ES2967126T3 - Variante del factor B del cangrejo de herradura - Google Patents
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Abstract
La presente invención proporciona una técnica relacionada con una variante del factor B del cangrejo herradura y, a su vez, proporciona un medio para analizar con alta sensibilidad una endotoxina. Se produce un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos, en el que el residuo de aminoácido en la posición 193 en la secuencia de aminoácidos del polipéptido del factor B del cangrejo herradura está sustituido en un residuo de cisteína (Cys). Preparando un reactivo de Limulus usando una combinación del polipéptido así obtenido con factor C de cangrejo herradura, se puede analizar una endotoxina con una alta sensibilidad. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Variante del factor B del cangrejo de herradura
La presente invención se refiere a una variante del factor B del cangrejo de herradura.
Es importante disponer de un medio para detectar una sustancia derivada de microorganismos en el control de la higiene de medicamentos y productos alimenticios o en el diagnóstico de animales, incluidos los seres humanos, y medir el alcance de la contaminación por microorganismos. En cuanto a los medios para medir el alcance de la contaminación por microorganismos, se utiliza popularmente la prueba de Limulus. La prueba de Limulus es una tecnología para medir el alcance de la contaminación por microorganismos mediante el uso de una endotoxina (LPS) o (1^-3)-p-D-glucano como sustancia objetivo para la medición, y es un método de medición que utiliza la propiedad de que un precursor de proteasa portado por los cangrejos de herradura se activa por estas sustancias objetivo para su medición.
Con respecto a la prueba de Limulus, se usa ampliamente un método que consiste en utilizar un extracto de hemocitos del cangrejo de herradura (lisado de amebocitos del cangrejo de herradura; en lo sucesivo en la presente memoria, denominado simplemente "lisado"). Este método es un método de utilización de una reacción en cascada que se produce cuando los precursores de la serina proteasa (factor C, factor B y enzima procoagulante) entran en contacto con una endotoxina, o cuando los precursores de la serina proteasa (factor G y enzima procoagulante) entran en contacto con (1^-3)-p-D-glucano, y los precursores de la serina proteasa se activan secuencialmente.
La bibliografía no de patente 1 describe el factor B deTachypleus tridentatusaislado del lisado. Además, la bibliografía no de patente 2 describe una secuencia de aminoácidos de un polipéptido del factor B deTachypleus tridentatus.Sin embargo, en ninguna de estas bibliografías se describe una variante del factor B que tenga características enzimáticas que sean superiores al propio factor B. La bibliografía no de patente 3 es una información de secuencia de una proteasa. La bibliografía no de patente 4 describe un factor B de coagulación del cangrejo de herradura. La bibliografía no de patente 5 describe problemas sobre la mejora funcional de la subtilisina E, una proteasa deBacillus subtilis,mediante ingeniería de proteínas. La bibliografía no de patente 6 describe un enfoque de ingeniería genética para desarrollar reactivos de próxima generación para la cuantificación de endotoxinas en Cos-1.
Bibliografía no de patente 1: Nakamura, T., Horiuchi, T., Morita, T., Iwanaga, S. (1986) J. Biochem. 99, 847-57
Bibliografía no de patente 2: Muta, T., Oda, T., Iwanaga, S. (1993) J. Biol. Chem. 268, 21384-8
Bibliografía no de patente 3: A. Schwarz, 2014, https://www.uniprot.org/uniprot/A0A023F4D5.txt
Bibliografía no de patente 4: Muta Tatsushi, et al, The Journal of Biological Chemistry, vol. 268, n.° 28, 1993, páginas 21384-21388
Bibliografía no de patente 5: Takagi Hiroshi, Nippon Nogeikagaku Kaishi, vol. 71, n.° 10, 1997, páginas 995 1002
Bibliografía no de patente 6: Hiraku Mizumura, et al. Innate Immunity, vol. 23, n.° 2, 2017, páginas 136-146
Un objetivo de la presente invención es proporcionar una tecnología relacionada con una variante del factor B del cangrejo de herradura. En particular, un objetivo de la presente invención es proporcionar un polipéptido de una variante del factor B del cangrejo de herradura; un ácido nucleico que codifica el polipéptido; un vector que retiene el ácido nucleico; una célula que retiene el ácido nucleico y/o el vector; un método para producir el polipéptido; un método para medir una endotoxina mediante el uso del polipéptido; un reactivo para la medición de endotoxinas que incluye el polipéptido como componente constituyente; y un kit para la medición de endotoxinas que incluye el polipéptido o el reactivo como parte componente.
Los inventores de la presente invención llevaron a cabo una investigación exhaustiva para resolver los problemas descritos anteriormente y, como resultado, los inventores descubrieron que cuando se modifica un residuo de aminoácido en un sitio particular de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido del factor B del cangrejo de herradura, se puede obtener una variante del factor B del cangrejo de herradura que tiene una actividad de proteasa superior a la del propio factor B. Además, los presentes inventores también descubrieron que se puede obtener una variante del factor B del cangrejo de herradura que tiene una estabilidad térmica superior a la del propio factor B mediante el hallazgo descrito anteriormente. Así, los presentes inventores completaron la presente invención basándose en estos hallazgos.
Los problemas descritos anteriormente pueden resolverse mediante la presente invención tal como se define en el conjunto de reivindicaciones adjunto.
[1] Un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos en donde el residuo de aminoácido de la posición 193 en una secuencia de aminoácidos de un polipéptido del factor B del cangrejo de herradura que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 2 o SEQ ID N°: 4 está sustituido con un residuo de cisteína (Cys).
[2] Un polipéptido representado por cualquiera de los siguientes puntos (A) a (D):
(A) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por los siguientes puntos (A1) o (A2):
(A1) una secuencia de aminoácidos representada por los números de aminoácido 1 a 400 de SEQ ID N°: 7; y
(A2) una secuencia de aminoácidos representada por los números de aminoácido 24 a 400 de SEQ ID N°: 7,
(B) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por los siguientes puntos (B1) o (B2):
(B1) una secuencia de aminoácidos representada por los números de aminoácido 1 a 400 de SEQ ID N°: 10; y
(B2) una secuencia de aminoácidos representada por los números de aminoácido 24 a 400 de SEQ ID N°: 10,
(C) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 90% o superior con la secuencia de aminoácidos del polipéptido representado por al menos uno de los puntos (A) y (B), con tal de que el residuo de cisteína (Cys) de la posición 193 de SEQ ID N°: 7 y SEQ ID N°: 10 no esté sustituido ni delecionado, y
(D) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de fusión en el que se añade una etiqueta peptídica al polipéptido representado por cualquiera de los puntos (A) a (C) descritos anteriormente, y el polipéptido tiene la función del factor B del cangrejo de herradura, en donde la función del factor B del cangrejo de herradura es la función de entrar en contacto con el factor C activado para cambiarlo a una forma activada, escindir una enzima procoagulante y, por lo tanto, cambiar la enzima procoagulante hasta una enzima coagulante.
[3] Un ácido nucleico que codifica el polipéptido según los puntos [1] o [2].
[4] Un ADN representado por cualquiera de los siguientes puntos (a), (b) y (d):
(a) Un ADN que tiene una secuencia de bases representada por cualquiera de los siguientes puntos (a1) a (a4):
(a1) Una secuencia de bases representada por los números de base 1 a 1200 de SEQ ID N°: 5;
(a2) Una secuencia de bases representada por los números de base 70 a 1200 de SEQ ID N°: 5;
(a3) Una secuencia de bases representada por los números de base 1 a 1200 de SEQ ID N°: 6; y
(a4) Una secuencia de bases representada por los números de base 70 a 1200 de SEQ ID N°: 6,
(b) Un ADN que tiene una secuencia de bases representada por cualquiera de los siguientes puntos (b1) a (b4):
(b1) Una secuencia de bases representada por los números de base 1 a 1200 de SEQ ID N°: 8;
(b2) Una secuencia de bases representada por los números de base 70 a 1200 de SEQ ID N°: 8;
(b3) Una secuencia de bases representada por los números de base 1 a 1200 de SEQ ID N°: 9; y
(b4) Una secuencia de bases representada por los números de base 70 a 1200 de SEQ ID N°: 9, y
(d) Un ADN que tiene una secuencia de bases de un ADN de fusión en el que se añade un ADN que codifica una etiqueta peptídica al ADN representado por el punto (a) o (b) descrito anteriormente, y el ADN codifica un polipéptido que tiene la función del factor B del cangrejo de herradura,
en donde la función del factor B del cangrejo de herradura es la función de entrar en contacto con el factor C activado para cambiarlo a una forma activada, escindir una enzima procoagulante y, por lo tanto, cambiar la enzima procoagulante hasta una enzima coagulante.
[5] Un vector que retiene el ácido nucleico según el punto [3] y/o el ADN según el punto [4].
[6] Una célula que retiene el ácido nucleico según el punto [3], el ADN según el punto [4] y/o el vector según el punto [5].
[7] Un método para producir un polipéptido, y el método incluye una etapa de producción de un polipéptido que tiene la función del factor B del cangrejo de herradura mediante el uso de la célula según el punto [6].
[8] Un método para medir una endotoxina, y el método incluye las etapas de los siguientes puntos (1) y (2):
(1) Una etapa de mezclar el polipéptido según los puntos [1] o [2] con el factor C del cangrejo de herradura y una muestra de prueba; y
(2) Una etapa de medir la actividad de proteasa del polipéptido.
[9] Un reactivo para la medición de endotoxinas, que incluye el polipéptido según los puntos [1] o [2] como componente constituyente.
[10] Un kit para la medición de endotoxinas, que incluye el polipéptido según los puntos [1] o [2], o el reactivo según el punto [9], como parte componente.
Según la presente invención, se puede proporcionar una variante del factor B del cangrejo de herradura que tenga una actividad de proteasa superior a la del propio factor B. Además, según la presente invención, se proporciona una variante del factor B del cangrejo de herradura que tiene una estabilidad térmica superior a la del propio factor B.
[FIG. 1] La FIG. 1 es un diagrama que muestra la actividad específica (unidades/pmol) del factor B deTachypleus tridentatus(TFB) y una variante del factor B deTachypleus tridentatus(Murasame-TFB).
[FIG. 2] La FIG. 2 es un diagrama que muestra la estabilidad térmica del factor B deTachypleus tridentatus(TFB) (gráfico representado por o) y la variante del factor B deTachypleus tridentatus(Murasame-TFB) (gráfico representado por • ).
La expresión "factor de Limulus", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere individual o colectivamente al factor C, al factor B y a la enzima procoagulante. Además, la expresión "reactivo de Limulus", tal como se usa en la presente invención, se refiere a un reactivo que incluye cualquier factor de Limulus arbitrario como componente constituyente y se usa en una prueba de Limulus.
Según la presente invención, se pueden realizar una serie de reacciones mediante las cuales el factor C que ha entrado en contacto con una endotoxina cambia autocatalíticamente a una forma activada (factor C activado), y el factor B se escinde mediante la actividad de proteasa del factor C activado y cambia así al factor B activado, lo que puede denominarse "reacción en cascada". Además, según la presente invención, también puede denominarse "reacción en cascada" una serie de reacciones que también incluyen, además de estas series de reacciones, una reacción mediante la cual la enzima procoagulante se escinde mediante la actividad de proteasa del factor B activado y, por lo tanto, se transforma en una enzima coagulante.
<1> Polipéptido de la presente invención
El polipéptido de la presente invención es un polipéptido en donde un residuo de aminoácido en un sitio particular en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido del factor B del cangrejo de herradura está modificado. El polipéptido de la presente invención es específicamente un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos en donde el residuo de aminoácido de la posición 193 de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido del factor B del cangrejo de herradura está sustituido con un residuo de cisteína (Cys).
Se sabe que una secuencia de veintitrés residuos del extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido del factor B del cangrejo de herradura funciona como una secuencia señal (bibliografía no de patente 2). Por lo tanto, con respecto al polipéptido de la presente invención, los expertos habituales en la técnica pueden entender que además de un polipéptido en una realización que tiene la secuencia señal, un polipéptido en una realización que no tiene la secuencia señal (polipéptido en una realización que no tiene los veintitrés residuos del extremo N-terminal) y un polipéptido en una realización que tiene otra secuencia señal (secuencia señal distinta de la secuencia señal inherentemente poseída por los cangrejos de herradura) también constituyen una realización del polipéptido de la presente invención.
En la presente invención, el tipo de cangrejo de herradura no está particularmente limitado. Con respecto al cangrejo de herradura, se conocen cuatro tipos, a saber,Tachypleus tridentatus, Limulus polyphemus, Carcinoscorpius rotundicaudayTachypleus gigas,y estos cangrejos de herradura pueden mencionarse como ejemplos del cangrejo de herradura descrito en la presente memoria. El polipéptido de la presente invención es, por ejemplo, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos en donde el residuo de aminoácido de la posición 193 de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido del factor B para dicho cangrejo de herradura está sustituido con un residuo de cisteína (Cys).
Según la presente memoria descriptiva, es preferible que el cangrejo de herradura seaTachypleus tridentatus, Limulus polyphemusoCarcinoscorpius rotundicauda.Según la presente invención, el cangrejo de herradura esTachypleus tridentatusoLimulus polyphemus.
El polipéptido descrito en la presente memoria se ejemplifica específicamente mediante un polipéptido representado por cualquiera de los siguientes puntos (A) a (D).
(A) Un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por los siguientes puntos (A1) o (A2):
(A1) Una secuencia de aminoácidos representada por los números de aminoácido 1 a 400 de SEQ ID N°: 7; y
(A2) Una secuencia de aminoácidos representada por los números de aminoácido 24 a 400 de SEQ ID N°: 7,
(B) Un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por los siguientes puntos (B1) o (B2):
(B1) Una secuencia de aminoácidos representada por los números de aminoácido 1 a 400 de SEQ ID N°: 10; y
(B2) Una secuencia de aminoácidos representada por los números de aminoácido 24 a 400 de SEQ ID N°: 10,
(C) Un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye la sustitución, deleción, inserción y/o adición de un residuo de aminoácido o una pluralidad de residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del polipéptido representado por el punto (A) o (B) (con tal de que el residuo de cisteína (Cys) de la posición 193 no esté sustituido ni delecionado), y el polipéptido tiene la función del factor B del cangrejo de herradura, y
(D) Un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de fusión en el que se añade una etiqueta peptídica al polipéptido representado por cualquiera de los puntos (A) a (C), y el polipéptido tiene la función del factor B del cangrejo de herradura.
El "polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos", como se usa para la presente invención, incluye el "polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos" como una realización.
La secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID N°: 7 para el punto (A) es una secuencia de aminoácidos que incluye la sustitución del residuo de aminoácido de la posición 193 en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido del factor B deTachypleus tridentatus(SEQ ID N°: 2) con un residuo de cisteína (Cys).
La secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID N°: 10 para el punto (B) es una secuencia de aminoácidos que incluye la sustitución del residuo de aminoácido de la posición 193 de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido del factor B deLimulus polyphemus(SEQ ID N°: 4) con un residuo de cisteína (Cys).
La secuencia de aminoácidos del polipéptido que se muestra en el punto (C) es una secuencia de aminoácidos que incluye la sustitución, deleción, inserción y/o adición de un residuo de aminoácido o una pluralidad de residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del polipéptido mostrado en el punto (A) o (B), con el residuo de cisteína (Cys) de la posición 193 no sustituido ni delecionado (el residuo Cys de la posición 193 está conservado). Mientras tanto, el residuo de cisteína (Cys) de la posición 193 representa la posición del residuo de cisteína (Cys) a conservar en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID N°: 7 o SEQ ID N°: 10. Por lo tanto, el residuo de cisteína (Cys) que se conserva en una secuencia de aminoácidos que incluye la sustitución, deleción, inserción y/o adición de un residuo de aminoácido o una pluralidad de residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del polipéptido representado por el punto (A) o (B) (es decir, la secuencia de aminoácidos representada por el punto (C)) es un residuo de cisteína (Cys) de una posición que corresponde al residuo de cisteína (Cys) de la posición 193 en la alineación de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos original (secuencia de aminoácidos del polipéptido representado por el punto (A) o (B)).
La expresión "una pluralidad", tal como se usa para el punto (C), significa el número (número total) de residuos de aminoácidos en la medida en que incluso si el polipéptido se somete a sustitución, deleción, inserción y/o adición, el polipéptido no pierde la función del factor B del cangrejo de herradura. La expresión "una pluralidad" puede ser, por ejemplo, un número de preferiblemente un 10% o menos, más preferiblemente un 5% o menos, incluso más preferiblemente un 2% o menos, y particularmente preferiblemente un 1% o menos, respecto del número total de residuos de aminoácidos que constituyen el polipéptido.
