纯化。对上述DNA进行利用限制酶(EcoR I及Xho I)的限制性消化和分离制备，得到DNA片段(具有序列号3中的碱基编号1～1200所示的碱基序列及编码6×His标签的碱基序列、在5’末端具有EcoR I的粘末端、在3’末端具有Xho I的粘末端的DNA)。
对pCA7载体进行利用限制酶(EcoR I及Xho I)的限制性消化和分离制备之后，进行与上述DNA的连接反应。使用上述连接反应液转化大肠杆菌之后，进行载体的扩增和纯化。将上述载体的碱基序列进行序列分析，确认没有PCR错误导致的变异的导入。这样，得到在LFB全长序列的C末端侧具有6×His标签的多肽的表达载体。
以上述载体为模板，进行使用有引物20(序列号41)及引物21(序列号42)的PCR反应，对所扩增的DNA进行纯化。对上述DNA进行利用限制酶(Age I及Xho I)的限制性消化和分离制备，得到DNA片段(具有序列号3中的碱基编号70～1200所示的碱基序列及编码6×His标签的碱基序列、在5’末端具有Age I的粘末端、在3’末端具有Xho I的粘末端的DNA)。
对pCA7载体进行利用限制酶(Age I及Xho I)的限制性消化和分离制备之后，进行与上述DNA的连接反应。使用上述连接反应液转化大肠杆菌之后，进行载体的扩增和纯化。将上述载体的碱基序列进行序列分析，确认没有PCR错误导致的变异的导入。这样，得到在除去N末端的信号序列的LFB序列的C末端侧具有6×His标签的多肽的表达载体(LFB/pCA7)。
(2)LFB的制备
美洲鲎B因子(LFB)按照以下的步骤、利用哺乳类细胞表达系统而制备。细胞培养在37℃、5％CO2的条件下实施。
使用上述(1)中得到的LFB的表达载体(LFB/pCA7)取代LFC的表达载体(LFC/pCA7)，不添加苯甲脒，除此之外，进行与上述＜参考例5＞中的“(2)LFC的制备”相同的操作，得到含有由细胞分泌的LFB的培养液。
将上述培养液上样到镍柱(nickel-nitrilotriacetic acid-agarose column、内径：1.0cm×长度：1.5cm)，得到LFB的洗脱组分。柱纯化按照上述＜参考例5＞中的“(2)LFC的制备”中记载的步骤而实施。
回收LFB的洗脱组分，通过超滤而将溶液置换为反应溶液(20mM Tris-HCl(pH8.0)、300mM NaCl)。将这样得到的LFB用于以后的试验。
＜实施例4＞Murasame-LFB的制备
美洲鲎B因子改变体(Murasame-LFB)的表达载体按照以下的步骤而制作。
通过使用有Tks Gflex DNA polymerase的PCR反应制备编码Murasame-LFB的N末端侧的DNA(具有序列号9中的碱基编号1～594所示的碱基序列的DNA。以下，称为“DNA片段9”)。PCR反应的模板使用在pCA7上插入有编码LFB的DNA的载体。另外，PCR反应的引物使用引物15(序列号36)及引物16(序列号37)。
与上述同样地，通过PCR反应制备编码Murasame-LFB的C末端侧的DNA(具有序列号9中的碱基编号562～1200所示的碱基序列的DNA。以下，称为“DNA片段10”)。PCR反应的引物使用引物17(序列号38)及引物18(序列号39)。
将通过上述PCR反应得到的DNA进行纯化，得到DNA片段9及DNA片段10。
通过使用有Tks Gflex DNA polymerase的PCR反应制备编码Murasame-LFB全长序列的DNA(具有序列号9中的碱基编号1～1200所示的碱基序列的DNA)。PCR反应的模板使用将DNA片段9和10混合成的物质。另外，PCR反应的引物使用引物15(序列号36)及引物18(序列号39)。以后，进行与上述＜参考例6＞中的“(1)LFB表达载体的制作”相同的操作。这样，得到在除去N末端的信号序列的Murasame-LFB序列的C末端侧具有6×His标签的多肽的表达载体(Murasame-LFB/pCA7)。
(2)Murasame-LFB的制备
美洲鲎B因子改变体(Murasame-LFB)按照以下的步骤、利用哺乳类细胞表达系统而制备。细胞培养在37℃、5％CO2的条件下实施。
使用上述(1)中得到的Murasame-LFB的表达载体(Murasame-LFB/pCA7)取代LFB的表达载体(LFB/pCA7)，进行与上述＜参考例6＞中的“(2)LFB的制备”相同的操作。将这样得到的Murasame-LFB用于以后的试验。
＜参考例7＞LFB的蛋白酶活性(比活力)的测定
制备160nM LFC、3.2μM LPS、20mM Tris-HCl(pH8.0)、150mM NaCl的溶液，在37℃下静置20分钟而使LFC活化。以下，将活化的LFC称为“α-LFC”。
制备50nM LFB、2nMα-LFC、20mM Tris-HCl(pH8.0)、150mM NaCl、100μg/mL BSA的溶液20μL，在37℃下静置1小时。对该溶液，加入溶解于20％DMF的2mM Boc-Leu-Thr-Arg-MCA 5μL，在37℃下静置5分钟。添加0.6M醋酸(75μL)而使酶反应结束后，用荧光检测器测定从肽中游离的MCA的量(与活化的LFB的蛋白酶活性(总活力)成比例)。检测在激发波长380nm、荧光波长440nm的条件下进行。
上述的结果，LFB的蛋白酶活性(比活力)为44.67±0.61units/μmol。
＜实施例5＞Murasame-LFB的蛋白酶活性(比活力)的测定
使用Murasame-LFB取代LFB，进行与上述＜参考例7＞相同的操作，测定Murasame-LFB的蛋白酶活性。
上述试验的结果，Murasame-LFB的蛋白酶活性(比活力)为320.80±9.56units/μmol。
由上述试验的结果显示：Murasame-LFB与Murasame-TFB同样地，与改变前的多肽(LFB)相比具有高的蛋白酶活性(比活力)。
＜参考例8＞LFB的热稳定性的评价
制备100nM LFB、20mM Tris-HCl(pH8.0)、150mM NaCl、100μg/mL BSA的溶液10μL，在给定的温度(40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、或90℃)下静置2分钟。其后，在该溶液中添加4nMα-LFC、20mM Tris-HCl(pH8.0)、150mM NaCl、100μg/mL BSA的溶液10μL，在37℃下静置1小时。以后，进行与上述＜参考例7＞相同的操作，测定LFB的蛋白酶活性。将上述试验的结果示于表3。
[表3]
表3
表3中，“比活力”为以百分率表示在各温度下静置了2分钟的LFB的蛋白酶活性(比活力)除以上述＜参考例7＞所示的LFB的蛋白酶活性(比活力)所得的值的数值(％)。
＜实施例6＞Murasame-LFB的热稳定性的评价
使用Murasame-LFB取代LFB，进行与上述＜参考例8＞相同的操作，评价Murasame-LFB的热稳定性。将上述试验的结果示于表4。
[表4]
表4
表4中比活力为以百分率表示在各温度下静置了2分钟的Murasame-LFB的蛋白酶活性(比活力)除以上述＜实施例5＞所示的Murasame-LFB的蛋白酶活性(比活力)所得的值的数值(％)。
由上述试验的结果显示：Murasame-LFB与Murasame-TFB同样地，与改变前的多肽(LFB)相比具有高的热稳定性。
工业上的可利用性
根据本发明，可以制造与天然的鲎B因子相比蛋白酶活性优异的多肽。因此，由本发明提供的多肽期待为与天然的鲎B因子相比可以将内毒素测定高灵敏度化的鲎B因子改变体。另外，根据本发明，可以制造与天然的鲎B因子相比热稳定性优异的多肽。因此，由本发明提供的多肽期待为与天然的鲎B因子相比作为试剂的保存稳定性优异的鲎B因子改变体。
＜序列表的说明＞
序列号1：中华鲎B因子的cDNA的碱基序列
序列号2：中华鲎B因子的氨基酸序列
序列号3：美洲鲎B因子的cDNA的碱基序列
序列号4：美洲鲎B因子的氨基酸序列
序列号5：中华鲎B因子改变体的cDNA的碱基序列(1)
序列号6：中华鲎B因子改变体的cDNA的碱基序列(2)
序列号7：中华鲎B因子改变体的氨基酸序列
序列号8：美洲鲎B因子改变体的cDNA的碱基序列(1)
序列号9：美洲鲎B因子改变体的cDNA的碱基序列(2)
序列号10：美洲鲎B因子改变体的氨基酸序列
序列号11：中华鲎C因子的cDNA的碱基序列
序列号12：中华鲎C因子的氨基酸序列
序列号13：美洲鲎C因子的cDNA的碱基序列
序列号14：美洲鲎C因子的氨基酸序列
序列号15：圆尾鲎C因子的cDNA的碱基序列
序列号16：圆尾鲎C因子的氨基酸序列
序列号17：中华鲎凝固酶前体的cDNA的碱基序列
序列号18：中华鲎凝固酶前体的氨基酸序列
序列号19：美洲鲎凝固酶前体的cDNA的碱基序列
序列号20：美洲鲎凝固酶前体的cDNA的氨基酸序列
序列号21～42：引物
序列表
<110> 生化学工业株式会社（Seikagaku Corporation）
<120> 鲎B因子改变体
<130> F201805-8009
<150> JP2017-038692
<151> 2017-03-01
<160> 42
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1203
<212> DNA
<213> 中华鲎（ Tachypleus tridentatus）
<220>
<223> 中华鲎B因子
<400> 1
atgacgtgga tatgtgtgat aacgttgttt gctctggctt ctgctacgtt gggtaacaaa 60
gttagtagag tgggggtcct cttccccaag acacggaacg acaatgagtg tacagcaaga 120
gggggattga aaggatcctg caaatccctc atagactgtc ctagtgtctt ggctacgttg 180
aaggacagtt ttcctgtcgt ttgctcttgg aatggtcgat ttcagcctat tgtctgctgt 240
cctgatgcaa tagcaccacc acctgtaacc acaacagctg taactgtaat atctacaaaa 300
gaaccaaagc ttccaagatt acatatatca ggttgtggaa aaagaaaagt caaaatagat 360
attacaactg ttggacgctc tggatcacca atacttcctc cgatatctac tcctcaaaat 420
tcaacaggtg ggagaggaat tattgctgga ggcgtagaag ccaaaattgg cgcgtggcct 480
tggatggcag ctgtttttgt gaaaaacttt ggcattggca gattccactg tgctggtagc 540
ataatcagta acaagtacat tttgtcagct gcccacgcct tccttatcgg aggtcgaaag 600
ttgaccccaa ctcgcttagc tgtccgtgtg ggaggccact acataaagag gggtcaagag 660
tatccagtga aagacgtgat tatccatcct cattatgtag aaaaggagaa ctacaatgat 720
atagccataa tcgagttaaa agaggaactg aactttacgg acttggtcaa tcctatatgt 780
ctccctgatc cagagacagt aacggatcca ttaaaagaca gaattgtgac tgcagcggga 840
tggggcgatc tggatttctc cggtccacgg agccaagttc tacgtgaggt aagcatccca 900
gttgttccag ttgataaatg tgatcaagcc tatgagaaac tcaacacccc ttcactaaaa 960
aatgggataa cgaataactt cctttgcgct ggattggaag aaggagggaa agacgcttgc 1020
