BR112020014894A2 - Eletrodo para uso na detecção eletroquímica de uma espécie alvo, espectrômetro eletroquímico, uso de um eletrodo e método eletroquímico de detecção de uma espécie alvo - Google Patents

Abstract

o presente pedido refere-se a um eletrodo adequado para uso na detecção eletroquímica de uma espécie alvo. o eletrodo compreende uma monocamada peptídica de comprimento definido e a uma extremidade da qual estão ligados uma espécie ativa redox e um receptor que é capaz de se ligar à espécie alvo. também é fornecido um método eletroquímico de detecção de uma espécie alvo, que envolve o uso do eletrodo.

Description

“ELETRODO PARA USO NA DETECÇÃO ELETROQUÍMICA DE UMA ESPÉCIE ALVO, ESPECTRÔMETRO ELETROQUÍMICO, USO DE UM ELETRODO E MÉTODO ELETROQUÍMICO DE DETECÇÃO DE UMA ESPÉCIE ALVO”

[001] A presente invenção referese a um eletrodo compreendendo peptídeo adequado para uso na detecção eletroquímica de uma espécie alvo, bem como a um método eletroquímico de detecção de uma espécie alvo, que envolve o uso deste eletrodo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Técnicas eletroquímicas têm sido utilizadas em uma ampla faixa de aplicações de detecção, por exemplo, para a detecção e quantificação de moléculas de interesse diagnóstico em amostras fisiológicas, para detecção de gases tóxicos e para monitoramento de alterações em parâmetros ambientais, como umidade.

[003] A espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) é uma técnica que monitora as alterações na capacitância ou na resistência à transferência de carga associadas às alterações no ambiente local de uma superfície de eletrodo adequadamente modificada. Tais mudanças podem incluir a ligação de substâncias (por exemplo, de uma espécie alvo, como um biomarcador) à superfície do eletrodo. O EIS é uma técnica atraente para detectar aplicações, tendo em vista, por exemplo, sua simplicidade de construção, sensibilidade, seletividade e aplicabilidade imediata em metodologias sem etiqueta.

[004] Em trabalhos recentes, foi demonstrado que métodos de impedância eletroquímica podem ser aplicados para resolver uma série de flutuações de carga dentro de filmes moleculares confinados nas superfícies dos eletrodos. Estes compreendem mudanças associadas à flutuação eletrônica de dipolos e movimento iônico induzido por campo e podem ser resolvidos por

Espectroscopia de Capacitância de Monocamada Eletroativa de acordo com suas escalas de tempo específicas e dependência de potencial de superfície. Quando esses filmes moleculares contêm uma porção com estados orbitais que são energeticamente acessíveis (ativo redox), a transferência de elétrons que resulta de/ para o eletrodo metálico subjacente gera um novo processo de carregamento dependente do potencial sensitivo nesta interface. Esta capacitância faradaica (conhecido como capacitância redox, Cr) não é apenas eletrostática e pode ser (para filmes moleculares de alta qualidade com taxas rápidas associadas de transferência de elétrons heterogênea) centenas de vezes maior do que a contribuição de Helmholtz. Foi demonstrado que esta assinatura de Cr pode ser integrada em filmes que são capazes adicionalmente de recrutar alvos específicos de interesse (como os parceiros antigênicos de anticorpos ou aptâmeros). A mudança de capacitância redox pode então ser usada no estabelecimento de um novo formato de biossensor sem rótulo, de alta sensibilidade, estabilidade e conveniência. Para mais detalhes do estado da técnica, pode ser feita referência, por exemplo, ao WO 2015/022483, WO 2016/120606, Biosensors and Bioelectronics 50 (2013) 437-440 e Biosensors and Bioelectronics 57 (2014) 96-102.

[005] Um fator crítico que afeta o desempenho dos sistemas EIS é a estrutura do eletrodo funcionalizado que suporta o filme molecular confinado. A otimização do eletrodo tem o potencial para produzir melhorias dramáticas na capacidade do sensor, por exemplo para alcançar limites de detecção (“LOD”) melhorados, sensibilidade a alterações em minutos em concentração da espécie alvo, e/ ou seletividade para a espécies alvo de interesse.

[006] Em um artigo recente (Biosensors and Bioelectronics 68 (2015) 281-287), Santos et al. relataram a preparação de um eletrodo funcionalizado com peptídeo e demonstraram que esse sistema poderia ser aplicado à detecção da proteína CRP pelo EIS. O reagente peptídico tinha a estrutura Ac-Cys-Ala-Ala-Lys(Fc)-Ala-Ala, em que Ac representa uma acetilação no resíduo de cisteina N-terminal e Fc representa uma espécie de ferroceno redox ligada ao resíduo de lisina através da cadeia lateral do último amino. O eletrodo EIS compreendia uma monocamada deste peptídeo, adicionalmente funcionalizada com anticorpo anti-CRP ligado ao peptídeo através da função ácido carboxílico livre no resíduo de alanina C-terminal.