Por lo tanto, en el caso de la secuencia de aminoácidos del polipéptido representado por el punto (A1) o (B1), dado que el número total de residuos de aminoácidos es 400, "una pluralidad" puede ser preferiblemente de 2 a 40, más preferiblemente de 2 a 20, incluso más preferiblemente de 2 a 8, y particularmente preferiblemente de 2 a 4. Además, en el caso de la secuencia de aminoácidos del polipéptido representado por el punto (A2) o (B2), dado que el número total de residuos de aminoácidos es 377, "una pluralidad" puede ser preferiblemente de 2 a 37, más preferiblemente de 2 a 18, incluso más preferiblemente de 2 a 7, y particularmente preferiblemente de 2 a 3. La expresión "una pluralidad", tal como se usa para el punto (C) puede ser, como números individuales específicos, un número entero como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho.
La expresión "sustitución, deleción, inserción y/o adición", tal como se usan para el punto (C), son, por ejemplo, mutaciones conservativas. Un ejemplo representativo de mutación conservativa es la sustitución conservativa. La mutación conservativa es una mutación resultante de lo siguiente: en el caso en el que el sitio de sustitución es un aminoácido aromático, la sustitución se produce entre Phe, Trp y Tyr; en el caso en el que el sitio de sustitución es un aminoácido hidrófobo, la sustitución se produce entre Leu, Ile y Val; en el caso en el que el sitio de sustitución es un aminoácido polar, la sustitución se produce entre Gln y Asn; en el caso en el que el sitio de sustitución es un aminoácido básico, la sustitución se produce entre Lys, Arg e His; en el caso en el que el sitio de sustitución es un aminoácido ácido, la sustitución se produce entre Asp y Glu; y en el caso en el que el sitio de sustitución es un aminoácido que tiene un grupo hidroxilo, la sustitución se produce entre Ser y Thr. Los ejemplos específicos de una sustitución que se considera una sustitución conservativa incluyen la sustitución de Ala por Ser o Thr; la sustitución de Arg por Gln, His o Lys; la sustitución de Asn por Glu, Gln, Lys, His o Asp; la sustitución de Asp por Asn, Glu o Gln; la sustitución de Cys por Ser o Ala; la sustitución de Gln por Asn, Glu, Lys, His, Asp o Arg; la sustitución de Glu por Gly, Asn, Gln, Lys o Asp; la sustitución de Gly por Pro; la sustitución de His por Asn, Lys, Gln, Arg o Tyr; la sustitución de Ile por Leu, Met, Val o Phe; la sustitución de Leu por Ile, Met, Val o Phe; la sustitución de Lys por Asn, Glu, Gln, His o Arg; la sustitución de Met por Ile, Leu, Val o Phe; la sustitución de Phe por Trp, Tyr, Met, Ile o Leu; la sustitución de Ser por Thr o Ala; la sustitución de Thr por Ser o Ala; la sustitución de Trp por Phe o Tyr; la sustitución de Tyr por His, Phe o Trp; y la sustitución de Val por Met, Ile o Leu.
El polipéptido representado por el punto (C) puede ser, por ejemplo, un polipéptido que tiene una similitud de preferiblemente un 90% o más, más preferiblemente un 95% o más, incluso más preferiblemente un 98% o más, y particularmente preferiblemente un 99% o más respecto de la secuencia de aminoácidos del polipéptido representado por el punto (A) o (B), y el polipéptido tiene la función del factor B del cangrejo de herradura (con tal de que el residuo de cisteína (Cys) de la posición 193 pueda conservarse). Mientras tanto, dado que el término "similitud", como se usa en la presente memoria, es un concepto que incluye la "identidad", la similitud puede reemplazarse por la identidad y puede aplicarse a las realizaciones adecuadas del polipéptido.
El polipéptido representado por el punto (C) puede tener cualquier residuo de aminoácido arbitrario sustituido o delecionado en la secuencia de aminoácidos del polipéptido representado por el punto (A) o (B) con tal de que el residuo de cisteína (Cys) de la posición 193 no esté sustituido ni delecionado (el residuo Cys de la posición 193 está conservado). Sin embargo, es preferible que otros residuos Cys que están conservados (existen en la misma posición) entre la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de factor B deTachypleus tridentatus(SEQ ID N°: 2) y la secuencia de aminoácidos de un polipéptido del factor B deLimulus polyphemus(SEQ ID N°: 4) también se conserven (ni sustituidos ni delecionados). Específicamente, es preferible para el polipéptido representado por el punto (C) que los residuos de Cys de la posición 112, posición 177, posición 193, posición 260, posición 307, posición 329, posición 340 y posición 368 de la secuencia de aminoácidos del polipéptido representado por el punto (A) o (B) estén conservados (ni sustituidos ni delecionados).
La "etiqueta peptídica", tal como se utiliza para el punto (D), significa un péptido que se añade al polipéptido para facilitar la detección o purificación. La longitud y secuencia de aminoácidos de la "etiqueta peptídica" no están particularmente limitadas, con tal de que un polipéptido de fusión en el que se añade una etiqueta peptídica al polipéptido representado por cualquiera de los puntos (A) a (C) tenga la función del factor B del cangrejo de herradura. Los ejemplos de dicha etiqueta peptídica incluyen un péptido 6*His (etiqueta His), péptido FLAG (etiqueta FLAG), péptido c-myc (etiqueta myc), proteína A, proteína de unión a maltosa (MBP) y glutatión-S-transferasa (GST).
La etiqueta peptídica se puede añadir directamente al polipéptido representado por cualquiera de los puntos (A) a (C), o se puede añadir al polipéptido a través de cualquier enlazador arbitrario. El "enlazador", tal como se utiliza en la presente memoria, puede ser cualquier enlazador peptídico que incluya una secuencia de aminoácidos arbitraria. La longitud y secuencia de aminoácidos del "enlazador peptídico", como se usa en la presente memoria, no están particularmente limitadas, de manera similar al caso de la etiqueta peptídica, con tal de que el polipéptido de fusión en el que se añade una etiqueta peptídica al polipéptido representado por cualquiera de los puntos (A) a (C) tenga la función del factor B del cangrejo de herradura.
La etiqueta peptídica se puede añadir, por ejemplo, al extremo N-terminal y/o C-terminal del polipéptido. La etiqueta peptídica se puede añadir únicamente al lado N-terminal del polipéptido, se puede añadir únicamente al lado C-terminal o se puede añadir a ambos extremos. Se puede añadir un tipo de etiqueta peptídica al polipéptido, o también se pueden añadir dos o más tipos de etiquetas peptídicas. Además, con respecto a los diversos tipos de etiquetas peptídicas que se añadirán al polipéptido, se puede añadir independientemente una etiqueta peptídica de cada tipo, o se pueden añadir independientemente dos o más etiquetas peptídicas de cada tipo.
La "función del factor B del cangrejo de herradura" según la presente invención significa la función como precursor de proteasa que posee el factor B del cangrejo de herradura. La "función del factor B del cangrejo de herradura" significa específicamente la función de entrar en contacto con el factor C activado para cambiar a una forma activada (factor B activado) y exhibir la actividad de proteasa.
La función del factor B del cangrejo de herradura es, por ejemplo, la función de entrar en contacto con el factor C activado para cambiar a una forma activada (factor B activado), escindiendo una enzima procoagulante y, por lo tanto, cambiar la enzima procoagulante hasta una enzima coagulante. Además, la función del factor B del cangrejo de herradura es, por ejemplo, la función de entrar en contacto con el factor C activado para cambiar a una forma activada (factor B activado), escindir un sustrato para la detección, que sirve como sustrato para el factor B activado, y liberar así una sustancia marcadora. Con respecto al factor C, la enzima procoagulante y el sustrato para la detección como se usan en la presente memoria, por ejemplo, se pueden usar adecuadamente las realizaciones descritas en relación con el método de medición de la presente invención que se describirá más adelante.
Se puede determinar si un polipéptido tiene la función del factor B del cangrejo de herradura, por ejemplo, evaluando si el polipéptido exhibe la actividad de proteasa cuando se pone en contacto con el factor C activado. Específicamente, se puede determinar si un polipéptido tiene la función del factor B del cangrejo de herradura, por ejemplo, mediante el método descrito en el <Ejemplo 2> o <Ejemplo 5> que se describirán más adelante.
Además, también se puede determinar si un polipéptido tiene la función del factor B del cangrejo de herradura, por ejemplo, evaluando, en un caso en el que se usa un reactivo de Limulus configurado para incluir el polipéptido en combinación con el factor C, si se produce una reacción en cascada cuando se permite que el reactivo de Limulus coexista con una endotoxina.
Además, se puede determinar si un polipéptido tiene la función del factor B del cangrejo de herradura, por ejemplo, evaluando, en un caso en el que se usa un reactivo de Limulus configurado para incluir el polipéptido en combinación con el factor C y una enzima procoagulante, si se produce una reacción en cascada cuando se permite que el reactivo de Limulus coexista con una endotoxina.
Por lo tanto, el polipéptido representado por el punto (C) se puede obtener, por ejemplo, empleando la función del factor B del cangrejo de herradura como marcador, y seleccionando un sitio donde se puede llevar a cabo la sustitución, deleción, inserción y/o adición de un residuo de aminoácido o una pluralidad de residuos de aminoácidos sin perder la función del factor B del cangrejo de herradura, a partir de la secuencia de aminoácidos representada por el punto (A) o (B). Además, el polipéptido representado por el punto (D) se puede obtener, por ejemplo, empleando la función del factor B del cangrejo de herradura como marcador y seleccionando un polipéptido al que se puede añadir una etiqueta peptídica sin perder la función del factor B del cangrejo de herradura, de los polipéptidos representados por cualquiera de los puntos (A) a (C).
Una realización del polipéptido de la presente invención es un polipéptido que exhibe una actividad de proteasa que es superior a la del propio factor B del cangrejo de herradura. El propio factor B del cangrejo de herradura es específicamente un polipéptido que incluye la misma secuencia de aminoácidos que el factor B del cangrejo de herradura que se produce de forma natural. El propio factor B del cangrejo de herradura es más específicamente, por ejemplo, un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos en donde el residuo de aminoácido de la posición 193 de la secuencia de aminoácidos representada por el punto (A) o (B) está sustituido con un residuo de alanina (Ala) (polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID N°: 2 o SEQ ID N°: 4). El polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido caracterizado porque, por ejemplo, la actividad de proteasa (actividad específica) exhibida cuando el polipéptido entra en contacto con el factor C activado cambia a una forma activada (factor B activado) que es dos veces o más, preferiblemente 5 veces o más, y más preferiblemente 10 veces o más, en comparación con el propio factor B del cangrejo de herradura. Además, el polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido caracterizado porque, por ejemplo, la actividad de proteasa (actividad específica) exhibida cuando el polipéptido entra en contacto con el factor C activado para cambiar a una forma activada (factor B activado) es 80 unidades/pmol o más, preferiblemente 200 unidades/pmol o más, más preferiblemente 300 unidades/pmol o más, y particularmente preferiblemente 400 unidades/pmol o más. En la presente memoria, 1 unidad corresponde a la actividad de proteasa capaz de escindir 1 pmol de un sustrato (sustrato para la detección) durante 1 minuto a 37 °C. Las condiciones de medición para la actividad enzimática (unidades/pmol) pueden ser, por ejemplo, las condiciones descritas en el <Ejemplo 2> o el <Ejemplo 5>.
Una realización del polipéptido de la presente invención es un polipéptido que tiene una estabilidad térmica superior a la del propio factor B del cangrejo de herradura. El polipéptido de la presente invención puede ser, por ejemplo, un polipéptido caracterizado porque la actividad de proteasa (actividad específica) exhibida cuando el polipéptido que se ha calentado durante 2 minutos a 50 °C se pone en contacto con el factor C activado para cambiar a una forma activada (factor B activado) es un 50% o más, preferiblemente un 70% o más, y más preferiblemente un 80% o más, en comparación con la actividad del polipéptido que no se ha calentado. Además, el polipéptido de la presente invención puede ser, por ejemplo, un polipéptido caracterizado porque incluso después de calentarlo durante 2 minutos a 60 °C, 70 °C, 80 °C o 90 °C, el polipéptido no pierde la función del factor B del cangrejo de herradura.
El polipéptido de la presente invención puede ser, por ejemplo, un polipéptido caracterizado porque la actividad de proteasa (actividad específica) exhibida cuando el polipéptido que se ha calentado durante 2 minutos a 60 °C se pone en contacto con el factor C activado para cambiar a una forma activada (factor B activado) es del 30% o más, preferiblemente del 50% o más, y más preferiblemente del 70% o más, en comparación con la actividad del polipéptido que no se ha calentado. Además, el polipéptido de la presente invención puede ser, por ejemplo, un polipéptido caracterizado porque la actividad de proteasa (actividad específica) exhibida cuando el polipéptido que se ha calentado durante 2 minutos a 90 °C se pone en contacto con el factor C activado para cambiar a una forma activada (factor B activado) es del 20% o más, preferiblemente del 30% o más, y más preferiblemente del 40% o más, en comparación con la actividad del polipéptido que no se ha calentado.
La actividad de proteasa del factor B activado se puede medir, por ejemplo, mediante el método descrito en el <Ejemplo 2> o el <Ejemplo 5> que se describirá a continuación, mediante el cual se puede medir la actividad de proteasa del factor B (factor B activado) que se ha activado al ponerse en contacto con el factor C activado.
En la presente memoria, la secuencia de aminoácidos del polipéptido es homóloga al factor de Limulus del cangrejo de herradura y se encuentra una gran similitud entre especies. La similitud de las secuencias de aminoácidos se puede calcular mediante el uso de programas informáticos conocidos y, por ejemplo, la similitud se puede calcular mediante el uso del algoritmo BLAST (Karlin, S., Altschul, SF. (1993) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 90, 5873-7) o el algoritmo FASTA (Pearson, WR. (1990) Methods Enzymol. 183, 63-98). Específicamente, la similitud de las secuencias de aminoácidos se puede calcular mediante el uso, por ejemplo, de GENETYX (fabricado por Genetyx Corporation).
Por ejemplo, el polipéptido del factor B deTachypleus tridentatus(SEQ ID N°: 2, n.° de acceso del NCBI: BAA03528.1) y el polipéptido del factor B deLimulus polyphemus(SEQ ID N°: 4, n.° de acceso del NCBI: XP_013784210.1) tienen una similitud del 98,5%.
Además, por ejemplo, el polipéptido del factor C deTachypleus tridentatus(SEQ ID N°: 12, n.° de acceso del NCBI: BAA14315.1) y el polipéptido del factor C deLimulus polyphemus(SEQ ID N°: 14) tienen una similitud del 99,5%. El polipéptido del factor C deTachypleus tridentatusy el polipéptido del factor C deCarcinoscorpius rotundicauda(SEQ ID N°: 16, n.° de acceso del NCBI AAB34361.1) tienen una similitud del 99,8%. El polipéptido del factor C deLimulus polyphemusy el polipéptido del factor C deCarcinoscorpius rotundicaudatienen una similitud del 99,4%.
Además, por ejemplo, el polipéptido de la enzima procoagulante deTachypleus tridentatus(SEQ ID N°: 18, n.° de acceso del NCBI: AAA30094.1) y el polipéptido de la enzima procoagulante deLimulus polyphemus(SEQ ID N°: 20, n.° de acceso del NCBI: XP_013783518.1) tienen una similitud del 96,0%.
Por lo tanto, la tecnología de la presente invención se verifica mediante la modificación de los respectivos polipéptidos del factor B deTachypleus tridentatusy del factor B deLimulus polyphemusen los Ejemplos descritos a continuación; sin embargo, una persona normalmente experta en la técnica puede entender que la tecnología de la presente invención también es aplicable a los polipéptidos de otros factores B del cangrejo de herradura. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de los respectivos polipéptidos del factor B deCarcinoscorpius rotundicauday del factor B deTachypleus gigasy las secuencias de bases que codifican los polipéptidos aún no se conocen; sin embargo, los expertos habituales en la técnica pueden entender que la tecnología de la presente invención también es aplicable a los polipéptidos de estos factores B.
El polipéptido de la presente invención puede ser una realización compuesta del polipéptido de la presente invención o puede ser una realización que incluya otros componentes. Los "otros componentes", como se usan en la presente memoria, no están particularmente limitados con tal de que no sean componentes que hagan que el polipéptido de la presente invención pierda la función. Los ejemplos de los "otros componentes" incluyen un agente tamponador, una sal de metal alcalino, una sal de metal alcalinotérreo y un tensioactivo. Los ejemplos de los "otros componentes" también incluyen componentes distintos del polipéptido de la presente invención (un ácido nucleico, una proteína, un carbohidrato, un lípido y similares), y los componentes derivan de células que producen el polipéptido de la presente invención.
El polipéptido de la presente invención puede tener cualquier forma arbitraria. El polipéptido de la presente invención puede estar, por ejemplo, en forma sólida, tal como un producto liofilizado, o puede estar en forma líquida en estado de disolución en un disolvente arbitrario, tal como un disolvente acuoso.