caaggcgatt ctggtggacc gttgatgcta gtgaacaaca ctaggtggat agtagtagga 1080
gttgtgtcgt tcgggcacaa gtgtgccgag gaaggatatc ctggtgtgta ctcgcgcgta 1140
gcgagttacc tagactggat cgcgaaagtt acgaactcgt tagatcatgc cgtcactaac 1200
tga 1203
<210> 2
<211> 400
<212> PRT
<213> 中华鲎（ Tachypleus tridentatus）
<220>
<223> 中华鲎B因子
<400> 2
Met Thr Trp Ile Cys Val Ile Thr Leu Phe Ala Leu Ala Ser Ala Thr
1 5 10 15
Leu Gly Asn Lys Val Ser Arg Val Gly Val Leu Phe Pro Lys Thr Arg
20 25 30
Asn Asp Asn Glu Cys Thr Ala Arg Gly Gly Leu Lys Gly Ser Cys Lys
35 40 45
Ser Leu Ile Asp Cys Pro Ser Val Leu Ala Thr Leu Lys Asp Ser Phe
50 55 60
Pro Val Val Cys Ser Trp Asn Gly Arg Phe Gln Pro Ile Val Cys Cys
65 70 75 80
Pro Asp Ala Ile Ala Pro Pro Pro Val Thr Thr Thr Ala Val Thr Val
85 90 95
Ile Ser Thr Lys Glu Pro Lys Leu Pro Arg Leu His Ile Ser Gly Cys
100 105 110
Gly Lys Arg Lys Val Lys Ile Asp Ile Thr Thr Val Gly Arg Ser Gly
115 120 125
Ser Pro Ile Leu Pro Pro Ile Ser Thr Pro Gln Asn Ser Thr Gly Gly
130 135 140
Arg Gly Ile Ile Ala Gly Gly Val Glu Ala Lys Ile Gly Ala Trp Pro
145 150 155 160
Trp Met Ala Ala Val Phe Val Lys Asn Phe Gly Ile Gly Arg Phe His
165 170 175
Cys Ala Gly Ser Ile Ile Ser Asn Lys Tyr Ile Leu Ser Ala Ala His
180 185 190
Ala Phe Leu Ile Gly Gly Arg Lys Leu Thr Pro Thr Arg Leu Ala Val
195 200 205
Arg Val Gly Gly His Tyr Ile Lys Arg Gly Gln Glu Tyr Pro Val Lys
210 215 220
Asp Val Ile Ile His Pro His Tyr Val Glu Lys Glu Asn Tyr Asn Asp
225 230 235 240
Ile Ala Ile Ile Glu Leu Lys Glu Glu Leu Asn Phe Thr Asp Leu Val
245 250 255
Asn Pro Ile Cys Leu Pro Asp Pro Glu Thr Val Thr Asp Pro Leu Lys
260 265 270
Asp Arg Ile Val Thr Ala Ala Gly Trp Gly Asp Leu Asp Phe Ser Gly
275 280 285
Pro Arg Ser Gln Val Leu Arg Glu Val Ser Ile Pro Val Val Pro Val
290 295 300
Asp Lys Cys Asp Gln Ala Tyr Glu Lys Leu Asn Thr Pro Ser Leu Lys
305 310 315 320
Asn Gly Ile Thr Asn Asn Phe Leu Cys Ala Gly Leu Glu Glu Gly Gly
325 330 335
Lys Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met Leu Val Asn
340 345 350
Asn Thr Arg Trp Ile Val Val Gly Val Val Ser Phe Gly His Lys Cys
355 360 365
Ala Glu Glu Gly Tyr Pro Gly Val Tyr Ser Arg Val Ala Ser Tyr Leu
370 375 380
Asp Trp Ile Ala Lys Val Thr Asn Ser Leu Asp His Ala Val Thr Asn
385 390 395 400
<210> 3
<211> 1203
<212> DNA
<213> 美洲鲎（Limulus polyphemus）
<220>
<223> 美洲鲎B因子
<400> 3
atggcgtgga tttgtgtgat aacgttgttt gctttggctt ctagtacgtt gagtaataaa 60
gttagtagag tggggatcat ctttcctaag acacagaacg ataataaaca gtgtacagca 120
aaaggtggat taaaagggtc ctgcaagtcc ctcacagact gtcctgctgt cttggctacg 180
ttgaaggata gtttccctgt cgtttgctct tggaatggtc ggtttcagcc tattgtatgt 240
tgtcctgatg cagcagcacc aagtgtaacc acaacagtta caactattgt ccctacaaaa 300
gaaacaaaga ttccaagatt acatatacca ggttgtggaa aaagaaaagt aaatgtagat 360
attacaacta ttggacgttc ggggtcacca atacttcctc ccatatctac ttctcaagat 420
ttgaagggtg ggagaggaat cattgctgga ggtgtagaag ctaaaattgg cgcctggcct 480
tggatggcag ctgtttttgt gaaaaatttt ggcattggca gattccattg tgctggtagc 540
ataatcagta gcaagtacat tttgtctgct gcccacgctt tcctcattgg aggtcgaaag 600
ctgaccccaa ctcgcttagc tgtccgcgta ggaggccact acgtaaagat gggtcaagaa 660
tatcatgtgg aagatgtgat tatccatcct gactacgtag aaagggagaa ttacaatgat 720
attgctatca ttgtgttaaa agaggaactg aattttactg atttggtccg tccaatctgt 780
ctccctgacc cagaggcagt aacagattca ttaaaaggca gaagggtgac agtagctgga 840
tggggtgatc tggatttcgc cggtccacga agtcaagttc tgcgcgaggt tagtatcccc 900
gttgttccaa tcggtgactg taacaaagcc tatcagaagc tcaacaccct tgctcttaaa 960
aatgggataa cgaaaaagtt tatttgtgct ggattggaag aaggtgggaa agatgcttgt 1020
caaggcgatt ctggtggacc gttgatgcta gtgaacaata gtagttggat agtgacggga 1080
gtggtgtcgt tcggacacaa gtgtgccgaa gagggatttc ctggtgtgta cacgcgtgta 1140
gtgagttacc tagagtggat cgcgaaggtt acgaactcgt tagaccagac agtcactaac 1200
tga 1203
<210> 4
<211> 400
<212> PRT
<213> 美洲鲎（Limulus polyphemus）
<220>
<223> 美洲鲎B因子
<400> 4
Met Ala Trp Ile Cys Val Ile Thr Leu Phe Ala Leu Ala Ser Ser Thr
1 5 10 15
Leu Ser Asn Lys Val Ser Arg Val Gly Ile Ile Phe Pro Lys Thr Gln
20 25 30
Asn Asp Asn Lys Gln Cys Thr Ala Lys Gly Gly Leu Lys Gly Ser Cys
35 40 45
Lys Ser Leu Thr Asp Cys Pro Ala Val Leu Ala Thr Leu Lys Asp Ser
50 55 60
Phe Pro Val Val Cys Ser Trp Asn Gly Arg Phe Gln Pro Ile Val Cys
65 70 75 80
Cys Pro Asp Ala Ala Ala Pro Ser Val Thr Thr Thr Val Thr Thr Ile
85 90 95
Val Pro Thr Lys Glu Thr Lys Ile Pro Arg Leu His Ile Pro Gly Cys
100 105 110
Gly Lys Arg Lys Val Asn Val Asp Ile Thr Thr Ile Gly Arg Ser Gly
115 120 125
Ser Pro Ile Leu Pro Pro Ile Ser Thr Ser Gln Asp Leu Lys Gly Gly
130 135 140
Arg Gly Ile Ile Ala Gly Gly Val Glu Ala Lys Ile Gly Ala Trp Pro
145 150 155 160
Trp Met Ala Ala Val Phe Val Lys Asn Phe Gly Ile Gly Arg Phe His
165 170 175
Cys Ala Gly Ser Ile Ile Ser Ser Lys Tyr Ile Leu Ser Ala Ala His
180 185 190
Ala Phe Leu Ile Gly Gly Arg Lys Leu Thr Pro Thr Arg Leu Ala Val
195 200 205
Arg Val Gly Gly His Tyr Val Lys Met Gly Gln Glu Tyr His Val Glu
210 215 220
Asp Val Ile Ile His Pro Asp Tyr Val Glu Arg Glu Asn Tyr Asn Asp
225 230 235 240
Ile Ala Ile Ile Val Leu Lys Glu Glu Leu Asn Phe Thr Asp Leu Val
245 250 255
Arg Pro Ile Cys Leu Pro Asp Pro Glu Ala Val Thr Asp Ser Leu Lys
260 265 270
Gly Arg Arg Val Thr Val Ala Gly Trp Gly Asp Leu Asp Phe Ala Gly
275 280 285