[007] Ainda existe uma necessidade na técnica de fornecer sistemas aprimorados adicionais para a detecção de uma espécie alvo, por exemplo, que possibilitem melhorias adicionais em características tais como limite de detecção (“LOD”), sensibilidade a alterações na concentração da espécies alvo e/ ou seletividade à espécie alvo de interesse.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[008] Os presentes inventores identificaram agora um novo eletrodo compreendendo peptídeo para uso em detecção eletroquímica (por exemplo, detecção por espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS)) de uma espécie alvo. Existem inúmeras vantagens associadas ao uso de uma superfície receptiva à base de peptídeos em vez de outras monocamadas (por exemplo, monocamadas de alcanotiol). Por exemplo, peptídeos potencialmente têm vantagens quando usados em ambientes biológicos complexos, evitando os efeitos da matriz biológica. Os reagentes peptídicos desejados também podem ser rotineiramente sintetizados usando princípios bem estabelecidos para a síntese peptídica, e sua estrutura facilmente otimizada para aplicações particulares, simplesmente pela seleção apropriada dos blocos de construção de aminoácidos. Ainda mais, a presença de grupos quimicamente reativos no final do peptídeo e nos grupos laterais de certos resíduos de aminoácidos permite prontamente a introdução de espécies ativas redox e receptores de espécies alvo para uso em métodos eletroquímicos, como métodos EIS.

[009] Os presentes inventores verificaram ainda que a estrutura específica da monocamada peptídica no novo eletrodo possibilita particularmente propriedades de biosensoriamento vantajosas, tais como limites de detecção muito baixos, juntamente com alta sensibilidade e a seletividade à espécie alvo de interesse. Especificamente, a presente invenção fornece: 1] Um eletrodo para uso na detecção eletroquímica de uma espécie alvo, cujo eletrodo compreende: (i) um substrato eletricamente condutor; (ii) uma monocamada peptídica compreendendo uma pluralidade de moléculas de peptídeo que são cada uma: - dispostas no substrato; - ligada a uma espécie ativa redox; e - ligada a um receptor que é capaz de se ligar à espécie alvo; em que: - as moléculas de peptídeos têm de três a cinco resíduos de aminoácidos de comprimento, incluindo um primeiro resíduo de aminoácido terminal que é adjacente ao substrato e um segundo aminoácido terminal; e - as espécies ativas redox e o receptor estão ligados ao segundo aminoácido terminal;

[2] Um espectrômetro eletroquímico compreendendo um eletrodo da presente invenção;

[3] Uso de um eletrodo da presente invenção para a detecção eletroquímica da espécie alvo;

[4] Um método eletroquímico de detecção de uma espécie alvo, cujo método compreende: (A) colocarem contato com um meio transportador que pode compreender a referida espécie alvo com um eletrodo da presente invenção; (B) obter uma ou mais medições eletroquímicas do referido eletrodo; e (C) determinar a partir das referidas medições eletroquímicas se a espécie alvo está presente no meio transportador.

[0010] Outras características e formas de realização preferidas são descritas na descrição anexa e nas reivindicações anexas.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0011] A Figura 1 ilustra esquematicamente várias conformações e configurações estruturais para uma superfície de eletrodo funcionalizada com diferentes espécies receptoras e alvo.

[0012] A Figura 2 ilustra a porcentagem de resposta relativa, RR%, de alguns dos sistemas EIS descritos no Exemplo 2 e apresentando um receptor de aptâmero (painel a) ou receptor de anticorpo (painel b) como uma função da concentração alvo (pM) de CRP.

[0013] A Figura 3 ilustra o uso da resposta de capacitância eletroquímica de monocamadas peptídicas funcionalizadas com anticorpos NS1 para discriminar entre amostras de sangue real com dengue positivas e negativas cegas obtidas em São Paulo (Brasil), conforme descrito em mais detalhes no Exemplo 3. O eixo y representa a resposta (%); a barra mais à esquerda mostra a resposta para amostras positivas e a barra mais à direita mostra a resposta para amostras negativas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0014] As características opcionais e preferidas da presente invenção são agora descritas. Qualquer uma das características aqui descritas pode ser combinada com qualquer uma das outras características aqui descritas, a menos que indicado de outra forma.

O eletrodo

[0015] O eletrodo funciona como o eletrodo de trabalho em um sistema eletroquímico, como um sistema EIS.