La concentración en peso ocupada por el polipéptido de la presente invención en el polipéptido de la presente invención puede ser, por ejemplo, del 0,001% o más, 0,01% o más, 0,1% o más, 1% o más, 5% o más, 10% o más, 25% o más, o 50% o más. Además, la concentración en peso ocupada por el polipéptido de la presente invención en el polipéptido de la presente invención puede ser, por ejemplo, del 100% o menos, 75% o menos, 50% o menos, 25% o menos, 10% o menos, 5% o menos, o 1% o menos.
El polipéptido de la presente invención se puede producir mediante cualquier técnica conocida basada en la descripción de la presente memoria descriptiva. El polipéptido de la presente invención se puede producir, por ejemplo, mediante una técnica de ingeniería genética. Específicamente, el polipéptido de la presente invención se puede producir, por ejemplo, mediante el método de producción de la presente invención que se describirá a continuación. El polipéptido de la presente invención puede ser el propio líquido de cultivo que se puede obtener cultivando células según el método de producción de la presente invención, o puede ser una fracción obtenida purificando este líquido de cultivo en la medida deseada.
<2> Ácido nucleico de la presente invención
El ácido nucleico de la presente invención es un ácido nucleico que codifica el polipéptido de la presente invención. El ácido nucleico de la presente invención no está particularmente limitado, con tal de que sea un ácido nucleico que codifique el polipéptido de la presente invención. El ácido nucleico de la presente invención incluye todos los ácidos nucleicos que tienen secuencias de bases que varían debido a la degeneración de los códigos genéticos (codones) pero que codifican el mismo polipéptido, con tal de que los ácidos nucleicos sean ácidos nucleicos que codifiquen el polipéptido de la presente invención. El término "ácido nucleico", tal como se utiliza en la presente memoria, incluye el ADN y el ARN.
El ácido nucleico de la presente invención puede ser un ácido nucleico bicatenario o un ácido nucleico monocatenario. En el caso en el que el ácido nucleico de la presente invención es un ácido nucleico bicatenario, el ácido nucleico también puede ser una cadena híbrida formada a partir de un ADN y un ARN. Además, dado que el ácido nucleico de la presente invención es un ácido nucleico que codifica el polipéptido de la presente invención, el ácido nucleico de la presente invención puede ser un ácido nucleico que tiene una secuencia de un intrón dentro de la región que codifica el polipéptido de la presente invención, o puede ser un ácido nucleico que no tiene una secuencia de un intrón en esa región. Además, el ácido nucleico de la presente invención puede ser un ARNm (precursor de ARNm o un ARNm maduro) o puede ser un ADN (ADNc) sintetizado mediante una reacción de transcripción inversa a partir de un ARNm. El ácido nucleico de la presente invención puede ser un ácido nucleico aislado.
El ácido nucleico descrito en la presente memoria es, por ejemplo, un ADN que tiene una secuencia de bases en donde la base del número de base 577 en una secuencia de bases de un ADNc que codifica un polipéptido del factor B del cangrejo de herradura está sustituida con timina (T), la base del número de base 578 está sustituida con guanina (G), y la base del número de base 579 está sustituida con timina (T) o citosina (C), y el ácido nucleico es un ADN que codifica un polipéptido que tiene la función del factor B del cangrejo de herradura. Específicamente, el ácido nucleico descrito en la presente memoria puede ser, por ejemplo, un ADN representado por cualquiera de los siguientes puntos (a) a (d).
(a) Un ADN que tiene una secuencia de bases representada por cualquiera de los siguientes puntos (a1) a (a4):
(a1) una secuencia de bases representada por los números de base 1 a 1200 de SEQ ID N°: 5;
(a2) una secuencia de bases representada por los números de base 70 a 1200 de SEQ ID N°: 5;
(a3) una secuencia de bases representada por los números de base 1 a 1200 de SEQ ID N°: 6; y
(a4) una secuencia de bases representada por los números de base 70 a 1200 de SEQ ID N°: 6,
(b) un ADN que tiene una secuencia de bases representada por cualquiera de los siguientes puntos (b1) a (b4):
(b1) una secuencia de bases representada por los números de base 1 a 1200 de SEQ ID N°: 8;
(b2) una secuencia de bases representada por los números de base 70 a 1200 de SEQ ID N°: 8;
(b3) una secuencia de bases representada por los números de base 1 a 1200 de SEQ ID N°: 9; y
(b4) una secuencia de bases representada por los números de base 70 a 1200 de SEQ ID N°: 9,
(c) un ADN que hibrida con un ADN que incluye una secuencia de bases complementaria al ADN representado por el punto (a) o (b) en condiciones estrictas (con tal de que se conserven las bases representadas por los números de base 577 a 579), el ADN que codifica un polipéptido que tiene la función del factor B del cangrejo de herradura, y
(d) un ADN que tiene una secuencia de bases de un ADN de fusión en el que se añade un ADN que codifica una etiqueta peptídica al ADN representado por cualquiera de los puntos (a) a (c), y el ADN que codifica el polipéptido tiene la función del factor B del cangrejo de herradura.
El "ácido nucleico que tiene una secuencia de bases", como se usa para la presente invención, incluye este "ácido nucleico que consiste en una secuencia de bases" como una realización. Por lo tanto, el "ADN que tiene una secuencia de bases", como se usa para la presente invención, incluye este "ADN que consiste en una secuencia de bases" como una realización.
La secuencia de bases representada por SEQ ID N°: 5 para el punto (a) es una secuencia de bases en donde, en un ADN (SEQ ID N°: 1) que codifica un polipéptido del factor B deTachypleus tridentatus,la base del número de base 577 está sustituida con timina (T), la base del número de base 578 está sustituida con guanina (G) y la base del número de base 579 está sustituida con timina (T).
La secuencia de bases representada por SEQ ID N°: 6 para el punto (a) es una secuencia de bases en donde, en la secuencia de bases de un ADN (SEQ ID N°: 1) que codifica un polipéptido del factor B deTachypleus tridentatus,la base del número de base 577 está sustituida con timina (T) y la base del número de base 578 está sustituida con guanina (G).
La secuencia de bases representada por SEQ ID N°: 8 para el punto (b) es una secuencia de bases en donde, en la secuencia de bases de un ADN (SEQ ID N°: 3) que codifica un polipéptido del factor B deLimulus polyphemus,la base del número de base 577 está sustituida con timina (T) y la base del número de base 578 está sustituida con guanina (G).
La secuencia de bases representada por SEQ ID N°: 9 para el punto (b) es una secuencia de bases en donde, en la secuencia de bases de un ADN (SEQ ID N°: 3) que codifica un polipéptido del factor B deLimulus polyphemus,la base del número de base 577 está sustituida con timina (T), la base del número de base 578 está sustituida con guanina (G) y la base del número de base 579 está sustituida con citosina (C).
Las "condiciones estrictas" empleadas para el punto (c) significan condiciones en las que se forma un híbrido específico mientras no se forma un híbrido inespecífico. Por lo tanto, las "condiciones estrictas", como se usan en la presente memoria, significan, por ejemplo, las condiciones en las que se forma un híbrido específico para un ADN que incluye una secuencia de bases que es complementaria al ADN representado por el punto (a) o (b). Un ejemplo de las condiciones estrictas son las condiciones en las que los ADN que tienen una alta similitud, por ejemplo, los ADN que tienen una similitud del 80% o más, preferiblemente del 90% o más, más preferiblemente del 95% o más, incluso más preferiblemente del 98% o más, y particularmente preferiblemente del 99% o más, hibridan entre sí, y los ADN que tienen una similitud menor que esa no hibridan entre sí. Un ejemplo de tales condiciones es, por ejemplo, las condiciones en las que los ADN se lavan una vez, preferiblemente dos o tres veces, a una concentración de sal y una temperatura que corresponden a 60 °C, SSC 1x, 0,1% de SDS; preferiblemente 60 °C, SSC 0,1x, 0,1% de<s>D<s>; y más preferiblemente 68 °C, SSC 0,1x, 0,1% de SDS, que son condiciones para el lavado en la hibridación de Southern convencional. Además, otro ejemplo de tales condiciones son las condiciones en las que los ADN se hibridan a 42 °C en una disolución que incluye formamida al 50%, SSC 4x, HEPES-NaOH 50 mM (pH 7,0), disolución de Denhardt 10x y 100 |jg/ml de ADN de esperma de salmón, el híbrido se lava a temperatura ambiente con una disolución que incluye SSC 2x y 0,1% de SDS, y el híbrido se lava adicionalmente a 50 °C con una disolución que incluye SSC 0,1x y 0,1% de SDS (Sambrook J, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).
El ADN representado por el punto (c) se puede producir, por ejemplo, realizando la sustitución, deleción, inserción y/o adición de un residuo de ácido nucleico (en lo sucesivo, denominado colectivamente "introducción de mutación") para el ADN representado por el punto (a) o (b), en una región distinta de los números de base 577 a 579 de la misma secuencia de bases. La "introducción de mutación", como se usa en la presente memoria, se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante cualquier método conocido.
Con respecto al método para realizar la "introducción de mutación", se puede mencionar como ejemplo un método que utiliza una enzima de restricción y la ADN ligasa T4. Es decir, se puede obtener un ADN que tiene una mutación introducida en el mismo sometiendo a los dos extremos de un fragmento de ADN que tiene una mutación introducida en el mismo, a una digestión limitada mediante el uso de una enzima de restricción; mezclando el resultado con un vector en donde se ha subclonado un ADN representado por el punto (a) o (b), habiendo sometido al ADN a una digestión limitada mediante el uso de la misma enzima de restricción; y luego sometiendo a los dos a ligadura mediante el uso de la ADN ligasa T4. El "fragmento de ADN que tiene una mutación introducida en el mismo" se puede obtener, por ejemplo, mediante una reacción de PCR mediante el uso de oligonucleótidos en los que se ha introducido dicha mutación como cebadores.
Además, otro ejemplo del método para implementar la "introducción de mutación" es un método de introducción de mutación específica de sitio. Los ejemplos del método de introducción de mutaciones específicas de sitio incluyen los métodos que usan una reacción de PCR (Higuchi, R. (1989) en PCR Technology (Erlich, H.A., ed.) Stockton Press, Nueva York, págs. 61-70; Carter, P. (1987) Methods Enzymol., 154, 382-403), y los métodos que usan fagos (Kramer, W., Fritz, H.J. (1987) Methods Enzymol., 154, 350-67; Kunkel, T.A., Roberts, J.D., Zakour, R.A. (1987) Methods Enzymol., 154, 367-82). Específicamente, el método de introducción de mutación específica de sitio se puede llevar a cabo mediante el uso, por ejemplo, del kit KOD-Plus-Mutagenesis (fabricado por Toyobo Co., Ltd.).
El ADN representado por el punto (c) puede tener una mutación introducida en cualquier sitio arbitrario en la secuencia de bases de un ADN representado por el punto (a) o (b), con tal de que no se introduzca ninguna mutación en los sitios representados por los números de base 577 a 579 (se conservan las bases representadas por los números de base 577 a 579); sin embargo, es preferible que el ADN representado por el punto (c) sea un ADN que codifica un polipéptido en donde los otros residuos de Cys que se conservan (existen en las mismas posiciones) entre la secuencia de aminoácidos de un polipéptido del factor B deTachypleus tridentatus(SEQ ID N°: 2) y la secuencia de aminoácidos de un polipéptido del factor B deLimulus polyphemus(SEQ ID N°: 4) también están conservados (ni sustituidos ni delecionados). Con respecto al ADN representado por el punto (c), específicamente, es preferible que las secuencias de bases (codones) representadas por los números de base 334 a 336, los números de base 529 a 531, los números de base 577 a 579, los números de base 778 a 780, los números base 919 a 921, los números base 985 a 987, los números base 1018 a 1020 y los números base 1102 a 1104 se conservan (TGT o TGC).
La realización de la "etiqueta peptídica" para el punto (d) es la misma que la realización relativa al "<1> Polipéptido de la presente invención" descrita anteriormente. Por lo tanto, con tal de que un polipéptido codificado por un ADN tenga la función del factor B del cangrejo de herradura, se puede utilizar un ADN de fusión en donde un ADN que codifica una etiqueta peptídica se añade a un ADN representado por el punto (a), (b) o (c), también se incluye como ejemplo del ácido nucleico de la presente invención.
Tal "ADN de fusión en el que se añade un ADN que codifica una etiqueta peptídica" se puede producir, por ejemplo, mediante un método que utiliza una enzima de restricción y la ADN ligasa T4. Es decir, el ADN de fusión se puede obtener sometiendo a los dos extremos de un fragmento de ADN que codifica una etiqueta peptídica a una digestión limitada mediante el uso de una enzima de restricción; mezclando el resultado con un vector en el que se ha subclonado un ADN representado por cualquiera de los puntos (a) a (c), y el ADN se ha sometido a una digestión limitada mediante el uso de la misma enzima de restricción; y luego sometiendo a los dos a ligadura mediante el uso de la ADN ligasa T4.
Además, tal "ADN de fusión en el que se añade una etiqueta peptídica que codifica ADN" también puede obtenerse, por ejemplo, mediante una reacción de PCR que utiliza oligonucleótidos que tienen la secuencia de bases del ADN que codifica la etiqueta peptídica como cebadores, y utiliza el ADN representado por cualquiera de los puntos (a) a (c) como molde.
El polipéptido codificado por el ácido nucleico de la presente invención se puede producir, por ejemplo, mediante el método de producción de la presente invención que se describirá a continuación. Con respecto al método de producción de la presente invención, específicamente, se puede mencionar como ejemplo un método de uso de una célula de mamífero como se describe en el <Ejemplo 1> o el <Ejemplo 4> que se describirán más adelante.
El polipéptido codificado por el ácido nucleico de la presente invención es un polipéptido que tiene la función del factor B del cangrejo de herradura. La definición de la "función del factor B del cangrejo de herradura", tal como se utiliza en la presente memoria, es como se describe en relación con la sección anterior "<1> Polipéptido de la presente invención". Por lo tanto, al determinar si el polipéptido codificado por el ácido nucleico tiene la función del factor B del cangrejo de herradura según el método descrito en la sección "<1> Polipéptido de la presente invención", se puede seleccionar el ADN representado por el punto (c) o (d).
El ácido nucleico de la presente invención se puede producir mediante cualquier técnica conocida, basada en la descripción de la presente memoria descriptiva. El ácido nucleico de la presente invención se puede producir mediante una técnica de ingeniería genética. Específicamente, el ácido nucleico de la presente invención se puede producir, por ejemplo, mediante la reacción de PCR descrita en el <Ejemplo 1> o el <Ejemplo 4> que se describirán más adelante. Además, el ácido nucleico de la presente invención también se puede producir, por ejemplo, mediante síntesis química completa de la secuencia de bases.
<3> Vector de la presente invención
El vector de la presente invención es un vector que retiene el ácido nucleico de la presente invención. El tipo o número del ácido nucleico de la presente invención retenido por el vector de la presente invención no está particularmente limitado. El vector de la presente invención puede retener un tipo de ácido nucleico de la presente invención, o puede retener dos o más tipos de ácidos nucleicos de la presente invención. Además, con respecto a los diversos tipos de ácidos nucleicos de la presente invención que serán retenidos por el vector de la presente invención, se puede retener independientemente un ácido nucleico (una copia) de cada tipo, o se pueden retener de forma independiente dos o más ácidos nucleicos (dos copias) de cada tipo.
El "vector", como se usa en la presente memoria, significa una molécula de ácido nucleico usada para la amplificación del ácido nucleico de la presente invención y/o la expresión del polipéptido codificado por el ácido nucleico de la presente invención. Según la presente invención, el vector no está particularmente limitado con tal de que el vector permita la amplificación del ácido nucleico de la presente invención o el vector, o la expresión del polipéptido que está codificado por el ácido nucleico de la presente invención en una célula en donde se introduce este vector. Los ejemplos de dicho vector incluyen un fago, un plásmido y un virus.
El vector se puede seleccionar apropiadamente según diversas condiciones, tales como el tipo de célula en donde se introduce este vector y la cantidad deseada de expresión del polipéptido codificado por el ácido nucleico de la presente invención. Por ejemplo, en el caso en el que se utiliza como célula una célula procariota tal como una célula bacteriana, se puede utilizar adecuadamente un fago o un plásmido como vector. Además, en el caso en el que se utiliza como célula una célula eucariota tal como una célula de insecto o una célula de mamífero, se puede utilizar adecuadamente un plásmido o un virus como vector.
Los ejemplos del plásmido que se puede utilizar en las células de mamíferos incluyen pCA7 (Takeda, M., Ohno, S., Seki, F., Nakatsu, Y., Tahara, M., Yanagi, Y. (2005) J. Virol. 79, 14346-54) y pCI-neo (fabricado por Promega Corporation). Los ejemplos del plásmido que se puede utilizar en las células de insecto incluyen pIZ-V5 (fabricado por Life Technologies Corp.). Los ejemplos del plásmido que se puede utilizar en las células bacterianas incluyen pBlue Script II SK(+) (fabricado por Agilent Technologies, Inc.) y pET (fabricado por Takara Bio, Inc.).