Pro Arg Ser Gln Val Leu Arg Glu Val Ser Ile Pro Val Val Pro Ile
290 295 300
Gly Asp Cys Asn Lys Ala Tyr Gln Lys Leu Asn Thr Leu Ala Leu Lys
305 310 315 320
Asn Gly Ile Thr Lys Lys Phe Ile Cys Ala Gly Leu Glu Glu Gly Gly
325 330 335
Lys Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met Leu Val Asn
340 345 350
Asn Ser Ser Trp Ile Val Thr Gly Val Val Ser Phe Gly His Lys Cys
355 360 365
Ala Glu Glu Gly Phe Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Val Ser Tyr Leu
370 375 380
Glu Trp Ile Ala Lys Val Thr Asn Ser Leu Asp Gln Thr Val Thr Asn
385 390 395 400
<210> 5
<211> 1203
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 中华鲎B因子改变体
<400> 5
atgacgtgga tatgtgtgat aacgttgttt gctctggctt ctgctacgtt gggtaacaaa 60
gttagtagag tgggggtcct cttccccaag acacggaacg acaatgagtg tacagcaaga 120
gggggattga aaggatcctg caaatccctc atagactgtc ctagtgtctt ggctacgttg 180
aaggacagtt ttcctgtcgt ttgctcttgg aatggtcgat ttcagcctat tgtctgctgt 240
cctgatgcaa tagcaccacc acctgtaacc acaacagctg taactgtaat atctacaaaa 300
gaaccaaagc ttccaagatt acatatatca ggttgtggaa aaagaaaagt caaaatagat 360
attacaactg ttggacgctc tggatcacca atacttcctc cgatatctac tcctcaaaat 420
tcaacaggtg ggagaggaat tattgctgga ggcgtagaag ccaaaattgg cgcgtggcct 480
tggatggcag ctgtttttgt gaaaaacttt ggcattggca gattccactg tgctggtagc 540
ataatcagta acaagtacat tttgtcagct gcccactgtt tccttatcgg aggtcgaaag 600
ttgaccccaa ctcgcttagc tgtccgtgtg ggaggccact acataaagag gggtcaagag 660
tatccagtga aagacgtgat tatccatcct cattatgtag aaaaggagaa ctacaatgat 720
atagccataa tcgagttaaa agaggaactg aactttacgg acttggtcaa tcctatatgt 780
ctccctgatc cagagacagt aacggatcca ttaaaagaca gaattgtgac tgcagcggga 840
tggggcgatc tggatttctc cggtccacgg agccaagttc tacgtgaggt aagcatccca 900
gttgttccag ttgataaatg tgatcaagcc tatgagaaac tcaacacccc ttcactaaaa 960
aatgggataa cgaataactt cctttgcgct ggattggaag aaggagggaa agacgcttgc 1020
caaggcgatt ctggtggacc gttgatgcta gtgaacaaca ctaggtggat agtagtagga 1080
gttgtgtcgt tcgggcacaa gtgtgccgag gaaggatatc ctggtgtgta ctcgcgcgta 1140
gcgagttacc tagactggat cgcgaaagtt acgaactcgt tagatcatgc cgtcactaac 1200
tga 1203
<210> 6
<211> 1203
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 中华鲎B因子改变体
<400> 6
atgacgtgga tatgtgtgat aacgttgttt gctctggctt ctgctacgtt gggtaacaaa 60
gttagtagag tgggggtcct cttccccaag acacggaacg acaatgagtg tacagcaaga 120
gggggattga aaggatcctg caaatccctc atagactgtc ctagtgtctt ggctacgttg 180
aaggacagtt ttcctgtcgt ttgctcttgg aatggtcgat ttcagcctat tgtctgctgt 240
cctgatgcaa tagcaccacc acctgtaacc acaacagctg taactgtaat atctacaaaa 300
gaaccaaagc ttccaagatt acatatatca ggttgtggaa aaagaaaagt caaaatagat 360
attacaactg ttggacgctc tggatcacca atacttcctc cgatatctac tcctcaaaat 420
tcaacaggtg ggagaggaat tattgctgga ggcgtagaag ccaaaattgg cgcgtggcct 480
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ttgaccccaa ctcgcttagc tgtccgtgtg ggaggccact acataaagag gggtcaagag 660
tatccagtga aagacgtgat tatccatcct cattatgtag aaaaggagaa ctacaatgat 720
atagccataa tcgagttaaa agaggaactg aactttacgg acttggtcaa tcctatatgt 780
ctccctgatc cagagacagt aacggatcca ttaaaagaca gaattgtgac tgcagcggga 840
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<211> 400
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 中华鲎B因子改变体
<400> 7
Met Thr Trp Ile Cys Val Ile Thr Leu Phe Ala Leu Ala Ser Ala Thr
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Leu Gly Asn Lys Val Ser Arg Val Gly Val Leu Phe Pro Lys Thr Arg
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Asn Asp Asn Glu Cys Thr Ala Arg Gly Gly Leu Lys Gly Ser Cys Lys
35 40 45
Ser Leu Ile Asp Cys Pro Ser Val Leu Ala Thr Leu Lys Asp Ser Phe
50 55 60
Pro Val Val Cys Ser Trp Asn Gly Arg Phe Gln Pro Ile Val Cys Cys
65 70 75 80
Pro Asp Ala Ile Ala Pro Pro Pro Val Thr Thr Thr Ala Val Thr Val
85 90 95
Ile Ser Thr Lys Glu Pro Lys Leu Pro Arg Leu His Ile Ser Gly Cys
100 105 110
Gly Lys Arg Lys Val Lys Ile Asp Ile Thr Thr Val Gly Arg Ser Gly
115 120 125
Ser Pro Ile Leu Pro Pro Ile Ser Thr Pro Gln Asn Ser Thr Gly Gly
130 135 140
Arg Gly Ile Ile Ala Gly Gly Val Glu Ala Lys Ile Gly Ala Trp Pro
145 150 155 160
Trp Met Ala Ala Val Phe Val Lys Asn Phe Gly Ile Gly Arg Phe His
165 170 175
Cys Ala Gly Ser Ile Ile Ser Asn Lys Tyr Ile Leu Ser Ala Ala His
180 185 190
Cys Phe Leu Ile Gly Gly Arg Lys Leu Thr Pro Thr Arg Leu Ala Val
195 200 205
Arg Val Gly Gly His Tyr Ile Lys Arg Gly Gln Glu Tyr Pro Val Lys
210 215 220
Asp Val Ile Ile His Pro His Tyr Val Glu Lys Glu Asn Tyr Asn Asp
225 230 235 240
Ile Ala Ile Ile Glu Leu Lys Glu Glu Leu Asn Phe Thr Asp Leu Val
245 250 255
Asn Pro Ile Cys Leu Pro Asp Pro Glu Thr Val Thr Asp Pro Leu Lys
260 265 270
Asp Arg Ile Val Thr Ala Ala Gly Trp Gly Asp Leu Asp Phe Ser Gly
275 280 285
Pro Arg Ser Gln Val Leu Arg Glu Val Ser Ile Pro Val Val Pro Val
290 295 300
Asp Lys Cys Asp Gln Ala Tyr Glu Lys Leu Asn Thr Pro Ser Leu Lys
305 310 315 320
Asn Gly Ile Thr Asn Asn Phe Leu Cys Ala Gly Leu Glu Glu Gly Gly
325 330 335
Lys Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met Leu Val Asn
340 345 350
Asn Thr Arg Trp Ile Val Val Gly Val Val Ser Phe Gly His Lys Cys
355 360 365
Ala Glu Glu Gly Tyr Pro Gly Val Tyr Ser Arg Val Ala Ser Tyr Leu
370 375 380
Asp Trp Ile Ala Lys Val Thr Asn Ser Leu Asp His Ala Val Thr Asn
385 390 395 400
<210> 8
<211> 1203
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 美洲鲎B因子改变体
<400> 8
atggcgtgga tttgtgtgat aacgttgttt gctttggctt ctagtacgtt gagtaataaa 60
gttagtagag tggggatcat ctttcctaag acacagaacg ataataaaca gtgtacagca 120
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ttgaaggata gtttccctgt cgtttgctct tggaatggtc ggtttcagcc tattgtatgt 240
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tga 1203
<210> 9
<211> 1203
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 美洲鲎B因子改变体
<400> 9
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gttagtagag tggggatcat ctttcctaag acacagaacg ataataaaca gtgtacagca 120
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ttgaaggata gtttccctgt cgtttgctct tggaatggtc ggtttcagcc tattgtatgt 240
tgtcctgatg cagcagcacc aagtgtaacc acaacagtta caactattgt ccctacaaaa 300
gaaacaaaga ttccaagatt acatatacca ggttgtggaa aaagaaaagt aaatgtagat 360
attacaacta ttggacgttc ggggtcacca atacttcctc ccatatctac ttctcaagat 420
ttgaagggtg ggagaggaat cattgctgga ggtgtagaag ctaaaattgg cgcctggcct 480
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tga 1203
<210> 10
<211> 400
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 美洲鲎B因子改变体
<400> 10
Met Ala Trp Ile Cys Val Ile Thr Leu Phe Ala Leu Ala Ser Ser Thr
1 5 10 15
Leu Ser Asn Lys Val Ser Arg Val Gly Ile Ile Phe Pro Lys Thr Gln
20 25 30
Asn Asp Asn Lys Gln Cys Thr Ala Lys Gly Gly Leu Lys Gly Ser Cys
35 40 45
Lys Ser Leu Thr Asp Cys Pro Ala Val Leu Ala Thr Leu Lys Asp Ser
50 55 60
Phe Pro Val Val Cys Ser Trp Asn Gly Arg Phe Gln Pro Ile Val Cys
65 70 75 80
Cys Pro Asp Ala Ala Ala Pro Ser Val Thr Thr Thr Val Thr Thr Ile
85 90 95
Val Pro Thr Lys Glu Thr Lys Ile Pro Arg Leu His Ile Pro Gly Cys
100 105 110
Gly Lys Arg Lys Val Asn Val Asp Ile Thr Thr Ile Gly Arg Ser Gly
115 120 125
Ser Pro Ile Leu Pro Pro Ile Ser Thr Ser Gln Asp Leu Lys Gly Gly
130 135 140
Arg Gly Ile Ile Ala Gly Gly Val Glu Ala Lys Ile Gly Ala Trp Pro
145 150 155 160
Trp Met Ala Ala Val Phe Val Lys Asn Phe Gly Ile Gly Arg Phe His
165 170 175
Cys Ala Gly Ser Ile Ile Ser Ser Lys Tyr Ile Leu Ser Ala Ala His
180 185 190
Cys Phe Leu Ile Gly Gly Arg Lys Leu Thr Pro Thr Arg Leu Ala Val
195 200 205
Arg Val Gly Gly His Tyr Val Lys Met Gly Gln Glu Tyr His Val Glu
210 215 220
Asp Val Ile Ile His Pro Asp Tyr Val Glu Arg Glu Asn Tyr Asn Asp
225 230 235 240
Ile Ala Ile Ile Val Leu Lys Glu Glu Leu Asn Phe Thr Asp Leu Val
245 250 255
Arg Pro Ile Cys Leu Pro Asp Pro Glu Ala Val Thr Asp Ser Leu Lys
260 265 270
Gly Arg Arg Val Thr Val Ala Gly Trp Gly Asp Leu Asp Phe Ala Gly
275 280 285
Pro Arg Ser Gln Val Leu Arg Glu Val Ser Ile Pro Val Val Pro Ile
290 295 300
Gly Asp Cys Asn Lys Ala Tyr Gln Lys Leu Asn Thr Leu Ala Leu Lys
305 310 315 320
Asn Gly Ile Thr Lys Lys Phe Ile Cys Ala Gly Leu Glu Glu Gly Gly
325 330 335
Lys Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met Leu Val Asn
340 345 350
Asn Ser Ser Trp Ile Val Thr Gly Val Val Ser Phe Gly His Lys Cys
355 360 365
Ala Glu Glu Gly Phe Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Val Ser Tyr Leu
370 375 380
Glu Trp Ile Ala Lys Val Thr Asn Ser Leu Asp Gln Thr Val Thr Asn
385 390 395 400
<210> 11
<211> 3060
<212> DNA
<213> 中华鲎（ Tachypleus tridentatus）
<220>
<223> 中华鲎C因子
<400> 11
atggtcttag cgtcgttttt ggtgtctggt ttagttctag ggatactagc ccaacaaatg 60
cgtccagttc agtccagagg agtagatctg ggcttgtgtg atgaaacgag gttcgagtgt 120
aagtgtggag atccaggcta tgtgttcaac gtccctatga aacaatgcac gtacttctat 180
cgatggaggc cttattgtaa accatgtgat gacctggagg ctaaggacat ttgtccaaag 240
tacaaacgat gtcaagagtg taaggctggt cttgatagtt gtgttacttg tccacctaac 300
aaatatggta cttggtgtag cggtgaatgt caatgtaaga atggaggtat ctgtgaccag 360
aggacaggag cttgtacctg tcgtgacaga tatgaaggag cgcactgtga aattctcaaa 420
ggttgtcctc ttcttccatc ggattctcaa gttcaggaag tcagaaaccc accagataat 480
ccccaaacta ttgactacag ctgttcacca gggttcaagc ttaaaggcgt ggcacgaatt 540
agctgtctcc caaatggaca gtggagtagc tttccaccca aatgtattcg agaatgtgcc 600
aaggtttcat ctccagaaca cgggaaagtg aatgctccta gtggcaatat gatagaaggg 660
gctactttac ggttctcatg tgatagtccc tactacttga ttggtcaaga aacattaacc 720
tgccagggta atggtcagtg gagtggacaa ataccacaat gtaagaagtt ggtcttctgt 780
cctgaccttg atcctgtaaa ccatgctgaa caccaggtta aaattggtgt ggaacaaaaa 840
tatggtcagt ttcctcaagg cactgaagtg acctatacgt gttcgggtaa ctacttcttg 900
atgggtttta acaccttaaa atgtaaccct gatgggtcct ggtcaggatc acagccatcc 960
tgtgttaaag tggcagacag agaggtcgac tgtgacagta aagctgtaga cttcttggat 1020
gatgttggtg aacctgtcag gatccactgt cctgctggct gttctttgac agctggtact 1080
gtgtggggta cagccatata ccacgaactt tcctcagtgt gtcgtgcagc catccatgct 1140
ggcaagcttc caaactctgg aggggcggtg catgtagtga acaatggccc ctactcggac 1200
tttctgggta gtgacctgaa tgggataaaa tcggaagagt tgaagtctct tgcccgcagt 1260
tttcgatttg attatgtcag ttcatccaca gcaggtagat caggatgtcc tgatggatgg 1320
tttgaggtag aagagaactg tgtgtacgtt acatcaaaac agagagcctg ggaaagagct 1380
caaggtgtgt gtaccaatat ggctgctcgt cttgctgtgc tagacaaaga tctaattccg 1440
agttccttga ctgagactct acgagggaaa gggttaacaa ccacatggat aggattgcac 1500
agactagatg ctgagaagcc ctttgtttgg gagctaatgg atcgtagtaa tgtggttctg 1560
aatgataacc taacattctg ggcctctggc gaacctggaa atgaaactaa ctgtgtatat 1620
ctggacatcc gagatcagct gcagcctgtg tggaaaacca agtcatgttt tcagccctca 1680
agctttgctt gcatgatgga tttgtcagac agaaataaag ccaaatgcga tgaccctgga 1740