Los ejemplos de virus que pueden utilizarse en las células de mamíferos incluyen los virus animales. Los ejemplos de virus animales incluyen el virus Sendai. Los ejemplos de virus que pueden utilizarse en células de insectos incluyen los baculovirus. Los ejemplos de baculovirus incluyen el virus de la poliedrosis nuclear (NPV).
Los ejemplos de fagos que pueden utilizarse en las células bacterianas incluyen los bacteriófagos. Los ejemplos de bacteriófagos incluyen el fago Lambda (fago A) y el fago T4.
El vector de la presente invención se puede obtener, por ejemplo, introduciendo el ácido nucleico de la presente invención en un vector. La introducción del ácido nucleico de la presente invención en un vector se puede llevar a cabo mediante un método convencional.
Un ejemplo de un método para introducir el ácido nucleico de la presente invención en un vector puede ser un método de utilización de un sitio de clonación múltiple transportado por el vector. El vector de la presente invención se puede obtener, por ejemplo, seleccionando dos sitios de enzimas de restricción cualesquiera de los sitios de enzimas de restricción existentes en un sitio de clonación múltiple portado por el vector, y sometiendo al vector y al ácido nucleico de la presente invención a una digestión limitada mediante el uso de estas enzimas de restricción y luego a ligadura. Con respecto al ácido nucleico de la presente invención para esta solicitud de uso, por ejemplo, se puede utilizar un ADN obtenible mediante una reacción de PCR que usa oligonucleótidos que tienen un sitio para una enzima de restricción añadido en el lado 5'-terminal como cebadores, y que usa el ácido nucleico de la presente la invención como molde. Además, por ejemplo, el vector de la presente invención también se puede obtener realizando la introducción de una mutación tal que el residuo de aminoácido de la posición 193 de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido del factor B del cangrejo de herradura se cambia por un residuo de cisteína (Cys), mediante una reacción de PCR inversa mediante el uso, como molde, de un vector en el que se ha insertado un ADN que codifica el polipéptido del factor B del cangrejo de herradura. Específicamente, un ejemplo del método para producir el vector de la presente invención es el método descrito en el <Ejemplo 1> o el <Ejemplo 4> que se describirán más adelante.
<4> Célula de la presente invención
La célula de la presente invención es una célula que retiene el ácido nucleico de la presente invención y/o el vector de la presente invención (en lo sucesivo, denominados colectivamente "vector o similar de la presente invención"). Dado que el vector de la presente invención es un vector que tiene el ácido nucleico de la presente invención, la célula que retiene el vector de la presente invención también corresponde a una célula que retiene el ácido nucleico de la presente invención.
La célula de la presente invención se puede obtener, por ejemplo, introduciendo el vector o similar de la presente invención en una célula. Por lo tanto, la célula de la presente invención se puede obtener, por ejemplo, transformando (transduciendo) una célula mediante el uso del vector o similar de la presente invención. La célula según la presente invención no está particularmente limitada, con tal de que la célula sea capaz de tener el vector o similar de la presente invención introducido en ella, o capaz de transformarse mediante el uso de este. Es preferible que la célula según la presente invención sea una célula aislada.
El tipo o número del vector o similar de la presente invención retenido por la célula de la presente invención no está particularmente limitado. La célula de la presente invención puede retener un tipo de vector o similar de la presente invención, o la célula puede retener dos o más tipos de vectores o similares de la presente invención. Además, con respecto a los diversos tipos de vectores de la presente invención que serán retenidos por la célula de la presente invención, se puede retener independientemente un vector (una copia) de cada tipo, o se pueden retener de forma independiente dos o más vectores (dos copias) de cada tipo.
La célula de la presente invención puede retener el vector o similar de la presente invención de manera intracromosómica, puede retener el vector o similar de la presente invención de manera extracromosómica, o puede retener el vector o similar de la presente invención tanto de manera intracromosómica como extracromosómica. Específicamente, la célula de la presente invención puede ser una célula que tiene el vector o similar de la presente invención introducido en ella, o una célula transformada mediante el uso de este.
Con respecto a la célula de la presente invención, la "célula" es, por ejemplo, una célula huésped. La "célula huésped", como se usa en la presente memoria, significa una célula usada como huésped para amplificar el vector o similar de la presente invención, y/o como huésped para expresar el polipéptido de la presente invención codificado por el vector o similar de la presente invención.
La célula según la presente invención se puede seleccionar según sea apropiado de acuerdo con el propósito de uso del vector o similar de la presente invención.
Por ejemplo, en un caso en el que se pretende la amplificación del vector o similar de la presente invención, la célula es preferiblemente una célula procariótica y, específicamente, la célula es preferiblemente una célula bacteriana. Sobre todo, es preferible que la célula sea una célula deEscherichia coli.Los ejemplos deEscherichia coliincluyen la cepa JM109 y la cepa DH5a.
Además, por ejemplo, en un caso en el que se pretende la expresión del polipéptido codificado por el vector o similar de la presente invención, por ejemplo, se puede utilizar como célula una que se usa habitualmente para expresar un polipéptido que la célula no posee inherentemente. Tal célula es, por ejemplo, preferentemente una célula eucariota, y es preferible que la célula sea específicamente una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula vegetal o una célula de levadura. La célula eucariota es preferentemente una célula de mamífero o una célula de insecto, y más preferentemente una célula de mamífero.
Es preferible que la célula de mamífero sea una célula de un primate o una célula de un roedor. Los ejemplos de primates incluyen al ser humano, el mono y el chimpancé. Un ejemplo de célula de primate es una célula humana. Un ejemplo específico de célula humana es una cepa celular derivada de células de riñón embrionario humano (célula HEK). Un ejemplo de célula HEK es una célula HEK293. Un ejemplo de célula HEK293 es una célula HEK293s . Un ejemplo de célula HEK293S es una célula HEK293S GnTI-. Además, los ejemplos de roedores incluyen un hámster, ratón, rata y cobaya. Un ejemplo de célula de roedor es la célula de hámster. Un ejemplo de célula de hámster es la célula de hámster chino. Un ejemplo de célula de hámster chino es una célula CHO. Los ejemplos de células CHO incluyen las células CHO DG44, las células CHO-K1 y las células CHO-S.
La introducción de un ácido nucleico en una célula se puede realizar mediante un método convencional. El método para introducir un ácido nucleico en una célula en la presente invención no está particularmente limitado, con tal de que sea un método capaz de introducir el vector o similar de la presente invención en una célula. Los ejemplos específicos del método para introducir un ácido nucleico en una célula incluyen un método de fosfato cálcico, un método de lipofección, un método de DEAE dextrano, un método de electroporación y un método de microinyección. La transformación de la célula se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante el método descrito en el <Ejemplo 1> o el <Ejemplo 4> que se describirán más adelante.
<5> Método de producción de la presente invención
El método de producción de la presente invención es un método para producir el polipéptido de la presente invención mediante el uso de la célula de la presente invención. El método de producción de la presente invención es específicamente un método para producir un polipéptido, y el método incluye una etapa para producir el polipéptido de la presente invención mediante el uso de la célula de la presente invención (en lo sucesivo, denominada "etapa de producción"). La etapa de producción es, por ejemplo, una etapa de expresión del polipéptido de la presente invención mediante el cultivo de la célula de la presente invención.
Las condiciones para cultivar la célula de la presente invención en el método de producción de la presente invención (en lo sucesivo, simplemente denominadas "condiciones de cultivo") no están particularmente limitadas, con tal de que las condiciones sean condiciones capaces de expresar el polipéptido de la presente invención en una célula. Las condiciones de cultivo se pueden seleccionar según sea apropiado según diversas condiciones, tales como el tipo de célula y la cantidad deseada de expresión del polipéptido de la presente invención codificado por el vector o similar de la presente invención. El cultivo de las células se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante el uso de un medio que se utiliza habitualmente para el cultivo de la célula relevante. En cuanto a las condiciones de cultivo, específicamente, se pueden mencionar como ejemplo las condiciones descritas en el <Ejemplo 1> o en el <Ejemplo 4> que se describirán más adelante.
El método de producción de la presente invención puede incluir además otra etapa, con tal de que el método incluya la etapa de producción. La "otra etapa", como se usa en la presente memoria, es, por ejemplo, una etapa de recogida del polipéptido de la presente invención producido en la etapa de producción (en lo sucesivo, denominada "etapa de recogida"). La "etapa de recogida", como se usa en la presente memoria, es una etapa para obtener una fracción que incluye el polipéptido de la presente invención a partir del líquido de cultivo de la célula.
Por ejemplo, en un caso en el que el polipéptido de la presente invención se expresa en una forma secretada extracelularmente, la etapa de recogida puede ser una etapa de recogida del líquido de cultivo en sí, del sobrenadante obtenido después de la centrifugación, o de una fracción que se puede obtener después de la purificación de estos sometiéndolos a una columna o similar, como el polipéptido de la presente invención.
Además, por ejemplo, en un caso en el que el polipéptido de la presente invención se expresa en una forma acumulada en la célula, la etapa de recogida puede ser una etapa de recogida de la propia célula, un producto triturado (restos celulares) que se puede obtener triturando la célula o un extracto, o una fracción obtenible después de la purificación de estos sometiéndolos a una columna o similar, como el polipéptido de la presente invención.
El término "trituración" en la descripción anterior se puede llevar a cabo mediante un método seleccionado según sea apropiado según el tipo de célula. Los ejemplos del método de trituración incluyen un método de homogeneización, un método de tratamiento ultrasónico, un método de congelación y descongelación y un método de adición de un tensioactivo. Estas técnicas utilizadas para la trituración se pueden utilizar en combinación según sea apropiado.
El término "purificación" en la descripción anterior se puede llevar a cabo mediante una técnica que se utiliza habitualmente para la purificación de polipéptidos. Los ejemplos de dicho método incluyen la precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de penetración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía con hidroxiapatita y cromatografía de afinidad. Estas técnicas se pueden utilizar en combinación según sea apropiado.
Si el polipéptido de la presente invención está incluido en la fracción así recogida se puede determinar, por ejemplo, midiendo la presencia o ausencia de un polipéptido que tiene la función del factor B del cangrejo de herradura según el método descrito en la sección "<1> Polipéptido de la presente invención". Además, si el polipéptido de la presente invención está incluido en la fracción así recogida se puede determinar, por ejemplo, mediante un método que utiliza un anticuerpo que se une al polipéptido de la presente invención.
<6> Método de medición de la presente invención
El método de medición de la presente invención es un método para realizar la medición de una endotoxina mediante el uso del polipéptido de la presente invención. Según la presente invención, el término medición se utiliza como nombre colectivo para la detección y determinación cuantitativa. Por lo tanto, el método de medición de la presente invención también puede ser, por ejemplo, un método para detectar una endotoxina o un método para determinar cuantitativamente una endotoxina.
El método de medición de la presente invención es, por ejemplo, un método para medir una endotoxina, y el método incluye las siguientes etapas (1) y (2):
(1) una etapa de mezclar el polipéptido de la presente invención con el factor C del cangrejo de herradura y una muestra de prueba; y
(2) una etapa de medir la actividad de proteasa del polipéptido.
La etapa del punto (1) es una etapa de mezclar el polipéptido de la presente invención con el factor C del cangrejo de herradura y una muestra de prueba. En un caso en el que la muestra de prueba es una muestra que contiene una endotoxina, se produce una reacción en cascada, en donde el factor C que ha entrado en contacto con la endotoxina cambia al factor C activado y posteriormente el factor B cambia al factor B activado.
En la etapa del punto (1) se puede incluir además una operación para mezclar otra sustancia, con tal de que la etapa incluya la operación de mezclar el polipéptido de la presente invención con el factor C y una muestra de prueba. Los ejemplos de "otra sustancia", tal como se usa en la presente memoria, incluyen una enzima procoagulante, un agente tamponador, una sal de metal alcalino, una sal de metal alcalinotérreo, un tensioactivo y un sustrato para la detección. En un caso en el que la etapa del punto (1) es una etapa de mezclar el polipéptido de la presente invención con el factor C, una enzima procoagulante y una muestra de prueba, y la muestra de prueba es una muestra que contiene una endotoxina, tiene lugar una reacción en cascada, en donde el factor C que ha entrado en contacto con la endotoxina cambia al factor C activado, el factor B cambia al factor B activado y la enzima procoagulante cambia a una enzima coagulante.
El "factor C" usado para la presente invención no está particularmente limitado, con tal de que sea el factor C que tiene la función del factor C del cangrejo de herradura. La definición del "cangrejo de herradura", tal como se usa en la presente memoria, es como se describió en la sección "<1> Polipéptido de la presente invención". La "función del factor C del cangrejo de herradura" significa la función como precursor de proteasa que posee el factor C del cangrejo de herradura. La "función del factor C del cangrejo de herradura" significa específicamente la función de cambiar a una forma activada (factor C activado) en copresencia de una endotoxina y que exhibe una actividad de proteasa. La función del factor C del cangrejo de herradura es, por ejemplo, la función de cambiar a una forma activada (factor C activado) en copresencia de una endotoxina, escindiendo el factor B y, por lo tanto, cambiando el factor B a una forma activada (factor B activado).
La "enzima procoagulante" según la presente invención no está particularmente limitada, con tal de que sea una enzima procoagulante que tenga la función de una enzima procoagulante del cangrejo de herradura. La definición del uso del "cangrejo de herradura" en la presente memoria es la descrita en la sección "<1> Polipéptido de la presente invención". La "función de una enzima procoagulante del cangrejo de herradura" significa la función como precursor de proteasa que posee una enzima procoagulante del cangrejo de herradura. La "función de una enzima procoagulante del cangrejo de herradura" significa específicamente la función de cambiar a una forma activada (enzima coagulante) en copresencia del factor B activado y que muestra una actividad de proteasa. La función de una enzima procoagulante del cangrejo de herradura es, por ejemplo, la función de cambiar a una forma activada (enzima coagulante) en copresencia del factor B activado, escindiendo el coagulógeno y formando así un gel de coagulina. Además, la función de una enzima procoagulante del cangrejo de herradura es, por ejemplo, la función de cambiar a una forma activada (enzima coagulante) en copresencia del factor B activado, escindiendo un sustrato para la detección, que sirve como sustrato para una enzima coagulante y liberando así una sustancia marcadora.
El factor C y la enzima procoagulante según la presente invención pueden ser cada uno independientemente un factor de Limulus natural obtenible a partir del cangrejo de herradura, pueden ser un factor de Limulus recombinante producido según una técnica de ingeniería genética, o pueden ser una mezcla que incluya un factor de Limulus natural y un factor de Limulus recombinante en cualquier proporción arbitraria.
El factor de Limulus de origen natural puede ser un factor de Limulus obtenido mediante el uso de hemocitos de cangrejo de herradura como materia prima, purificando según sea apropiado un lisado obtenido mediante un método convencional y separando preparativamente el factor de Limulus. La separación preparativa de un factor de Limulus se puede llevar a cabo, por ejemplo, haciendo referencia a un método descrito en la bibliografía (Nakamura, T., Horiuchi, T., Morita T. e Iwanaga, S. (1986) J. Biochem. 99, 847-57).
Se puede obtener un factor de Limulus recombinante introduciendo un ácido nucleico que codifica un polipéptido de un factor de Limulus en una célula y produciendo el factor de Limulus en la célula. La secuencia de bases de un ácido nucleico que codifica un factor de Limulus se puede obtener de una base de datos conocida, como el NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
La producción de un factor de Limulus mediante el uso de una célula se puede llevar a cabo mediante el uso de una técnica conocida. Con respecto a la producción de un factor de Limulus mediante el uso de una célula, se puede mencionar como ejemplo un método de uso de una célula de mamífero como se describe en el <Ejemplo 1> o el <Ejemplo 4> que se describirán más adelante. Además, la producción de un factor de Limulus mediante el uso de una célula también se puede llevar a cabo, por ejemplo, haciendo referencia a un método descrito en la bibliografía (documentos WO 2012/118226 o WO 2014/092079). Además, la producción de un factor de Limulus mediante el uso de una célula también se puede llevar a cabo, por ejemplo, aplicando el método descrito en la sección "<5> Método de producción de la presente invención" haciendo los cambios necesarios.
Se pueden presentar realizaciones específicas del factor C y la enzima procoagulante según la presente invención aplicando la descripción de la sección "<1> Polipéptido de la presente invención" haciendo los cambios necesarios. Por ejemplo, es preferible que el factor de Limulus según la presente invención sea recombinante. Además, por ejemplo, la célula utilizada para la producción del factor de Limulus según la presente invención es preferentemente una célula de mamífero o una célula de insecto, y más preferentemente una célula de mamífero.
Con respecto al factor C según la presente invención, específicamente, se puede mencionar como ejemplo un polipéptido representado por cualquiera de los siguientes puntos (1) a (5).
(1) Un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 12;
(2) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 14;
(3) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 16;
(4) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye la sustitución, deleción, inserción y/o adición de un residuo de aminoácido o una pluralidad de residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de los puntos (1) a (3), y el polipéptido tiene la función del factor C del cangrejo de herradura; y
(5) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de fusión en el que se añade una etiqueta peptídica al polipéptido representado por cualquiera de los puntos (1) a (4), y el polipéptido tiene la función del factor C del cangrejo de herradura.
Con respecto a la enzima procoagulante según la presente invención, específicamente, se puede mencionar como ejemplo un polipéptido representado por cualquiera de los siguientes puntos (6) a (9).
(6) Un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID N°: 18;
(7) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID N°: 20;
(8) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye la sustitución, deleción, inserción y/o adición de un residuo de aminoácido o una pluralidad de residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada por el punto (6) o (7), y el polipéptido tiene la función de una enzima procoagulante del cangrejo de herradura; y
(9) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de fusión en el que se añade una etiqueta peptídica al polipéptido representado por cualquiera de los puntos (6) a (8), y el polipéptido tiene la función de una enzima procoagulante del cangrejo de herradura.
La secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID N°: 12 para el punto (1) es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido del factor C deTachypleus tridentatus.
La secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID N°: 14 para el punto (2) es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido del factor C deLimulus polyphemus.
La secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID N°: 16 para el punto (3) es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido del factor C deCarcinoscopius rotundidicauda.
La secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID N°: 18 para el punto (6) es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la enzima procoagulante deTachypleus tridentatus.
La secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID N°: 20 para el punto (7) es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la enzima procoagulante deLimulus polyphemus.
Las realizaciones las expresiones "una pluralidad" y "sustitución, deleción, inserción y/o adición", tal como se usan para los puntos (4) y (8), son las mismas que las realizaciones de la sección "<1> Polipéptido de la presente invención".
El polipéptido representado por el punto (4) puede ser, por ejemplo, un polipéptido que tiene una similitud de preferiblemente un 90% o más, más preferiblemente un 95% o más, incluso más preferiblemente un 98% o más, y particularmente preferiblemente un 99% o más, con respecto a la secuencia de aminoácidos completa representada por uno cualquiera de los puntos (1) a (3), y el polipéptido tiene la función del factor C del cangrejo de herradura. Además, el polipéptido representado por el punto (8) puede ser, por ejemplo, un polipéptido que tiene una similitud de preferiblemente un 90% o más, más preferiblemente un 95% o más, incluso más preferiblemente un 98% o más, y particularmente preferiblemente un 99% o más, con respecto a la secuencia de aminoácidos completa representada por el punto (6) o (7), y el polipéptido tiene la función de una enzima procoagulante del cangrejo de herradura. Además, la "similitud", tal como se usa para estos, es un concepto que incluye el término "identidad" y, por lo tanto, el término similitud puede reemplazarse por el término identidad y aplicarse a las realizaciones adecuadas del polipéptido.
Las realizaciones de la "etiqueta peptídica" para los puntos (4) y (8) son las mismas que las realizaciones de la sección "<1> Polipéptido de la presente invención".
El "sustrato para la detección" según la presente invención es un sustrato utilizado para medir la presencia o ausencia de un factor de Limulus activado, la cantidad del factor de Limulus activado o el progreso de la reacción en cascada. El sustrato para la detección puede ser un sustrato para medir el factor B activado, o puede ser un sustrato para medir una enzima coagulante. El sustrato para la detección no está particularmente limitado, con tal de que sea un sustrato que sirva como sustrato para un factor de Limulus activado. El sustrato para la detección puede ser, por ejemplo, una proteína, un péptido o un derivado de cualquiera de estos.
La proteína puede ser una proteína de origen natural o puede ser una proteína recombinante. Un ejemplo de proteína es el coagulógeno, que es un sustrato para una enzima coagulante. Por ejemplo, se puede producir el coagulógeno natural separando preparativamente la sustancia de un lisado. Además, por ejemplo, se puede producir un coagulógeno recombinante haciendo referencia a un método descrito en la bibliografía (Miyata, et al., Tanpakushitsu Kakusan Koso Bessatsu (Proteins, Nucleic acids, and Enzymes: Extra Issue) n.° 29; páginas 30-43; 1986).
El péptido puede ser, por ejemplo, un sustrato sintético que se sintetiza químicamente. El sustrato sintético no está particularmente limitado, con tal de que sea un sustrato adecuado para medir la presencia o ausencia de un factor de Limulus activado, la cantidad del factor de Limulus activado o el progreso de la reacción en cascada. El sustrato sintético es preferentemente un derivado de un péptido.
Un ejemplo del sustrato sintético es un sustrato representado por la fórmula general: Y-X-Z (en donde Y puede existir o no; en el caso en el que Y existe, Y representa un grupo protector; X representa un péptido; y Z representa una sustancia marcadora). Es deseable que dicho sustrato sintético tenga la propiedad de que el enlace covalente entre X y Z sea escindido por un factor de Limulus activado y se libere una sustancia marcadora Z. Con respecto a la fórmula general descrita anteriormente, es preferible que el grupo protector (Y) sea un grupo protector para un grupo amino en el extremo N-terminal de un péptido. Con respecto a la fórmula general, es preferible que el enlace entre Y y X sea un enlace amida formado entre un grupo carboxilo del grupo protector y un grupo a-amino del extremo N-terminal de un péptido. Además, con respecto a la fórmula general, es preferible que el enlace entre X y Z sea un enlace amida formado entre un grupo carboxilo del extremo C-terminal de un péptido y un grupo amino de la sustancia marcadora Z.
El grupo protector (Y) no está particularmente limitado, y puede usarse cualquier grupo protector conocido que sea aplicable a la protección de un péptido. Los ejemplos del grupo protector (Y) incluyen un grupo terc-butoxicarbonilo (Boc), un grupo benciloxicarbonilo (Cbz), un grupo bencilo (Bzl), un grupo benzoílo (Bz) y un grupo acetilo (Ac).
El péptido (X) no está particularmente limitado, con tal de que sea un péptido que tenga una secuencia de aminoácidos que sirva como sustrato para un factor de Limulus activado. Es preferible que el péptido sea un sustrato adecuado para la medición de una serina proteasa, y es preferible que el péptido sea un péptido que tenga un resto de Arg (R) en el extremo C-terminal.
En un caso en el que el factor de Limulus es el factor B, es preferible que el péptido sea un péptido que tenga una secuencia de aminoácidos representada por la fórmula general: X-Thr-Arg (en donde X representa cualquier aminoácido arbitrario). Específicamente, en un caso en el que el factor de Limulus es el factor B, es preferible que el péptido sea un péptido que tenga una secuencia de aminoácidos representada por Leu-Thr-Arg (LTR) o Met-Thr-Arg (MTR).
En un caso en el que el factor de Limulus es una enzima procoagulante, es preferible que el péptido sea un péptido que tenga una secuencia de aminoácidos representada por la fórmula general: X-Gly-Arg (en donde X representa cualquier aminoácido arbitrario). Específicamente, en un caso en el que el factor de Limulus es una enzima procoagulante, es preferible que el péptido sea un péptido que tenga una secuencia de aminoácidos representada por Leu-Gly-Arg (LGR) o Glu-Gly-Arg (EGR).
La sustancia marcadora (Z) no está particularmente limitada, y se puede utilizar cualquier sustancia marcadora conocida que pueda aplicarse a la medición de la actividad de proteasas. Con respecto a la sustancia marcadora, se puede usar, por ejemplo, una sustancia marcadora que, cuando se libera de un péptido, se vuelve detectable mediante el desarrollo de color o fluorescencia. Los ejemplos de dicha sustancia marcadora incluyen paranitroanilina (pNA), ácido 7-metoxicumarin-4-acético (MCA) y 2,4-dinitroanilina (DNP). Además, con respecto a la sustancia marcadora, se puede usar, por ejemplo, una sustancia marcadora que, cuando se libera de un péptido, se vuelve detectable según un método de medición electroquímico (voltametría, amperometría o similares). Los ejemplos de dicha sustancia marcadora incluyen p-aminofenol (pAP), p-metoxianilina (pMA), N-metil-p-fenilendiamina (MPDD) y N,N'-dimetil-pfenilendiamina (Dm PD).
En la etapa de (1) en el método de medición de la presente invención como se describió anteriormente, el polipéptido de la presente invención, un factor de Limulus, una muestra de prueba, un sustrato para la detección y otras sustancias (un agente tamponador y similares) pueden añadirse en un orden arbitrario y mezclarse. Por ejemplo, en la etapa de (1), la muestra de prueba puede añadirse a una mezcla del polipéptido de la presente invención, un factor de Limulus, un sustrato para la detección y otras sustancias, y mezclarse con la mezcla. Además, por ejemplo, en la etapa de (1), la muestra de prueba puede tener una mezcla del polipéptido de la presente invención, un factor de Limulus, un sustrato para la detección y otras sustancias añadidas y mezcladas. En la etapa de (1), la mezcla se puede llevar a cabo, por ejemplo, en el interior (en un recipiente) de un recipiente que tiene una abertura en un extremo (un tubo de ensayo, un vial o similar). La muestra de prueba no está particularmente limitada, y los ejemplos incluyen agua para inyección, un producto farmacéutico, un líquido de infusión, una preparación de sangre, un instrumento médico (herramienta médica), un cuasi-fármaco, un cosmético, así como un producto alimenticio, una bebida, una muestra ambiental recogida del aire, un río, suelo o similar; una proteína natural, una proteína recombinante, un ácido nucleico, una enzima, un carbohidrato, un electrolito; y un componente biológico tal como sangre, un fluido corporal o un tejido.
La etapa de (2) es una etapa para medir la actividad de proteasa del polipéptido de la presente invención. Esta etapa es, por ejemplo, una etapa para medir una sustancia marcadora liberada de un sustrato para su detección. En esta etapa, dado que una sustancia marcadora en una cantidad (número molar) que corresponde a la actividad de proteasa (actividad total) del polipéptido de la presente invención se libera de un sustrato para la detección, la actividad de proteasa del polipéptido de la presente invención puede medirse midiendo una sustancia marcadora liberada del sustrato para su detección. Una sustancia marcadora liberada del sustrato para su detección se puede medir mediante el uso, por ejemplo, de un instrumento óptico tal como un espectrofotómetro o un fluorofotómetro. Además, una sustancia marcadora liberada de un sustrato para su detección se puede medir mediante el uso, por ejemplo, de un instrumento de medición electroquímico tal como un voltímetro o un amperómetro. Por ejemplo, la presencia o ausencia de una endotoxina en una muestra de prueba se puede determinar comparando el valor medido mostrado en esa etapa con un valor de un blanco (valor medido obtenido en un caso en el que se usa una muestra de prueba sin endotoxina como objeto de la medición).
El método de medición de la presente invención puede incluir además otra etapa además de las etapas de (1) y (2). El método de medición de la presente invención puede incluir, por ejemplo, una etapa para determinar la presencia o ausencia de una endotoxina en una muestra de prueba comparando la medición obtenible en la etapa de (2) con un valor de un blanco. Además, el método de medición de la presente invención también puede incluir, por ejemplo, una etapa para determinar la presencia o ausencia de una endotoxina en una muestra de prueba determinando la presencia o ausencia de gelificación de un líquido mixto. Además, el método de medición de la presente invención puede incluir, por ejemplo, una etapa para convertir el valor medido que se puede obtener en la etapa de (2) en otro valor. Con respecto a la etapa de convertir un valor medido en otro valor, por ejemplo, se puede mencionar como ejemplo una etapa para calcular la cantidad de una endotoxina basándose en el valor medido. Tal etapa es específicamente, por ejemplo, una etapa para convertir el valor medido que se puede obtener cuando se mide una muestra de prueba, en la cantidad de una endotoxina basándose en la relación (curva patrón) entre el valor medido que se puede obtener cuando se sustituye una muestra de prueba con una sustancia patrón a una concentración conocida, y la concentración de la sustancia patrón.
Con respecto al método de medición de la presente invención, es preferible que la reacción de Limulus se lleve a cabo en agua o en un disolvente acuoso tal como una disolución tampón.
<7> Reactivo de la presente invención
El reactivo de la presente invención es un reactivo para la medición de endotoxinas, que incluye el polipéptido de la presente invención como componente constituyente. El reactivo de la presente invención se puede utilizar adecuadamente para llevar a cabo el método de medición de la presente invención.
El reactivo de la presente invención puede incluir además otro componente constituyente, con tal de que el reactivo incluya el polipéptido de la presente invención como componente constituyente. Con respecto al otro componente constituyente como se usa en la presente memoria, por ejemplo, se puede mencionar el factor C del cangrejo de herradura, una enzima procoagulante del cangrejo de herradura, un sustrato para la detección, un agente tamponador, una sal de metal alcalino, una sal de metal alcalinotérreo y un tensioactivo.
Es preferible que el reactivo de la presente invención incluya el factor C del cangrejo de herradura como componente constituyente además del polipéptido de la presente invención, y es más preferible que el reactivo de la presente invención incluya además una enzima procoagulante del cangrejo de herradura como componente constituyente. Además, es preferible que el reactivo de la presente invención se suministre como un producto liofilizado.
<8> Kit de la presente invención
El kit de la presente invención es un kit para la medición de endotoxinas, que incluye el polipéptido de la presente invención o el reactivo de la presente invención como parte componente. El kit de la presente invención se puede utilizar adecuadamente para llevar a cabo el método de medición de la presente invención.
Con tal de que el kit de la presente invención incluya el polipéptido de la presente invención o el reactivo de la presente invención como componente, el kit de la presente invención puede incluir además otro componente. Los ejemplos del otro componente tal como se usa en la presente memoria incluyen el factor C del cangrejo de herradura, una enzima procoagulante del cangrejo de herradura, un sustrato para la detección, una disolución tampón, agua destilada, un producto patrón de endotoxina, una microplaca y un documento adjunto con información del producto descrito en el mismo.
El kit de la presente invención puede incluir varios componentes individualmente por separado, o puede incluir varios componentes como una mezcla formada combinando arbitrariamente los componentes. El kit de la presente invención puede incluir, por ejemplo, varios factores de Limulus por separado, o como una realización que tiene los diversos factores de Limulus mezclados con antelación, o como una realización que tiene además un sustrato para la detección mezclado con antelación con los diversos factores de Limulus.
Ejemplos
En lo sucesivo en la presente memoria, se describirá específicamente una realización de la presente invención a través de los ejemplos; sin embargo, no se pretende que el alcance técnico de la presente invención se limite únicamente a estos ejemplos.
En los ejemplos de la presente invención, se pueden utilizar las siguientes abreviaturas.
(a) TFC: factor C deTachypleus tridentatus
(b) TFB: factor B deTachypleus tridentatus
(c) Murasame-TFB: variante del factor B deTachypleus tridentatus
(d) LFC: factor C deLimulus polyphemus
(e) LFB: factor B deLimulus polyphemus
(f) Murasame-LFB: variante del factor B deLimulus polyphemus
En los ejemplos de la presente invención, la producción de un vector de expresión, la producción de un factor de Limulus y la medición de la actividad de un factor de Limulus se pueden llevar a cabo haciendo referencia a los métodos descritos en la bibliografía (Kobayashi, Y., Takahashi, T., Shibata, T., Ikeda, S., Koshiba, T., Mizumura, H., Oda, T., Kawabata, S. (2015) J. Biol. Chem. 290, 19379-86).
En los ejemplos de la presente invención, a menos que se indique particularmente lo contrario, se llevó a cabo una reacción de PCR mediante el uso de una ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion (fabricada por New England Biolabs) y realizando la operación según el protocolo adjunto.
La purificación de un ADN a partir de un líquido de reacción de PCR en los ejemplos de la presente invención se llevó a cabo mediante el uso del gel Wizard SV y el sistema PCR Clean-Up (fabricados por Promega Corporation) y realizando la operación según el protocolo adjunto.
La separación preparativa de un ADN en los ejemplos de la presente invención se llevó a cabo sometiendo a una muestra que incluía un ADN a electroforesis en gel de agarosa, cortando un fragmento del ADN deseado con un bisturí, recogiendo el fragmento de ADN y luego realizando la operación mediante el uso del gel Wizard SV y el sistema PCR Clean-Up (fabricados por Promega Corporation) según el protocolo adjunto.
En los Ejemplos de la presente invención, a menos que se indique particularmente lo contrario, la reacción de ligadura se llevó a cabo mediante el uso de una ADN ligasa T4 (fabricada por New England Biolabs) y realizando la operación según el protocolo adjunto.
La amplificación y purificación de un vector en los ejemplos de la presente invención se llevaron a cabo cultivandoEscherichia colique se había transformado mediante el uso de un vector, y luego realizando las operaciones mediante el uso del sistema de purificación de ADN Wizard Plus SV Minipreps (fabricado por Promega Corporation) según el protocolo adjunto. Específicamente, la cepa deEscherichia coliDH5a que se había transformado mediante el uso de un vector se aplicó sobre una placa con medio de agar LB (LB/Amp) que contenía ampicilina, las células bacterianas se sometieron a cultivo estático durante la noche, las colonias individuales así obtenidas se inocularon en un medio LB que contenía ampicilina, las células bacterianas se sometieron a cultivo con agitación durante la noche a 37 °C para realizar la amplificación del vector, y el vector se purificó a partir de las células bacterianas deEscherichia colien el líquido de cultivo.