ccactggaaa atggacacgc cacacttcat ggacaaagta ttgatgggtt ctatgctggt 1800
tcttctataa ggtacagctg tgaggttctc cactacctca gtggaactga gaccgtaact 1860
tgtacaacaa atggcacatg gagtgctcct aaacctcgat gtatcaaagt catcacctgc 1920
caaaaccctc ctgtaccatc atatggttct gtggaaatca aacccccaag tcggacaaac 1980
tcgatcagtc gtgttgggtc acctttcttg aggttgccac ggttacccct cccattagcc 2040
agagcagcca aacctcctcc aaaacctaga tcctcacaac cctctactgt ggacttggct 2100
tctaaagtta aactacctga aggtcattac cgggtagggt ctcgagccat ttacacgtgc 2160
gagtcgagat actacgaact acttggatct caaggcagaa gatgtgactc taatggaaac 2220
tggagtggtc ggcccgctag ctgtattcca gtttgtggac ggtcagactc tcctcgttct 2280
cctttcatct ggaatgggaa ttctacagaa ataggtcagt ggccgtggca ggcaggaatc 2340
tctcgatggc ttgcagacca caatatgtgg tttctccagt gtggaggatc cctattgaat 2400
gagaaatgga tcgtcactgc tgcccactgt gtcacctact ctgctactgc tgagataatt 2460
gatcccagtc agtttaaaat ctatctgggc aagtactacc gtgatgacag tagagacgat 2520
gactacgtac aagtaagaga ggctctcgag atccacgtaa atcctaacta cgaccccggc 2580
aatctcaact ttgacatagc cctaattcaa ctgaaaactc ctgttacttt gacaacacga 2640
gtccaaccaa tctgtctgcc tactgacatc acaacaagag aacacttgaa ggagggaaca 2700
ttagcagtgg tgacaggttg gggtttgaat gaaaacaaca catattcaga gatgattcaa 2760
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gcctgcagtg gggacagtgg aggaccatta gtgtttgctg atgattcccg taccgaaagg 2940
cggtgggtct tggaagggat tgtcagctgg ggcagtccca gtggatgtgg caaggctaac 3000
cagtatgggg gcttcactaa agttaacgtt tttctatcat ggattaggca gttcatttga 3060
<210> 12
<211> 1019
<212> PRT
<213> 中华鲎（ Tachypleus tridentatus）
<220>
<223> 中华鲎C因子
<400> 12
Met Val Leu Ala Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Val Leu Gly Ile Leu
1 5 10 15
Ala Gln Gln Met Arg Pro Val Gln Ser Arg Gly Val Asp Leu Gly Leu
20 25 30
Cys Asp Glu Thr Arg Phe Glu Cys Lys Cys Gly Asp Pro Gly Tyr Val
35 40 45
Phe Asn Val Pro Met Lys Gln Cys Thr Tyr Phe Tyr Arg Trp Arg Pro
50 55 60
Tyr Cys Lys Pro Cys Asp Asp Leu Glu Ala Lys Asp Ile Cys Pro Lys
65 70 75 80
Tyr Lys Arg Cys Gln Glu Cys Lys Ala Gly Leu Asp Ser Cys Val Thr
85 90 95
Cys Pro Pro Asn Lys Tyr Gly Thr Trp Cys Ser Gly Glu Cys Gln Cys
100 105 110
Lys Asn Gly Gly Ile Cys Asp Gln Arg Thr Gly Ala Cys Thr Cys Arg
115 120 125
Asp Arg Tyr Glu Gly Ala His Cys Glu Ile Leu Lys Gly Cys Pro Leu
130 135 140
Leu Pro Ser Asp Ser Gln Val Gln Glu Val Arg Asn Pro Pro Asp Asn
145 150 155 160
Pro Gln Thr Ile Asp Tyr Ser Cys Ser Pro Gly Phe Lys Leu Lys Gly
165 170 175
Val Ala Arg Ile Ser Cys Leu Pro Asn Gly Gln Trp Ser Ser Phe Pro
180 185 190
Pro Lys Cys Ile Arg Glu Cys Ala Lys Val Ser Ser Pro Glu His Gly
195 200 205
Lys Val Asn Ala Pro Ser Gly Asn Met Ile Glu Gly Ala Thr Leu Arg
210 215 220
Phe Ser Cys Asp Ser Pro Tyr Tyr Leu Ile Gly Gln Glu Thr Leu Thr
225 230 235 240
Cys Gln Gly Asn Gly Gln Trp Ser Gly Gln Ile Pro Gln Cys Lys Lys
245 250 255
Leu Val Phe Cys Pro Asp Leu Asp Pro Val Asn His Ala Glu His Gln
260 265 270
Val Lys Ile Gly Val Glu Gln Lys Tyr Gly Gln Phe Pro Gln Gly Thr
275 280 285
Glu Val Thr Tyr Thr Cys Ser Gly Asn Tyr Phe Leu Met Gly Phe Asn
290 295 300
Thr Leu Lys Cys Asn Pro Asp Gly Ser Trp Ser Gly Ser Gln Pro Ser
305 310 315 320
Cys Val Lys Val Ala Asp Arg Glu Val Asp Cys Asp Ser Lys Ala Val
325 330 335
Asp Phe Leu Asp Asp Val Gly Glu Pro Val Arg Ile His Cys Pro Ala
340 345 350
Gly Cys Ser Leu Thr Ala Gly Thr Val Trp Gly Thr Ala Ile Tyr His
355 360 365
Glu Leu Ser Ser Val Cys Arg Ala Ala Ile His Ala Gly Lys Leu Pro
370 375 380
Asn Ser Gly Gly Ala Val His Val Val Asn Asn Gly Pro Tyr Ser Asp
385 390 395 400
Phe Leu Gly Ser Asp Leu Asn Gly Ile Lys Ser Glu Glu Leu Lys Ser
405 410 415
Leu Ala Arg Ser Phe Arg Phe Asp Tyr Val Ser Ser Ser Thr Ala Gly
420 425 430
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435 440 445
Tyr Val Thr Ser Lys Gln Arg Ala Trp Glu Arg Ala Gln Gly Val Cys
450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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645 650 655
Ser Arg Thr Asn Ser Ile Ser Arg Val Gly Ser Pro Phe Leu Arg Leu
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Pro Arg Leu Pro Leu Pro Leu Ala Arg Ala Ala Lys Pro Pro Pro Lys
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Pro Arg Ser Ser Gln Pro Ser Thr Val Asp Leu Ala Ser Lys Val Lys
690 695 700
Leu Pro Glu Gly His Tyr Arg Val Gly Ser Arg Ala Ile Tyr Thr Cys
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Glu Ser Arg Tyr Tyr Glu Leu Leu Gly Ser Gln Gly Arg Arg Cys Asp
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Ser Asn Gly Asn Trp Ser Gly Arg Pro Ala Ser Cys Ile Pro Val Cys
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Gly Arg Ser Asp Ser Pro Arg Ser Pro Phe Ile Trp Asn Gly Asn Ser
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Tyr Arg Asp Asp Ser Arg Asp Asp Asp Tyr Val Gln Val Arg Glu Ala
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850 855 860
Asp Ile Ala Leu Ile Gln Leu Lys Thr Pro Val Thr Leu Thr Thr Arg
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Val Gln Pro Ile Cys Leu Pro Thr Asp Ile Thr Thr Arg Glu His Leu
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<210> 13
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<212> DNA
<213> 美洲鲎（Limulus polyphemus）
<220>
<223> 美洲鲎C因子
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<220>