La desfosforilación de un ADN en los ejemplos de la presente invención se llevó a cabo mediante el uso de fosfatasa alcalina(E. coliC75) (fabricada por Takara Bio, Inc.) realizando la operación según el protocolo adjunto.
La medición de la concentración de proteína en los ejemplos de la presente invención se llevó a cabo mediante el uso del kit de ensayo de proteínas Micro BCA (fabricado por Thermo Fisher Scientific) realizando la operación según el protocolo adjunto. Además, la concentración molar de un factor de Limulus en los ejemplos de la presente invención se calculó dividiendo la concentración de proteína obtenible mediante la medición mencionada anteriormente por el peso molecular del factor de Limulus.
<Ejemplo de referencia 1> Producción de TFC
(1) Producción del vector de expresión de TFC.
Se produjo un vector de expresión para el factor C (TFC) deTachypleus tridentatussegún el siguiente procedimiento.
Se produjo un ADN que codificaba un TFC de longitud completa excluyendo la secuencia señal del extremo N-terminal (ADN que tenía una secuencia de bases representada por los números de base 76 a 3057 de SEQ ID N°: 11) mediante una reacción de PCR. Como molde para la reacción de PCR, se utilizó un vector producido insertando el ADN que codificaba el TFC en el vector pSecTag2A (fabricado por Invitrogen) (Koshiba, T., Hashii, T., Kawabata, S. (2007) J. Biol. Chem. 282, 3962-7). Como cebadores para la reacción de PCR, se usaron el cebador 1 (SEQ ID N°: 21) y el cebador inverso BGH (s Eq ID N°: 28).
El ADN obtenido mediante la reacción de PCR se purificó y el ADN se sometió a una digestión limitada mediante el uso de enzimas de restricción (Age I y Kpn I) y separación preparativa. El vector pHLsec (Aricescu, AR., Lu, W., Jones, EY. (2006) Acta Crystallogr. D Biol. Cristalogr. 62, 1243-50) se sometió a una digestión limitada mediante el uso de las enzimas de restricción y una separación preparativa de la misma manera que se describió anteriormente, y luego se llevó a cabo una reacción de ligadura entre el vector y el ADN mencionado anteriormente.
Se transformóEscherichia colimediante el uso del líquido de reacción de ligadura y luego se llevó a cabo la amplificación y purificación del vector. El vector se sometió a una digestión limitada mediante el uso de una enzima de restricción (EcoR I) y separación preparativa, y se obtuvo el fragmento de ADN 1 (ADN que tenía una secuencia de bases que codifica la secuencia de aminoácidos de una señal de secreción derivada del vector pHLsec, y una secuencia de bases representada por los números de base 76-2298 de SEQ ID N°: 11, y el ADN tenía los extremos cohesivos de EcoR I en el extremo 5'-terminal y en el extremo 3'-terminal). Además, el vector se sometió a una digestión limitada mediante el uso de enzimas de restricción (EcoR I y Xho I) y separación preparativa, y se obtuvo el fragmento de ADN 2 (ADN que tenía una secuencia de bases representada por los números de base 2299 a 2545 de SEQ ID N°: 11, y el ADN tenía el extremo cohesivo de EcoR I en el extremo 5'-terminal y el extremo cohesivo de Xho I en el extremo 3'-terminal) y el fragmento de ADN 3 (ADN que tenía una secuencia de bases representada por los números de base 2546 a 3057 de SEQ ID N°: 11 y una secuencia de bases que codificaba la secuencia de aminoácidos de una etiqueta His derivada del vector pHLsec, y el ADN tenía los extremos cohesivos de Xho I en el extremo 5'-terminal y en el extremo 3'-terminal).
El vector pCA7 (Takeda, M., Ohno, S., Seki, F., Nakatsu, Y., Tahara, M., Yanagi, Y. (2005) J. Virol. 79, 14346-54) se sometió a una digestión limitada mediante el uso de enzimas de restricción (EcoR I y Xho I) y separación preparativa, y luego se llevó a cabo una reacción de ligadura entre el vector y el fragmento de ADN 2.
Se transformóEscherichia colimediante el uso del líquido de reacción de ligadura mencionado anteriormente y luego se llevó a cabo la amplificación y purificación del vector. El vector se sometió a una digestión limitada mediante el uso de una enzima de restricción (Xho I), desfosforilación y separación preparativa, y luego se llevó a cabo una reacción de ligadura entre el vector y el fragmento de ADN 3.
Se transformóEscherichia colimediante el uso del líquido de reacción de ligadura mencionado anteriormente y luego se llevó a cabo la amplificación y purificación del vector. El vector se sometió a una digestión limitada mediante el uso de una enzima de restricción (EcoR I), desfosforilación y separación preparativa, y luego se llevó a cabo una reacción de ligadura entre el vector y el fragmento de ADN 1.
Se transformóEscherichia colimediante el uso del líquido de reacción de ligadura mencionado anteriormente y luego se llevó a cabo la amplificación y purificación del vector. De esta manera, se obtuvo un vector que codificaba un TFC que tenía una etiqueta His en el extremo C-terminal.
Se llevó a cabo una reacción de PCR mediante el uso del vector mencionado anteriormente como molde y mediante el uso del Cebador 8 (SEQ ID N°: 29) y el Cebador 2 (SEQ ID N°: 22), y se purificó el ADN así amplificado. El ADN se sometió a una digestión limitada mediante el uso de una enzima de restricción (EcoR I) y separación preparativa, y se obtuvo el fragmento de ADN 1. Además, el ADN se sometió a una digestión limitada mediante el uso de enzimas de restricción (EcoR I y Xho I) y separación preparativa, y se obtuvieron el fragmento de ADN 2 y el fragmento de ADN 4 (ADN que tenía una secuencia de bases representada por los números de base 2546 a 3057 de SEQ ID N°: 11, y el ADN tenía los extremos cohesivos de Xho I en el extremo 5'-terminal y en el extremo 3'-terminal).
El vector pCA7 se sometió a una digestión limitada mediante el uso de enzimas de restricción (EcoR I y Xho I) y separación preparativa, y luego se llevó a cabo una reacción de ligadura entre el vector pCA7 y el fragmento de ADN 2.
Se transformóEscherichia colimediante el uso del líquido de reacción de ligadura mencionado anteriormente y luego se llevó a cabo la amplificación y purificación del vector. El vector se sometió a una digestión limitada mediante el uso de una enzima de restricción (Xho I), desfosforilación y separación preparativa, y luego se llevó a cabo una reacción de ligadura entre el vector y el fragmento de ADN 4.
Se transformóEscherichia colimediante el uso del líquido de reacción de ligadura mencionado anteriormente y luego se llevó a cabo la amplificación y purificación del vector. El vector se sometió a una digestión limitada mediante el uso de una enzima de restricción (EcoR I), desfosforilación y separación preparativa, y luego se llevó a cabo una reacción de ligadura entre el vector y el fragmento de ADN 1.
Se transformóEscherichia colimediante el uso del líquido de reacción de ligadura mencionado anteriormente y luego se llevó a cabo la amplificación y purificación del vector. De esta manera, se obtuvo un vector que codificaba un TFC que no tenía una etiqueta His en el extremo C-terminal.
El vector se sometió a una digestión limitada mediante el uso de una enzima de restricción (EcoR I), desfosforilación y separación preparativa, y se obtuvo el fragmento de ADN 5 (ADN que tenía una secuencia de bases representada por los números de base 2299 a 3057 de SEQ ID N°: 11 y la secuencia de bases del vector pCA7, y el ADN tenía los extremos cohesivos de EcoR I en el extremo 5'-terminal y en el extremo 3'-terminal).
Se llevó a cabo una reacción de PCR mediante el uso de un vector producido insertando un ADN que codificaba un TFC de longitud completa que incluía la secuencia señal del extremo N-terminal (ADN que tenía una secuencia de bases representada por los números de base 1 a 3057 de SEQ ID N°: 11) en el vector ppSC8 (fabricado por Protein Sciences Corporation), como molde, y mediante el uso del Cebador 3 (SeQ ID N°: 23) y el Cebador 2 (SEQ ID N°: 22), y así se purificó el ADN así amplificado. El ADN se sometió a una digestión limitada mediante el uso de una enzima de restricción (EcoR I) y separación preparativa, y se obtuvo el fragmento de ADN 6 (ADN que tenía una secuencia de bases representada por los números de base 1 a 2298 de SEQ ID N°: 11, y el ADN tenía los extremos cohesivos de EcoR I en el extremo 5'-terminal y en el extremo 3'-terminal). Posteriormente se llevó a cabo una reacción de ligadura entre el fragmento de ADN 6 y el fragmento de ADN 5.
Se transformóEscherichia colimediante el uso del líquido de reacción de ligadura mencionado anteriormente y luego se llevó a cabo la amplificación y purificación del vector. De esta manera, se obtuvo un vector que codificaba un TFC de longitud completa que incluye la secuencia señal del extremo N-terminal.
Se llevó a cabo una reacción de PCR inversa mediante el uso del vector mencionado anteriormente como molde y cebadores fosforilados (cebador 4 (SEQ ID N°: 24) y cebador 5 (SEQ ID N°: 25)). La reacción de PCR inversa se llevó a cabo mediante el uso de una ADN polimerasa de alta fidelidad Q5 (fabricada por New England Biolabs) y realizando la operación según el protocolo adjunto. Se añadió una enzima de restricción (Dpn I) al líquido de reacción de PCR para degradar el molde y se llevó a cabo la separación preparativa del a Dn realizando una extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol. Posteriormente, se llevó a cabo una reacción de ligadura (autoligadura) mediante el uso del kit de ligadura de ADN Mighty Mix (fabricado por Takara Bio, Inc.) y realizando la operación según el protocolo adjunto.
Se transformóEscherichia colimediante el uso del líquido de reacción de ligadura mencionado anteriormente y se llevó a cabo la amplificación y purificación del vector. De esta manera, se obtuvo un vector que codificaba un TFC que tenía las etiquetas 6XHis y la secuencia de aminoácidos de la secuencia de escisión del factor Xa (IEGR) insertada en el mismo inmediatamente después de una secuencia señal.
Se llevó a cabo una reacción de PCR mediante el uso del vector mencionado anteriormente como molde y mediante el uso del cebador 6 (SEQ ID N°: 26) y el cebador 7 (SEQ ID N°: 27), y se purificó el ADN así amplificado. La reacción de PCR se llevó a cabo mediante el uso de una ADN polimerasa de alta fidelidad Q5 y realizando la operación según el protocolo adjunto. El ADN se sometió a una digestión limitada mediante el uso de enzimas de restricción (Age I y Nhe I) y separación preparativa, y se obtuvo el fragmento de ADN 7 (ADN que tenía una secuencia de bases que codifica la etiqueta 6xHis, una secuencia de bases que codifica IEGR y una secuencia de bases representada por los números de base 76 a 2236 de SEQ ID N°: 11, y el ADN tenía el extremo cohesivo de Age I en el extremo 5'-terminal y el extremo cohesivo de Nhe I en el extremo 3'-terminal).
El vector que codificaba un TFC que no tenía una etiqueta His en el extremo C-terminal se sometió a una digestión limitada mediante el uso de enzimas de restricción (Age I y Nhe I), desfosforilación y separación preparativa, y se obtuvo el fragmento de ADN 8 (ADN que tenía una secuencia de bases representada por los números de base 2237 a 3057 de SEQ ID N°: 11 y la secuencia de bases del vector pCA7, y el ADN tenía el extremo cohesivo de Nhe I en el extremo 5'-terminal y el extremo cohesivo de Age I en el extremo 3'-terminal). Posteriormente se llevó a cabo una reacción de ligadura entre el fragmento de ADN 8 y el fragmento de ADN 7.
Se transformóEscherichia colimediante el uso del líquido de reacción de ligadura mencionado anteriormente y luego se llevó a cabo la amplificación y purificación del vector. La secuencia de bases del vector se sometió a un análisis de secuencia y se confirmó que no hubo una introducción de mutaciones causada por un error de la PCR. De esta manera, se obtuvo un vector de expresión para un polipéptido que tiene la etiqueta 6XHis y la secuencia de escisión del factor Xa (IEGR) en el extremo N-terminal de una secuencia de TFC excluyendo la secuencia señal del extremo N-terminal (en lo sucesivo, denominado "TFC/pCA7").
(2) Producción de TFC
El factor C deTachypleus tridentatus(TFC) se produjo mediante un sistema de expresión en células de mamífero según el siguiente procedimiento. El cultivo celular se llevó a cabo en condiciones de 37 °C y 5% de CO2.
Se transformaron células HEK293S GnTL (ATCC: CRL-3022) mediante el uso del vector de expresión para TFC (TFC/pCA7) obtenido en la sección (1). Específicamente, a las células que habían alcanzado una confluencia del 80% al 90%, se les añadió un medio de transformación (medio DMEM que incluía TFC/pCA7 (1,8 pg/ml), polietilenimina (2,7 pg/ml), disolución de penicilina-estreptomicina-L-glutamina al 1% (fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) y suero bovino fetal al 2%) hasta una concentración de 0,22 ml/cm2 y se añadió benzamidina a las células hasta una concentración final de 2 mM. La mezcla se sometió a cultivo estático durante 120 horas. De esta manera, se obtuvo un líquido de cultivo que incluía TFC que había sido secretado por las células.
El líquido de cultivo se centrifugó a 6000*g durante 30 minutos y se recogió el sobrenadante. El sobrenadante y una disolución tampón (NaH2PO4-NaOH 0,5 M (pH 8,0), NaCl 1,5 M e imidazol 0,1 M) en una cantidad 0,1 veces mayor, y luego la mezcla se aplicó a una columna de níquel (columna de níquel-ácido nitrilotriacético-agarosa, diámetro interior: 1,0 cm x longitud: 5,0 cm). La columna se lavó con una disolución de lavado (NaH2PO4-NaOH 50 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM e imidazol 10 mM), y luego se eluyó el TFC mediante el uso de una disolución de elución (NaH2PO4-NaOH 50 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM e imidazol de 20 a 200 mM). La fracción eluida de TFC se comprobó mediante electroforesis en gel (SDS-PAGE).
Se recogió la fracción eluida de TFC y la disolución se reemplazó con una disolución de reacción (Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM y CaCh 10 mM) mediante ultrafiltración. Posteriormente, se añadió el factor Xa a la disolución hasta una concentración de 3,3 pg/ml y la mezcla se dejó reposar durante 16 horas a 37 °C. Así, la etiqueta de His se liberó del extremo N-terminal del TFC.
La disolución de reacción mencionada anteriormente se aplicó a una columna de sefarosa (columna de benzamidina-Sefarosa, diámetro interior: 0,25 cm x longitud: 1,5 cm), y el factor Xa se eliminó adsorbiendo el factor Xa en la columna. Posteriormente, se aplicó una fracción de flujo continuo (flujo continuo) de la columna a una columna de níquel (columna de níquel-ácido nitrilotriacético-agarosa, diámetro interior: 0,25 cm x longitud: 1,5 cm), y la etiqueta de His liberada del TFC se eliminó adsorbiendo la etiqueta de His en la columna. La fracción de flujo continuo de la columna se utilizó como TFC en el ensayo posterior.
<Ejemplo de referencia 2> Producción de TFB
(1) Producción del vector de expresión de TFB.
Se produjo un vector de expresión para el factor B deTachypleus tridentatus(TFB) mediante el siguiente procedimiento.
Se produjo un ADN que codificaba un TFB de longitud completa excluyendo la secuencia señal del extremo N-terminal (ADN que tenía una secuencia de bases representada por los números de base 70 a 1200 de SEQ ID N°: 1) mediante una reacción de PCR. Como molde para la reacción de PCR, se usó un vector producido insertando un ADN que codificaba el TFB en el vector pPSC8. Además, como cebadores para la reacción de PCR, se utilizaron el cebador 9 (SEQ ID N°: 30) y el cebador 10 (SEQ ID N°: 31).
El ADN obtenido mediante la reacción de PCR se purificó y el ADN se sometió a una digestión limitada mediante el uso de enzimas de restricción (Age I y Xho I) y se llevó a cabo una separación preparativa. El vector pCA7 se sometió a una digestión limitada mediante el uso de enzimas de restricción (Age I y Xho I) y separación preparativa, y luego se llevó a cabo una reacción de ligadura entre el vector pCA7 y el ADN mencionado anteriormente. Se transformóEscherichia colimediante el uso del líquido de reacción de ligadura mencionado anteriormente y luego se llevó a cabo la amplificación y purificación del vector. La secuencia de bases del vector se sometió a un análisis de secuencia y se confirmó que no hubo una introducción de mutaciones causada por un error de la PCR. De esta manera, se obtuvo un vector de expresión para TFB que excluye la secuencia señal del extremo N-terminal (TFB/pCA7).