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675 680 685
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805 810 815
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820 825 830
Tyr Tyr Arg Asp Asp Ser Lys Asp Asp Asp Tyr Val Gln Val Arg Glu
835 840 845
Ala Ile Glu Ile His Val Asn Pro Asn Tyr Asp Pro Gly Asn Leu Asn
850 855 860
Phe Asp Ile Ala Leu Ile Gln Leu Lys Thr Ser Val Ala Leu Thr Thr
865 870 875 880
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885 890 895
Leu Lys Glu Gly Ala Leu Ala Val Val Thr Gly Trp Gly Leu Asn Glu
900 905 910
Asn Asn Thr Tyr Ser Glu Met Ile Gln Gln Ala Val Leu Pro Val Val
915 920 925
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980 985 990
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<212> DNA
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<220>
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tgtcagggta atggtcagtg gaatggacag ataccacaat gtaagaactt ggtcttctgt 780
cctgacctgg atcctgtaaa ccatgctgaa cacaaggtta aaattggtgt ggaacaaaaa 840
tatggtcagt ttcctcaagg cactgaagtg acctatacgt gttcgggtaa ctacttcttg 900
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gaccccaatc agtttaaaat gtatctgggc aagtactacc gtgatgacag tagagacgat 2520
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gtccaaccaa tctgtctgcc tactgacatc acaacaagag aacacttgaa ggagggaaca 2700
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ttaccactga cagtaacaga gaacatgttc tgtgcaggtt acaagaaggg acgttatgat 2880
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<211> 1019
<212> PRT
<213> 圆尾鲎（Carcinoscorpius rotundicauda）
<220>
<223> 圆尾鲎C因子
<400> 16
Met Val Leu Ala Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu
1 5 10 15
Ala Gln Lys Met Arg Pro Val Gln Ser Lys Gly Val Asp Leu Gly Leu
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Cys Asp Glu Thr Arg Phe Glu Cys Lys Cys Gly Asp Pro Gly Tyr Val
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Phe Asn Ile Pro Val Lys Gln Cys Thr Tyr Phe Tyr Arg Trp Arg Pro
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Tyr Cys Lys Pro Cys Asp Asp Leu Glu Ala Lys Asp Ile Cys Pro Lys
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Tyr Lys Arg Cys Gln Glu Cys Lys Ala Gly Leu Asp Ser Cys Val Thr
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Cys Pro Pro Asn Lys Tyr Gly Thr Trp Cys Ser Gly Glu Cys Gln Cys
100 105 110
Lys Asn Gly Gly Ile Cys Asp Gln Arg Thr Gly Ala Cys Ala Cys Arg
115 120 125
Asp Arg Tyr Glu Gly Val His Cys Glu Ile Leu Lys Gly Cys Pro Leu
130 135 140
Leu Pro Ser Asp Ser Gln Val Gln Glu Val Arg Asn Pro Pro Asp Asn
145 150 155 160
Pro Gln Thr Ile Asp Tyr Ser Cys Ser Pro Gly Phe Lys Leu Lys Gly
165 170 175
Met Ala Arg Ile Ser Cys Leu Pro Asn Gly Gln Trp Ser Asn Phe Pro
180 185 190
Pro Lys Cys Ile Arg Glu Cys Ala Met Val Ser Ser Pro Glu His Gly
195 200 205
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210 215 220
Phe Ser Cys Asp Ser Pro Tyr Tyr Leu Ile Gly Gln Glu Thr Leu Thr
225 230 235 240
Cys Gln Gly Asn Gly Gln Trp Asn Gly Gln Ile Pro Gln Cys Lys Asn
245 250 255
Leu Val Phe Cys Pro Asp Leu Asp Pro Val Asn His Ala Glu His Lys
260 265 270
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340 345 350
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580 585 590
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Leu Pro Glu Gly His Tyr Arg Val Gly Ser Arg Ala Ile Tyr Thr Cys
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Glu Ser Arg Tyr Tyr Glu Leu Leu Gly Ser Gln Gly Arg Arg Cys Asp
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Ser Asn Gly Asn Trp Ser Gly Arg Pro Ala Ser Cys Ile Pro Val Cys
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Gly Arg Ser Asp Ser Pro Arg Ser Pro Phe Ile Trp Asn Gly Asn Ser
755 760 765
Thr Glu Ile Gly Gln Trp Pro Trp Gln Ala Gly Ile Ser Arg Trp Leu
770 775 780
Ala Asp His Asn Met Trp Phe Leu Gln Cys Gly Gly Ser Leu Leu Asn
785 790 795 800
Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Thr Tyr Ser Ala Thr
805 810 815
Ala Glu Ile Ile Asp Pro Asn Gln Phe Lys Met Tyr Leu Gly Lys Tyr
820 825 830
Tyr Arg Asp Asp Ser Arg Asp Asp Asp Tyr Val Gln Val Arg Glu Ala
835 840 845
Leu Glu Ile His Val Asn Pro Asn Tyr Asp Pro Gly Asn Leu Asn Phe
850 855 860
Asp Ile Ala Leu Ile Gln Leu Lys Thr Pro Val Thr Leu Thr Thr Arg
865 870 875 880
Val Gln Pro Ile Cys Leu Pro Thr Asp Ile Thr Thr Arg Glu His Leu
885 890 895
Lys Glu Gly Thr Leu Ala Val Val Thr Gly Trp Gly Leu Asn Glu Asn
900 905 910
Asn Thr Tyr Ser Glu Thr Ile Gln Gln Ala Val Leu Pro Val Val Ala
915 920 925
Ala Ser Thr Cys Glu Glu Gly Tyr Lys Glu Ala Asp Leu Pro Leu Thr
930 935 940
Val Thr Glu Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Lys Gly Arg Tyr Asp
945 950 955 960
Ala Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Phe Ala Asp Asp Ser
965 970 975
Arg Thr Glu Arg Arg Trp Val Leu Glu Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser
980 985 990
Pro Ser Gly Cys Gly Lys Ala Asn Gln Tyr Gly Gly Phe Thr Lys Val
995 1000 1005
Asn Val Phe Leu Ser Trp Ile Arg Gln Phe Ile
1010 1015
<210> 17
<211> 1128
<212> DNA
<213> 中华鲎（ Tachypleus tridentatus）
<220>
<223> 中华鲎凝固酶前体
<400> 17
atgttggtga ataacgtgtt ttcactactg tgtttcccac tcttgatgtc tgtggttaga 60
tgcagtactc tcagcagaca gcgtagacag tttgttttcc ctgacgagga agaactttgc 120