(2) Producción de TFB
El factor B deTachypleus tridentatus(TFB) se produjo mediante un sistema de expresión en células de mamífero mediante el siguiente procedimiento. El cultivo celular se llevó a cabo en condiciones de 37 °C y 5% de CO2.
Se llevó a cabo la misma operación que la empleada en "(2) Producción de TFC" en el <Ejemplo de referencia 1>, excepto que se usó el vector de expresión para TFB obtenido en la sección (1) (TFB/pCA7) en lugar del vector de expresión de TFC (TFC/pCA7) y no se añadió benzamidina. De este modo, se obtuvo un líquido de cultivo que incluía el TFB que había sido secretado por las células.
El líquido de cultivo se centrifugó a 6000*g durante 30 minutos y se recogió el sobrenadante. Se añadió NaH2PO4-NaOH 50 mM (pH 6,8) al sobrenadante para diluir el sobrenadante cinco veces, y luego la dilución se aplicó a una columna SP (columna SP-Sefarosa, diámetro interior: 1,0 cm x longitud: 10 cm). La columna se lavó con NaH2PO4-NaOH 50 mM (pH 6,8), y luego se eluyó el TFB mediante el uso de una disolución de elución (NaH2PO4-NaOH 50 mM (pH 6,8) y NaCl de 50 a 500 mM). La fracción de elución del TFB se comprobó mediante electroforesis en gel (SDS-PAGE).
Se recogió la fracción eluida de TFB y la disolución se reemplazó con Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) mediante ultrafiltración. La disolución se aplicó a una columna de DEAE (columna DEAE-Sefarosa, diámetro interior: 1,0 cm x longitud: 1,0 cm), y luego se eluyó el TFB mediante el uso de una disolución de elución (Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) y NaCl 10 a 200 mM). La fracción eluida de TFB se comprobó mediante electroforesis en gel (SDS-PAGE). La fracción eluida de TFB se usó como TFB en la prueba posterior.
<Ejemplo 1> Producción de Murasame-TFB
Se produjo un vector de expresión para la variante del factor B deTachypleus tridentatus(Murasame-TFB) mediante el siguiente procedimiento.
(1) Producción del vector de expresión de Murasame-TFB
Se llevó a cabo una reacción de PCR inversa mediante el uso de TFB/pCA7 como molde y mediante el uso de cebadores fosforilados (Cebador 11 (SEQ ID N°: 32) y Cebador 12 (SEQ<i>D N°: 33)). La reacción de PCR inversa se llevó a cabo usando la ADN polimerasa Tks Gflex (fabricada por Takara Bio, Inc.) y realizando la operación según el protocolo adjunto. Se añadió una enzima de restricción (Dpn I) al líquido de reacción de PCR y se degradó el molde. La separación preparativa del ADN se llevó a cabo mediante extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol, y luego se llevó a cabo una reacción de ligadura (autoligadura) mediante el uso del kit de ligadura de ADN <Mighty Mix> y realizando la operación según el protocolo adjunto.
Se transformóEscherichia colimediante el uso del líquido de reacción de ligadura mencionado anteriormente y luego se llevó a cabo la amplificación y purificación del vector. La secuencia de bases del vector se sometió a un análisis de secuencia y se confirmó que no hubo una introducción de mutaciones causada por un error de la PCR. De esta manera, se obtuvo un vector de expresión para Murasame-TFB (Murasame-TFB/pCA7).
(2) Producción de Murasame-TFB
La variante del factor B deTachypleus tridentatus(Murasame-TFB) se produjo mediante un sistema de expresión en células de mamífero según el siguiente procedimiento. El cultivo celular se llevó a cabo en condiciones de 37 °C y 5% de CO2.
Se llevó a cabo la misma operación que la empleada en "(2) Producción de TFC" en la sección <Ejemplo de referencia 1>, excepto que se usó el vector de expresión para Murasame-TFB (Murasame-TFB/pCA7) obtenido en la sección (1) en lugar del vector de expresión para TFC (TFC/pCA7) y no se añadió benzamidina. De este modo, se obtuvo un líquido de cultivo que incluía Murasame-TFB que había sido secretado por las células.
Se llevó a cabo la misma operación que la empleada en "(2) Producción de TFB" en el <Ejemplo de referencia 2> y se obtuvo una fracción eluida que incluía Murasame-TFB. La fracción eluida de Murasame-TFB se usó como Murasame-TFB en la prueba posterior.
<Ejemplo de referencia 3> Medición de la actividad de proteasa (actividad específica) de TFB
Se produjo una disolución de TFC 160 nM, LPS 3,2 |jM (derivado deSalmonella minnesotaR595, peso molecular promedio en peso 1700 Da, fabricado por List Biological Laboratories, Inc.), Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) y NaCl 150 mM, y la disolución se dejó reposar a 37 °C durante 20 minutos. Así, se activó el TFC. En lo sucesivo, se hará referencia al TFC activado como "a-TFC".
Se produjeron 20 j l de una disolución que incluía TFB 50 nM, a-TFC 0,2 nM, Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM y 100 jg/m l de<b>S<a>y la disolución se dejó reposar durante una hora a 37 °C. A esta disolución se le añadieron 5 j l de Boc-Leu-Thr-Arg-MCA 2 mM (fabricado por Peptide Institute, Inc.) disueltos en DMF al 20%, y la mezcla se dejó reposar durante 5 minutos a 37 °C. Se añadió ácido acético 0,6 M (75 j l ) a la mezcla para completar la reacción enzimática y luego se midió la cantidad de MCA liberada del péptido (correctamente proporcional a la actividad de proteasa (actividad total) del TFB activado) con un detector de fluorescencia. La detección se llevó a cabo en condiciones de una longitud de onda de excitación de 380 nm y una longitud de onda de fluorescencia de 440 nm.
Como resultado, la actividad de proteasa (actividad específica) del TFB fue de 31,07 ± 2,50 unidades/pmol.
<Ejemplo 2> Medición de la actividad de proteasa (actividad específica) de Murasame-TFB
Se llevó a cabo la misma operación que la empleada en el <Ejemplo de referencia 3> mediante el uso de Murasame-TFB en lugar de TFB, y se midió la actividad de proteasa de Murasame-TFB.
Como resultado de la prueba, la actividad de proteasa (actividad específica) de Murasame-TFB fue de 416,87 ± 20,50 unidades/pmol.
Los resultados del <Ejemplo de referencia 3> y del <Ejemplo 2> se presentan en la FIG. 1. A partir de los resultados de la prueba descrita anteriormente, se descubrió que Murasame-TFB tiene una actividad de proteasa (actividad específica) que es 13,4 veces la actividad de proteasa de TFB.
<Ejemplo de referencia 4> Evaluación de la estabilidad térmica de TFB
Se produjeron 10 j l de una disolución de TFB 100 nM, Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM y 100 jg/m l de BSA, y la disolución se dejó reposar durante 2 minutos a una temperatura predeterminada (40 °C, 50 °C, 60 °C, 70 °C, 80 °C o 90 °C). Posteriormente, a esta disolución se le añadieron 10 j l de una disolución de a-TFC 0,4 nM, Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM y 100 jg/m l de BSA, y la mezcla se dejó reposar durante un hora a 37 °C. Posteriormente, se midió la actividad de proteasa de TFB realizando la misma operación que la empleada en el <Ejemplo de referencia 3>. Los resultados de la prueba descrita anteriormente se presentan en la Tabla 1.
Tabla 1
En la Tabla 1, la "actividad relativa" es un valor numérico (%) que expresa, en porcentaje, un valor obtenido dividiendo la actividad de proteasa (actividad específica) del TFB que se dejó reposar durante 2 minutos a cada una de las distintas temperaturas, por la actividad de proteasa (actividad específica) del TFB mostrada en el <Ejemplo de referencia 3>.
<Ejemplo 3> Evaluación de la estabilidad térmica de Murasame-TFB
La estabilidad térmica de Murasame-TFB se evaluó realizando la misma operación que la empleada en el <Ejemplo de referencia 4> mediante el uso de Murasame-TFB en lugar de TFB. Los resultados de la prueba se presentan en la Tabla 2.
Tabla 2
En la Tabla 2, la actividad relativa es un valor numérico (%) que expresa, en porcentaje, un valor obtenido dividiendo la actividad de proteasa (actividad específica) de Murasame-TFB que se dejó reposar durante 2 minutos a cada una de las distintas temperaturas, por la actividad de proteasa (actividad específica) de Murasame-TFB mostrada en el <Ejemplo 2>.
Los resultados del <Ejemplo de referencia 4> y del <Ejemplo 3> se presentan en la FIG. 2. A partir de los resultados de la prueba descrita anteriormente, se descubrió que TFB pierde completamente su actividad de proteasa (desactivada) cuando se calienta durante 2 minutos a 60 °C o más. Mientras tanto, se descubrió que Murasame-TFB mantiene el 40% o más de su actividad de proteasa incluso cuando se calienta durante 2 minutos a 90 °C y, por lo tanto, Murasame-TFB tiene una mayor estabilidad térmica que TFB.
<Ejemplo de referencia 5> Producción de LFC
(1) Producción del vector de expresión de LFC
Se produjo un vector de expresión para el factor C deLimulus polyphemus(LFC) según el siguiente procedimiento.
Se produjo un ADN que codificaba un LFC de longitud completa excluyendo la secuencia señal del extremo N-terminal (ADN que tenía una secuencia de bases representada por los números de base 76 a 3060 de SEQ ID N°: 13) mediante una reacción de PCR mediante el uso de la ADN polimerasa Tks Gflex (fabricada por Takara Bio, Inc.). Como molde para la reacción de PCR, se usó un vector obtenido insertando un ADN que codificaba LFC en pBluescript II SK(+) (fabricado por Agilent Technologies, Inc.). Como cebadores para la reacción de PCR, se utilizaron el Cebador 13 (SEQ ID N°: 34) y el Cebador 14 (SEQ ID N°: 35).
El ADN obtenido mediante la PCR descrita anteriormente se recogió realizando una extracción con fenol/cloroformo y el ADN se sometió a una digestión limitada mediante el uso de enzimas de restricción (Age I y Xho I) y separación preparativa. Se sometió el TFC/pCA7 a una digestión limitada mediante el uso de enzimas de restricción y separación preparativa de la misma manera que se describió anteriormente, y luego se llevó a cabo una reacción de ligadura entre el ADN y TFC/pCA7.
Se transformóEscherichia colimediante el uso del líquido de reacción de ligadura mencionado anteriormente y luego se llevó a cabo la amplificación y purificación del vector. La secuencia de bases del vector se sometió a un análisis de secuencia y se comprobó que no había una introducción de mutaciones provocada por un error de la PCR. De esta manera, se obtuvo un vector de expresión para un polipéptido que tenía la etiqueta 6XHis y la secuencia de escisión del factor Xa (IEGR) en el lado N-terminal de la secuencia de LFC excluyendo la secuencia señal del extremo N-terminal (en lo sucesivo, denominado "LFC/pCA7").
(2) Producción de LFC
El factor C deLimulus polyphemus(LFC) se produjo mediante un sistema de expresión en células de mamífero según el siguiente procedimiento. El cultivo celular se llevó a cabo en condiciones de 37 °C y 5% de CO2.
Se transformaron células HEK293S GnTI- (ATCC: CRL-3022) mediante el uso del vector de expresión para LFC (LFC/pCA7) obtenido en la sección (1). Específicamente, a las células mencionadas anteriormente que habían alcanzado una confluencia del 80% al 90%, se les añadió un medio de transformación (medio DMEM que incluía LFC/pCA7 (1,8 |jg/mL), polietilenimina (2,7 jg/ml), una disolución de penicilina-estreptomicina-L-glutamina al 1% (fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) y suero fetal bovino al 2%) hasta una concentración de 0,22 ml/cm2, y se añadió benzamidina a la célula hasta una concentración final de 2 mM. La mezcla se sometió a cultivo estático durante 120 horas. De esta manera, se obtuvo un líquido de cultivo que incluía LFC que había sido secretado por las células.
El líquido de cultivo se centrifugó a 6000*g durante 30 minutos y se recogió el sobrenadante. Se mezclaron el sobrenadante y una disolución tampón (NaH2PO4-NaOH 0,5 M (pH 8,0), NaCl 1,5 M e imidazol 0,1 M) en una cantidad 0,1 veces mayor, y luego la mezcla se aplicó a una columna de níquel (columna de níquel-ácido nitrilotriacéticoagarosa, diámetro interior: 1,0 cm x longitud: 2,0 cm). La columna se lavó con una disolución de lavado (NaH2PO4-NaOH 50 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM e imidazol 10 mM), y luego se eluyó el LFC mediante el uso de una disolución de elución (NaH2PO4-NaOH 50 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM e imidazol de 20 a 200 mM). La fracción eluida de LFC se comprobó mediante electroforesis en gel (SDS-PAGE).
Se recogió la fracción eluida de LFC y la disolución se reemplazó con una disolución de reacción (Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM y CaCb 10 mM) por ultrafiltración. Posteriormente, se añadió el factor Xa a la disolución hasta una concentración de 3,3 jg/m l y la mezcla se dejó reposar durante dos días a temperatura ambiente. Así, la etiqueta de His se liberó del extremo N-terminal de LFC.
La disolución de reacción mencionada anteriormente se aplicó a una columna de sefarosa (columna de benzamidina-Sefarosa, diámetro interior: 0,25 cm x longitud: 1,5 cm), y el factor Xa se eliminó adsorbiendo el factor Xa en la columna. Posteriormente, se aplicó una fracción de flujo continuo (flujo continuo) de la columna a una columna de níquel (columna de níquel-ácido nitrilotriacético-agarosa, diámetro interior: 0,25 cm x longitud: 1,5 cm), y la etiqueta de His liberada del LFC se eliminó adsorbiendo la etiqueta de His en la columna. La fracción de flujo continuo de la columna se utilizó como LFC en el ensayo posterior.
<Ejemplo de referencia 6> Producción de LFB
(1) Producción del vector de expresión de LFB
Se produjo un vector de expresión para el factor B deLimulus polyphemus(LFB) según el siguiente procedimiento.
Se produjo un ADN que codificaba la secuencia completa de LFB (ADN que tenía una secuencia de bases representada por los números de base 1 a 1200 de SEQ ID N°: 3) mediante una reacción de PCR mediante el uso de la ADN polimerasa Tks Gflex. Como molde para la reacción de PCR, se utilizó un vector obtenido insertando un ADN que codificaba LFB en pBluescript II SK(+). Además, como cebadores para la reacción de PCR, se utilizaron el cebador 15 (SEQ ID N°: 36) y el cebador 18 (SEQ ID N°: 39).
El ADN obtenido mediante la reacción de PCR descrita anteriormente se purificó y el ADN se sometió a una digestión limitada mediante el uso de enzimas de restricción (EcoR I y Xho I) y separación preparativa. El vector pCA7 se sometió a una digestión limitada mediante el uso de enzimas de restricción (EcoR I y Xho I) y separación preparativa, y luego se llevó a cabo una reacción de ligadura entre el ADN y el vector pCA7. Se transformóEscherichia colimediante el uso del líquido de reacción de ligadura mencionado anteriormente y luego se llevó a cabo la amplificación y purificación del vector. La secuencia de bases del vector se sometió a un análisis de secuencia y se confirmó que no hubo una introducción de mutaciones causada por un error de la PCR. De esta manera, se obtuvo un vector de expresión para el polipéptido que tenía la secuencia completa de LFB.
Se llevó a cabo una reacción de PCR mediante el uso del vector mencionado anteriormente como molde y mediante el uso del Cebador 15 (SEQ ID N°: 36) y el Cebador 19 (SEQ ID N°: 40), y se purificó el ADN así amplificado. El ADN se sometió a una digestión limitada mediante el uso de enzimas de restricción (EcoR I y Xho I) y separación preparativa, y así se obtuvo un fragmento de ADN (ADN que tenía una secuencia de bases representada por los números de base del 1 al 1200 de SEQ ID N°: 3 y una secuencia de bases que codificaba la etiqueta 6XHis, y el ADN tenía el extremo cohesivo de EcoR I en el extremo 5'-terminal y el extremo cohesivo de Xho I en el extremo 3'-terminal).
El vector pCA7 se sometió a una digestión limitada mediante el uso de enzimas de restricción (EcoR I y Xho I) y separación preparativa, y luego se llevó a cabo una reacción de ligadura entre el vector pCA7 y el ADN. Se transformóEscherichia colimediante el uso de la reacción de ligadura mencionada anteriormente y se llevó a cabo la amplificación y purificación del vector. La secuencia de bases del vector se sometió a un análisis de secuencia y se confirmó que no hubo una introducción de mutaciones causada por un error de la PCR. De esta manera, se obtuvo un vector de expresión para un polipéptido que tenía la etiqueta 6xHis en el lado C-terminal de la secuencia completa de LFB.