tcaaaccgat ttactgaaga aggaacatgc aaaaatgtct tggattgtag aatactttta 180
caaaaaaatg attataattt actcaaagaa tcaatatgcg gctttgaagg cataacaccc 240
aaagtttgtt gtccgaaatc aagccatgta atttcaagta cacaggcacc tccagaaacc 300
actacgactg aacgcccacc aaaacagata ccacccaatc ttcctgaagt gtgtggaatt 360
cacaatacta caactaccag gattattgga ggtcgggaag cacctattgg agcctggccg 420
tggatgactg ctgtctacat aaaacaagga ggaatcagaa gtgttcagtg tggtggcgca 480
cttgtcacta acaggcacgt gattacagct tcgcactgtg ttgtaaacag tgcaggaaca 540
gatgtgatgc cagctgatgt attctcggtt cgtctgggtg aacacaattt atacagtacc 600
gatgacgatt cgaatccaat agattttgca gttacgtcgg tgaaacatca cgaacacttt 660
gtactcgcga cgtatttgaa tgacatcgca attctaacgt taaatgacac agttacgttt 720
acagacagaa ttcgacccat ttgtctacct tatcgtaagt tgagatacga tgatctagca 780
atgagaaaac cgtttatcac tggatgggga acaacagcat ttaacggccc atctagtgca 840
gtgttgagag aagtacagtt accaatatgg gaacacgagg cctgtagaca ggcctacgag 900
aaggatttaa atattacaaa cgtgtatatg tgtgctggct ttgcagatgg cgggaaggat 960
gcttgccagg gtgattctgg aggtccaatg atgttgcctg ttaaaaccgg agagttttat 1020
ctcattggaa ttgtgtcttt cggaaagaaa tgcgcattgc ctggatttcc tggggtttac 1080
acaaaagtga cagagttttt agattggatt gcagaacata tggtgtag 1128
<210> 18
<211> 375
<212> PRT
<213> 中华鲎（ Tachypleus tridentatus）
<220>
<223> 中华鲎凝固酶前体
<400> 18
Met Leu Val Asn Asn Val Phe Ser Leu Leu Cys Phe Pro Leu Leu Met
1 5 10 15
Ser Val Val Arg Cys Ser Thr Leu Ser Arg Gln Arg Arg Gln Phe Val
20 25 30
Phe Pro Asp Glu Glu Glu Leu Cys Ser Asn Arg Phe Thr Glu Glu Gly
35 40 45
Thr Cys Lys Asn Val Leu Asp Cys Arg Ile Leu Leu Gln Lys Asn Asp
50 55 60
Tyr Asn Leu Leu Lys Glu Ser Ile Cys Gly Phe Glu Gly Ile Thr Pro
65 70 75 80
Lys Val Cys Cys Pro Lys Ser Ser His Val Ile Ser Ser Thr Gln Ala
85 90 95
Pro Pro Glu Thr Thr Thr Thr Glu Arg Pro Pro Lys Gln Ile Pro Pro
100 105 110
Asn Leu Pro Glu Val Cys Gly Ile His Asn Thr Thr Thr Thr Arg Ile
115 120 125
Ile Gly Gly Arg Glu Ala Pro Ile Gly Ala Trp Pro Trp Met Thr Ala
130 135 140
Val Tyr Ile Lys Gln Gly Gly Ile Arg Ser Val Gln Cys Gly Gly Ala
145 150 155 160
Leu Val Thr Asn Arg His Val Ile Thr Ala Ser His Cys Val Val Asn
165 170 175
Ser Ala Gly Thr Asp Val Met Pro Ala Asp Val Phe Ser Val Arg Leu
180 185 190
Gly Glu His Asn Leu Tyr Ser Thr Asp Asp Asp Ser Asn Pro Ile Asp
195 200 205
Phe Ala Val Thr Ser Val Lys His His Glu His Phe Val Leu Ala Thr
210 215 220
Tyr Leu Asn Asp Ile Ala Ile Leu Thr Leu Asn Asp Thr Val Thr Phe
225 230 235 240
Thr Asp Arg Ile Arg Pro Ile Cys Leu Pro Tyr Arg Lys Leu Arg Tyr
245 250 255
Asp Asp Leu Ala Met Arg Lys Pro Phe Ile Thr Gly Trp Gly Thr Thr
260 265 270
Ala Phe Asn Gly Pro Ser Ser Ala Val Leu Arg Glu Val Gln Leu Pro
275 280 285
Ile Trp Glu His Glu Ala Cys Arg Gln Ala Tyr Glu Lys Asp Leu Asn
290 295 300
Ile Thr Asn Val Tyr Met Cys Ala Gly Phe Ala Asp Gly Gly Lys Asp
305 310 315 320
Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Met Met Leu Pro Val Lys Thr
325 330 335
Gly Glu Phe Tyr Leu Ile Gly Ile Val Ser Phe Gly Lys Lys Cys Ala
340 345 350
Leu Pro Gly Phe Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Glu Phe Leu Asp
355 360 365
Trp Ile Ala Glu His Met Val
370 375
<210> 19
<211> 1128
<212> DNA
<213> 美洲鲎（Limulus polyphemus）
<220>
<223> 美洲鲎凝固酶前体
<400> 19
atgttggtga ataacatgtt ttcattgctg tgtttcccac tcctgatgtc tatgtttagc 60
tgcagtagtc tcggcagaca gcgtagacag tttgttttcc ccgatgatga agaatcatgc 120
tcaaaccgat ttactaacga tggaatatgt aaagatgttt tgaattgtag agatctttta 180
caaaaaaatg attataattt actgaaagaa tcaatatgcg gttttgaagg cataacaccc 240
aaagtttgtt gtccgaaaca aagtattgta aatccaataa cagaagcacc tccaaaaacc 300
actacaactg aacgaccgcc aatacggata ccatccaatc ttcctaaaca gtgtggaaat 360
cgtaatatta caactaccag gattattgga gggcaggaag caacacctgg agcctggccc 420
tggatggctg ctgtctatat caaacaagga ggaatcagaa gtgttcagtg tggaggtgcg 480
cttgtcacca acaggcacgt gattacagca tcgcactgtg ttgtaaacag tttaggaaca 540
gatgtgatgc gagctgacgt attctcggtt cgcctaggtg aacacaattt atatagcacc 600
aatgacagtt cagatccaat tgattttgca gttacgtcag tgaaacatca tgaaaacttt 660
gtgctcgcga cgtatttgaa tgatatcgca attctgaagt taaacgacac tgttacgttt 720
acgcacaaaa ttaaaccaat ttgtctacct tatgaaagct taaggtatga ggatctagca 780
atgagaaacc catttgtcgc cggatgggga acaacagcat ttaatggccc atctagtgca 840
gtattacgag aagtgcagtt accaatatgg ggacacgagc cctgcaggca ggcctacgag 900
aaggatttaa atattacaaa cgtgtatatg tgtgctgggt atgcagatgg cggtaaagat 960
gcttgccagg gtgattctgg aggtccaatg atgttgcctg ataaaagcgg gaacttttat 1020
ctcgttggaa ttgtgtcttt cggaaagaaa tgcgcgttgc ctggatttcc tggggtttac 1080
acaaaagtga ccgaattttt agattggatt gcagtaaata tggtgtag 1128
<210> 20
<211> 375
<212> PRT
<213> 美洲鲎（Limulus polyphemus）
<220>
<223> 美洲鲎凝固酶前体
<400> 20
Met Leu Val Asn Asn Met Phe Ser Leu Leu Cys Phe Pro Leu Leu Met
1 5 10 15
Ser Met Phe Ser Cys Ser Ser Leu Gly Arg Gln Arg Arg Gln Phe Val
20 25 30
Phe Pro Asp Asp Glu Glu Ser Cys Ser Asn Arg Phe Thr Asn Asp Gly
35 40 45
Ile Cys Lys Asp Val Leu Asn Cys Arg Asp Leu Leu Gln Lys Asn Asp
50 55 60
Tyr Asn Leu Leu Lys Glu Ser Ile Cys Gly Phe Glu Gly Ile Thr Pro
65 70 75 80
Lys Val Cys Cys Pro Lys Gln Ser Ile Val Asn Pro Ile Thr Glu Ala
85 90 95
Pro Pro Lys Thr Thr Thr Thr Glu Arg Pro Pro Ile Arg Ile Pro Ser
100 105 110
Asn Leu Pro Lys Gln Cys Gly Asn Arg Asn Ile Thr Thr Thr Arg Ile
115 120 125
Ile Gly Gly Gln Glu Ala Thr Pro Gly Ala Trp Pro Trp Met Ala Ala
130 135 140
Val Tyr Ile Lys Gln Gly Gly Ile Arg Ser Val Gln Cys Gly Gly Ala
145 150 155 160
Leu Val Thr Asn Arg His Val Ile Thr Ala Ser His Cys Val Val Asn
165 170 175
Ser Leu Gly Thr Asp Val Met Arg Ala Asp Val Phe Ser Val Arg Leu
180 185 190
Gly Glu His Asn Leu Tyr Ser Thr Asn Asp Ser Ser Asp Pro Ile Asp
195 200 205
Phe Ala Val Thr Ser Val Lys His His Glu Asn Phe Val Leu Ala Thr
210 215 220
Tyr Leu Asn Asp Ile Ala Ile Leu Lys Leu Asn Asp Thr Val Thr Phe
225 230 235 240
Thr His Lys Ile Lys Pro Ile Cys Leu Pro Tyr Glu Ser Leu Arg Tyr
245 250 255
Glu Asp Leu Ala Met Arg Asn Pro Phe Val Ala Gly Trp Gly Thr Thr
260 265 270
Ala Phe Asn Gly Pro Ser Ser Ala Val Leu Arg Glu Val Gln Leu Pro
275 280 285
Ile Trp Gly His Glu Pro Cys Arg Gln Ala Tyr Glu Lys Asp Leu Asn
290 295 300
Ile Thr Asn Val Tyr Met Cys Ala Gly Tyr Ala Asp Gly Gly Lys Asp
305 310 315 320
Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Met Met Leu Pro Asp Lys Ser
325 330 335
Gly Asn Phe Tyr Leu Val Gly Ile Val Ser Phe Gly Lys Lys Cys Ala
340 345 350
Leu Pro Gly Phe Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Glu Phe Leu Asp
355 360 365
Trp Ile Ala Val Asn Met Val
370 375
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的引物 (引物 1)
<400> 21
gggaccggta gaggagtaga tctgggc 27
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的引物 (引物 2)
<400> 22
gggctcgagt cattaaatga actgcctaat 30
<210> 23
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的引物 (引物 3)
<400> 23
ggggaattca agcttgccac catggtctta gcgtcgttt 39
<210> 24
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的引物 (引物 4)
<400> 24
gccctcgatg tgatggtgat ggtggtggga ctgaactgga cgcatttgt 49
<210> 25
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的引物 (引物 5)
<400> 25
agaagaggag tagatctggg cttgtgtg 28
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的引物 (引物 6)
<400> 26
gggaccggtc accaccatca ccatcacatc 30
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的引物 (引物 7)
<400> 27
tctagattat caaatgaact gcctaatcca 30
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BGH reverse 引物
<400> 28
tagaaggcac agtcgagg 18
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的引物 (引物 8)
<400> 29
agcctctgct aaccatgttc atgc 24
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的引物 (引物 9)
<400> 30
gggaccggtg tgggggtcct cttcccc 27
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的引物 (引物 10)
<400> 31
gggctcgagt tagttagtga cggcatgatc 30
<210> 32
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的引物 (引物 11)
<400> 32
cttccttatc ggaggtcgaa agttgacccc aactc 35
<210> 33
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的引物 (引物 12)
<400> 33
cagtgggcag ctgacaaaat gtacttgtta ctgat 35
<210> 34
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的引物 (引物 13)
<400> 34
gggaccggtc accaccatca ccatcacatc gagggcagaa gaggagtaga tctgggc 57
<210> 35
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的引物 (引物 14)
<400> 35
gggctcgagt caaatgaact gccgaatcca cgata 35
<210> 36
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的引物 (引物 15)
<400> 36
ggggaattca agcttgccac catggcgtgg atttgtgtg 39
<210> 37
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的引物 (引物 16)
<400> 37
acctccaatg aggaagcagt gggcagcaga caa 33
<210> 38
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的引物 (引物 17)
<400> 38
ttgtctgctg cccactgctt cctcattgga ggt 33
<210> 39
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的引物 (引物 18)
<400> 39
gggctcgagt cagttagtga ctgcctggtc taacg 35
<210> 40
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的引物 (引物 19)
<400> 40
gggctcgagt cagtgatggt gatggtggtg gttagtgact gcctggtc 48
<210> 41
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的引物 (引物 20)
<400> 41
gggaccggtg tggggatcat ctttcctaag acaca 35
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的引物 (引物 21)
<400> 42
caccagccac caccttctga tag 23

Claims (11)

1.一种多肽，其具有在鲎B因子的多肽的氨基酸序列中第193位的氨基酸残基被置换为半胱氨酸(Cys)残基的氨基酸序列。
2.一种多肽，其用下述(A)～(D)的任一个表示：
(A)具有下述(A1)或(A2)所示的氨基酸序列的多肽；
(A1)序列号7中的氨基酸编号1～400所示的氨基酸序列；
(A2)序列号7中的氨基酸编号24～400所示的氨基酸序列；
(B)具有下述(B1)或(B2)所示的氨基酸序列的多肽；
(B1)序列号10中的氨基酸编号1～400所示的氨基酸序列；
(B2)序列号10中的氨基酸编号24～400所示的氨基酸序列；
(C)具有在所述(A)或(B)所示的多肽的氨基酸序列中置换、缺失、插入、和/或添加1个或多个氨基酸残基而成的氨基酸序列，其中，第193位的半胱氨酸、即Cys残基既不被置换也不缺失、且具有鲎B因子的功能的多肽；
(D)具有在所述(A)～(C)的任一个所示的多肽中添加肽标签而成的融合多肽的氨基酸序列、且具有鲎B因子的功能的多肽。
3.一种核酸，其编码权利要求1或2所述的多肽。
4.一种DNA，其用下述(a)～(d)的任一个表示：
(a)具有下述(a1)～(a4)的任一个所示的碱基序列的DNA；
(a1)序列号5中的碱基编号1～1200所示的碱基序列；
(a2)序列号5中的碱基编号70～1200所示的碱基序列；
(a3)序列号6中的碱基编号1～1200所示的碱基序列；
(a4)序列号6中的碱基编号70～1200所示的碱基序列；
(b)具有下述(b1)～(b4)的任一个所示的碱基序列的DNA；
(b1)序列号8中的碱基编号1～1200所示的碱基序列；
(b2)序列号8中的碱基编号70～1200所示的碱基序列；
(b3)序列号9中的碱基编号1～1200所示的碱基序列；
(b4)序列号9中的碱基编号70～1200所示的碱基序列；
(c)与由和所述(a)或(b)所示的DNA互补的碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交且碱基编号577～579所示的碱基保守、并且编码具有鲎B因子的功能的多肽的DNA；
(d)具有在所述(a)～(c)的任一个所示的DNA中添加编码肽标签的DNA而成的融合DNA的碱基序列、且编码具有鲎B因子的功能的多肽的DNA。
5.一种载体，其保有权利要求3所述的核酸、和/或权利要求4所述的DNA。
6.一种细胞，其保有权利要求3所述的核酸、权利要求4所述的DNA、和/或权利要求5所述的载体。
7.一种多肽的制造方法，其包含以下工序：
使用权利要求6所述的细胞生成具有鲎B因子的功能的多肽。
8.一种多肽，其通过权利要求7中所记载的方法而得到。
9.一种内毒素的测定方法，其包含下述(1)及(2)的工序：
(1)将权利要求1、2或8所述的多肽、鲎C因子、及待测试样进行混合的工序；
(2)测定所述多肽的蛋白酶活性的工序。
10.一种内毒素测定用试剂，其含有权利要求1、2或8所述的多肽作为构成成分。
11.一种内毒素测定用试剂盒，其含有权利要求1、2或8所述的多肽或权利要求10所述的试剂作为构成成分。
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