Se llevó a cabo una reacción de PCR mediante el uso del vector mencionado anteriormente como molde y mediante el uso del Cebador 20 (SEQ ID N°: 41) y el Cebador 21 (SEQ ID N°: 42), y se purificó un ADN amplificado. El ADN se sometió a una digestión limitada mediante el uso de enzimas de restricción (Age I y Xho I) y separación preparativa, y se obtuvo un fragmento de ADN (ADN que tenía una secuencia de bases representada por los números de base del 70 al 1200 de SEQ ID N°: 3 y una secuencia de bases que codificaba la etiqueta 6XHis, y el ADN tenía el extremo cohesivo de Age I en el extremo 5'-terminal y el extremo cohesivo de Xho I en el extremo 3'-terminal).
El vector pCA7 se sometió a una digestión limitada mediante el uso de enzimas de restricción (Age I y Xho I) y separación preparativa, y luego se llevó a cabo una reacción de ligadura entre el vector pCA7 y el ADN. Se transformóEscherichia colimediante el uso del líquido de reacción de ligadura mencionado anteriormente y luego se llevó a cabo la amplificación y purificación del vector. La secuencia de bases del vector se sometió a un análisis de secuencia y se confirmó que no hubo una introducción de mutaciones causada por un error de la PCR. De esta manera, se obtuvo un vector de expresión para un polipéptido que tenía la etiqueta 6XHis en el lado C-terminal de la secuencia LFB excluyendo la secuencia señal del extremo N-terminal (LFB/pCA7).
(2) Producción de LFB
El factor B deLimulus polyphemus(LFB) se produjo mediante un sistema de expresión en células de mamífero según el siguiente procedimiento. El cultivo celular se llevó a cabo en condiciones de 37 °C y 5% de CO2.
Se llevó a cabo la misma operación que la empleada en "(2) Producción de LFC" en el <Ejemplo de referencia 5>, excepto que se usó el vector de expresión para LFB (LFB/pCA7) obtenido en la sección (1) en lugar del vector de expresión para LFC (LFC/pCA7) y no se añadió benzamidina. De este modo, se obtuvo un líquido de cultivo que incluía el LFB secretado por las células.
El líquido de cultivo se aplicó a una columna de níquel (columna de níquel-ácido nitrilotriacético-agarosa, diámetro interior: 1,0 cm x longitud: 1,5 cm) y se obtuvo una fracción eluida de LFB. La purificación en columna se llevó a cabo según el procedimiento descrito en "(2) Producción de LFC" en el <Ejemplo de referencia 5>.
Se recogió una fracción eluida de LFB y la disolución se sustituyó por una disolución de reacción (Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) y NaCl 300 mM) mediante ultrafiltración. El LFB así obtenido se utilizó en el ensayo posterior.
<Ejemplo 4> Producción de Murasame-LFB
Se produjo un vector de expresión para una variante del factor B deLimulus polyphemus(Murasame-LFB) según el siguiente procedimiento.
Se produjo un ADN que codificaba el lado N-terminal de Murasame-LFB (ADN que tenía una secuencia de bases representada por los números de base 1 a 594 de SEQ ID N°: 9; en lo sucesivo, denominado "fragmento de ADN 9") mediante una reacción de PCR mediante el uso de la ADN polimerasa Tks Gflex. Como molde para la reacción de PCR, se utilizó un vector obtenido insertando un ADN que codificaba el LFB en pCA7. Como cebadores para la reacción de PCR, se usaron el cebador 15 (SEQ ID N°: 36) y el cebador 16 (SEQ ID N°: 37).
Se produjo un ADN que codificaba el lado C-terminal de Murasame-LFB (ADN que tenía una secuencia de bases representada por los números de base 562 a 1200 de SEQ ID N°: 9; en lo sucesivo, denominado "fragmento de ADN 10") mediante una reacción de PCR de la misma manera que se describió anteriormente. Como cebadores para la reacción de PCR, se utilizaron el Cebador 17 (SEQ ID N°: 38) y el Cebador 18 (SEQ ID N°: 39).
El ADN obtenido mediante la reacción de PCR se purificó y se obtuvieron el fragmento de ADN 9 y el fragmento de ADN 10.
Se produjo un ADN que codificaba la secuencia completa de Murasame-LFB (ADN que tenía una secuencia de bases representada por los números de base 1 a 1200 de SEQ ID N°: 9) mediante una reacción de PCR mediante el uso de la ADN polimerasa Tks Gflex. Como molde para la reacción de PCR, se utilizó una mezcla del fragmento de ADN 9 y el fragmento de ADN 10. Además, como cebadores para la reacción de PCR, se utilizaron el Cebador 15 (SEQ ID N°: 36) y el Cebador 18 (SEQ ID N°: 39). Posteriormente, se llevó a cabo la misma operación que la empleada en "(1) Producción del vector de expresión de LFB" en el <Ejemplo de referencia 6>. De esta manera, se obtuvo un vector de expresión para un polipéptido que tenía la etiqueta 6XHis en el lado C-terminal de la secuencia de Murasame-LFB excluyendo la secuencia señal del extremo N-terminal (Murasame-LFB/pCA7).
(2) Producción de Murasame-LFB
Se produjo una variante del factor B deLimulus polyphemus(Murasame-LFB) mediante un sistema de expresión de células de mamífero según el siguiente procedimiento. El cultivo celular se llevó a cabo en condiciones de 37 °C y 5% de CO2.
Se llevó a cabo la misma operación que la empleada en "(2) Producción de LFB" en el <Ejemplo de referencia 6> mediante el uso del vector de expresión para Murasame-LFB (Murasame-LFB/pCA7) obtenido en la sección (1) en lugar del vector de expresión para LFB (LFB/pCA7). El Murasame-LFB así obtenido se utilizó en el ensayo posterior.
<Ejemplo de referencia 7> Medición de la actividad de proteasa (actividad específica) de LFB
Se produjo una disolución de LFC 160 nM, LPS 3,2 jM , Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) y NaCl 150 mM, y la disolución se dejó reposar durante 20 minutos a 37 °C. Así, se activó el LFC. En lo sucesivo, el LFC activado se denominará "a-LFC".
Se produjeron 20 j l de una disolución de LFB 50 nM, a-LFC 2 nM, Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM y 100 jg/m l de BSA y la disolución se dejó reposar durante una hora a 37 °C. A esta disolución, se le añadieron 5 j l de Boc-Leu-Thr-Arg-MCA 2 mM disueltos en DMF al 20%, y la mezcla se dejó reposar durante 5 minutos a 37 °C. Se añadió ácido acético 0,6 M (75 j l ) para terminar la reacción enzimática y luego se midió la cantidad de MCA liberada del péptido (adecuadamente proporcional a la actividad de proteasa (actividad total) del LFB activado) con un detector de fluorescencia. La detección se llevó a cabo en condiciones de una longitud de onda de excitación de 380 nm y una longitud de onda de fluorescencia de 440 nm.
Como resultado de la detección descrita anteriormente, la actividad de proteasa (actividad específica) de LFB fue de 44,67 ± 0,61 unidades/pmol.
<Ejemplo 5> Medición de la actividad de proteasa (actividad específica) de Murasame-LFB
Se llevó a cabo la misma operación que la empleada en el <Ejemplo de referencia 7> mediante el uso de Murasame-LFB en lugar de LFB, y se midió la actividad de proteasa de Murasame-LFB.
Como resultado de la prueba descrita anteriormente, la actividad de proteasa (actividad específica) de Murasame-LFB fue de 320,80 ± 9,56 unidades/pmol.
Como resultado de la prueba descrita anteriormente, se descubrió que, de manera similar a Murasame-TFB, Murasame-LFB tiene una mayor actividad de proteasa (actividad específica) que el polipéptido antes de la modificación (LFB).
<Ejemplo de referencia 8> Evaluación de la estabilidad térmica de LFB
Se produjeron 10 j l de una disolución de LFB 100 nM, Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM y 100 jg/m l de BSA, y la disolución se dejó reposar durante 2 minutos a una temperatura predeterminada (40 °C, 50 °C, 60 °C, 70 °C, 80 °C o 90 °C). Posteriormente, a esta disolución se le añadieron 10 j l de una disolución de a-LFC 4 nM, Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM y 100 jg/m l de BSA, y la mezcla se dejó reposar durante un hora a 37 °C. Posteriormente, se llevó a cabo la misma operación que la empleada en el <Ejemplo de referencia 7> y se midió la actividad de proteasa de LFB. Los resultados de la prueba descrita anteriormente se presentan en la Tabla 3.
Tabla 3
La "actividad relativa" de la Tabla 3 es un valor numérico (%) que expresa, en porcentaje, un valor obtenido dividiendo la actividad de proteasa (actividad específica) del LFB que se dejó reposar durante 2 minutos a cada una de las diferentes temperaturas por la actividad de proteasa (actividad específica) del LFB mostrada en el <Ejemplo de referencia 7>.
<Ejemplo 6> Evaluación de la estabilidad térmica de Murasame-LFB
Se llevó a cabo la misma operación que la empleada en el <Ejemplo de referencia 8> mediante el uso de Murasame-LFB en lugar de LFB, y se evaluó la estabilidad térmica de Murasame-LFB. Los resultados de la prueba descrita anteriormente se presentan en la Tabla 4.
Tabla 4
La actividad relativa de la Tabla 4 es un valor numérico (%) que expresa, en porcentaje, un valor obtenido dividiendo la actividad de proteasa (actividad específica) de Murasame-LFB que se dejó reposar durante 2 minutos a cada una de las diferentes temperaturas por la actividad de proteasa (actividad específica) de Murasame-LFB mostrada en el <Ejemplo 5>.
A partir de los resultados de la prueba descrita anteriormente, se descubrió que, de manera similar a Murasame-TFB, Murasame-LFB tiene una mayor estabilidad térmica que el polipéptido antes de la modificación (LFB).
Aplicabilidad industrial
Según la presente invención, se puede producir un polipéptido que tiene una actividad de proteasa superior a la del factor B del cangrejo de herradura de origen natural. Por lo tanto, se espera que el polipéptido proporcionado por la presente invención sea una variante del factor B del cangrejo de herradura que pueda mejorar la sensibilidad de la medición de endotoxinas, en comparación con el factor B del cangrejo de herradura de origen natural. Además, según la presente invención, se puede producir un polipéptido que tiene una estabilidad térmica superior a la del factor B del cangrejo de herradura de origen natural. Por lo tanto, se espera que el polipéptido proporcionado por la presente invención sea una variante del factor B del cangrejo de herradura que tenga una excelente estabilidad de almacenamiento como reactivo, en comparación con el factor B del cangrejo de herradura de origen natural.
<Explicación del listado de secuencias>
SEQ ID N°: 1: Secuencia de bases del ADNc del factor B deTachypleus tridentatus
SEQ ID N°: 2: Secuencia de aminoácidos del factor B deTachypleus tridentatus
SEQ ID N°: 3: Secuencia de bases del ADNc del factor B deLimulus polyphemus
SEQ ID N°: 4: Secuencia de aminoácidos del factor B deLimulus polyphemus
SEQ ID N°: 5: Secuencia de bases (1) del ADNc de la variante del factor B deTachypleus tridentatusSEQ ID N°: 6: Secuencia de bases (2) del ADNc de la variante del factor B deTachypleus tridentatusSEQ ID N°: 7: Secuencia de aminoácidos de la variante del factor B deTachypleus tridentatus
SEQ ID N°: 8: Secuencia de bases (1) del ADNc de la variante del factor B us polyphemusSEQ ID N°: 9: Secuencia de bases (2) del ADNc de la variante del factor Bus polyphemusSEQ ID N°: 10: Secuencia de aminoácidos de la variante del factor B deLimulus polyphemus
SEQ ID N°: 11: Secuencia de bases del ADNc del factor C deTachypleus tridentatus
SEQ ID N°: 12: Secuencia de aminoácidos del factor C deTachypleus tridentatus
SEQ ID N°: 13: Secuencia de bases del ADNc del factor C deLimulus polyphemus
SEQ ID N°: 14: Secuencia de aminoácidos del factor C deLimulus polyphemus
SEQ ID N°: 15: Secuencia de bases del ADNc del factor C deCarcinoscorpius rotundicauda
SEQ ID N°: 16: Secuencia de aminoácidos del factor C deCarcinoscorpius rotundicauda
SEQ ID N°: 17: Secuencia de bases del ADNc de la enzima procoagulante deTachypleus tridentatusSEQ ID N°: 18: Secuencia de aminoácidos de la enzima procoagulanteTachypleus tridentatusSEQ ID N°: 19: Secuencia de bases del ADNc de la enzima procoagulante deLimulus polyphemusSEQ ID N°: 20: Secuencia de aminoácidos del ADNc de la enzima procoagulante deLimulus polyphemusSEQ ID N°: 21 a SEQ ID N°: 42: Cebadores
Claims (10)
1. Un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos en donde el residuo de aminoácido de la posición 193 en una secuencia de aminoácidos de un polipéptido del factor B del cangrejo de herradura que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N°: 2 o SEQ ID N°: 4 está sustituido con un residuo de cisteína (Cys).
2. Un polipéptido representado por cualquiera de los siguientes puntos (A) a (D):
(A) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por los siguientes puntos (A1) o (A2):
(A1) una secuencia de aminoácidos representada por los números de aminoácido 1 a 400 de SEQ ID N°: 7; y
(A2) una secuencia de aminoácidos representada por los números de aminoácido 24 a 400 de SEQ ID N°: 7,
(B) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por los siguientes puntos (B1) o (B2):
(B1) una secuencia de aminoácidos representada por los números de aminoácido 1 a 400 de SEQ ID N°: 10; y
(B2) una secuencia de aminoácidos representada por los números de aminoácido 24 a 400 de SEQ ID N°: 10,
(C) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 90% o superior con la secuencia de aminoácidos del polipéptido representado por al menos uno de los puntos (A) y (B), con tal de que el residuo de cisteína (Cys) de la posición 193 de SEQ ID N°: 7 y SEQ ID N°: 10 no esté sustituido ni delecionado, y
(D) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de fusión en el que se añade una etiqueta peptídica al polipéptido representado por cualquiera de los puntos (A) a (C), y el polipéptido tiene la función del factor B del cangrejo de herradura,
en donde la función del factor B del cangrejo de herradura es la función de entrar en contacto con el factor C activado para cambiar a una forma activada, escindir una enzima procoagulante y, por lo tanto, cambiar la enzima procoagulante hasta una enzima coagulante.
3. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido según la reivindicación 1 o 2.
4. Un ADN representado por cualquiera de los siguientes puntos (a), (b) y (d):
(a) un ADN que tiene una secuencia de bases representada por cualquiera de los siguientes puntos (a1) a (a4):
(a1) una secuencia de bases representada por los números de base 1 a 1200 de SEQ ID N°: 5; (a2) una secuencia de bases representada por los números de base 70 a 1200 de SEQ ID N°: 5; (a3) una secuencia de bases representada por los números de base 1 a 1200 de SEQ ID N°: 6; y (a4) una secuencia de bases representada por los números de base 70 a 1200 de SEQ ID N°: 6, (b) un ADN que tiene una secuencia de bases representada por cualquiera de los siguientes puntos (b1) a (b4):
(b1) una secuencia de bases representada por los números de base 1 a 1200 de SEQ ID N°: 8; (b2) una secuencia de bases representada por los números de base 70 a 1200 de SEQ ID N°: 8; (b3) una secuencia de bases representada por los números de base 1 a 1200 de SEQ ID N°: 9; y (b4) una secuencia de bases representada por los números de base 70 a 1200 de SEQ ID N°: 9, y
(d) un ADN que tiene la secuencia de bases de un ADN de fusión en el que se añade un ADN que codifica una etiqueta peptídica al ADN representado por el punto (a) o (b), y el ADN codifica un polipéptido que tiene la función del factor B del cangrejo de herradura,
en donde la función del factor B del cangrejo de herradura es la función de entrar en contacto con el factor C activado para cambiar a una forma activada, escindir una enzima procoagulante y, por lo tanto, cambiar la enzima procoagulante hasta una enzima coagulante.
5. Un vector que retiene el ácido nucleico según la reivindicación 3 y/o el ADN según la reivindicación 4.
6. Una célula que retiene el ácido nucleico según la reivindicación 3, el ADN según la reivindicación 4 y/o el vector según la reivindicación 5.
7. Un método para producir un polipéptido, y el método comprende una etapa de producción de un polipéptido que tiene la función del factor B del cangrejo de herradura mediante el uso de la célula según la reivindicación 6.
8. Un método para medir una endotoxina, y el método comprende las etapas de los siguientes puntos (1) y (2):
(1) una etapa de mezclar el polipéptido según la reivindicación 1 o 2 con el factor C del cangrejo de herradura y una muestra de prueba; y
(2) una etapa de medir la actividad de proteasa del polipéptido.
9. Un reactivo para la medición de endotoxinas, y el reactivo comprende el polipéptido según la reivindicación 1 o 2 como componente constituyente.
10. Un kit para la medición de endotoxinas, y el kit comprende el polipéptido según la reivindicación 1 o 2, o el reactivo según la reivindicación 9, como parte componente.
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