Substrato eletricamente condutor

[0016] O eletrodo compreende um substrato eletricamente condutor. Este substrato pode compreender qualquer material eletricamente condutor. O substrato pode compreender um metal ou carbono. O metal pode ser um metal na forma elementar ou uma liga de um metal. Opcionalmente, todo o substrato compreende um metal ou carbono. O substrato pode compreender um metal de transição. O substrato pode compreender um metal de transição selecionado a partir de qualquer um dos grupos 9 a 11 da Tabela Periódica. O substrato pode compreender um metal selecionado a partir de, mas não limitado a, rênio, irídio, paládio, platina, cobre, índio, rubídio, prata e ouro. O substrato pode compreender um metal selecionado a partir de ouro, prata e platina. O substrato pode compreender um material contendo carbono, que pode ser selecionado a partir de grafite pirolítica no plano da borda, grafite pirolítica no plano basal, carbono vítreo, diamante dopado em boro, grafite pirolítica altamente ordenada, pó de carbono e nanotubos de carbono. Em uma forma de realização preferida, o substrato compreende ouro, por exemplo, o substrato é um substrato de ouro.

[0017] A superfície do eletrodo (isto é, a superfície do substrato) pode ser plana, o que inclui uma superfície geralmente plana, por exemplo, sem recortes, protrusões e poros. Tais superfícies de substrato podem ser prontamente preparadas por técnicas como o polimento com partículas finas, por exemplo, pulverização com partículas finas, opcionalmente em uma sequência de etapas em que o tamanho das partículas finas é diminuído em cada etapa de polimento. As partículas finas podem, por exemplo, compreender um material à base de carbono, como diamante, e/ ou podem ter partículas com diâmetros de um ou menos, opcionalmente 5 um ou menos, opcionalmente 3 um ou menos, opcionalmente 1 um ou menos, opcionalmente 0,5 um ou menos, opcionalmente 0,1 um ou menos. Após o polimento, a superfície do substrato pode ser lavada,

por exemplo, por ultrassom, opcionalmente em um meio líquido adequado, como água, por exemplo, por um período de pelo menos 1 minuto, por exemplo, de cerca de 1 minuto a 10 minutos. Opcionalmente, a superfície do substrato pode ser lavada com uma solução abrasiva, por exemplo solução ácida, por exemplo, após as etapas de polimento e, se usado, de lavagem por ultrassom. A solução de abrasivo podem compreender um ácido inorgânico, por exemplo, H2SO., e/ ou um peróxido, por exemplo H2O02, em um meio líquido adequado, por exemplo água. Opcionalmente, os substratos podem ser eletroquimicamente polidos, o que pode seguir quaisquer etapas que envolvam um ou mais polimentos com partículas finas, lavando, por exemplo, por ultrassom e/ ou usando uma solução abrasiva. O polimento eletroquímico pode envolver um ciclo entre um potencial superior e inferior até que um pico de redução estável seja atingido, por exemplo, um potencial superior de 0,5 V ou mais, opcionalmente 1 V ou mais, opcionalmente 1,25 V ou mais e um potencial menor que 0,5 V ou menos, opcionalmente 0,25 V ou menos, opcionalmente 0,1 V ou menos.

Monocamada peptídica

[0018] O eletrodo compreende uma monocamada peptídica compreendendo uma pluralidade de moléculas de peptídeos. As moléculas de peptídeos são dispostas no substrato. Tipicamente, a monocamada peptídica é uma monocamada auto-montada (e, portanto, as moléculas de peptídeos são capazes de formar uma monocamada auto-montada). Normalmente, as moléculas de peptídeos estão dispostas sobre o substrato de tal modo que eles são orientados da mesma maneira, isto é, onde as moléculas de peptídeos têm um primeiro aminoácido terminal A: e um segundo aminoácido terminal A2, em seguida, para cada peptídeo, A: é adjacente ao substrato e Ar é o aminoácido que está mais afastado do substrato.

[0019] As moléculas de peptídeos têm cada uma de três a cinco resíduos de aminoácidos de comprimento. Preferencialmente, as moléculas de peptídeos têm cada uma de quatro a cinco resíduos de aminoácidos de comprimento. Mais preferencialmente, as moléculas de peptídeos têm cada uma quatro resíduos de aminoácidos de comprimento.

[0020] Os resíduos de aminoácidos compreendidos pelo peptídeo são tipicamente resíduos de alfa-aminoácido, isto é, são resíduos de derivados de alfa-aminoácidos de fórmula geral H2 N-C(Ri)(R2)JCOOH, onde R1: e R2 representam grupos laterais (e em que R> é mais geralmente, mas não necessariamente, hidrogênio). Os resíduos de aminoácidos podem estar na forma D ou L. De preferência, os aminoácidos estão na forma L, a menos que a forma D seja especificamente identificada.

[0021] Exemplos não limitativos de resíduos de alfa-aminoácido incluem os aminoácidos proteinogênicos (por exemplo, alanina, cisteina, ácido aspártico, ácido glutâmico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, metionina, asparagina, pirrolisina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina, selenocisteina, valina, triptofano e tirosina). Outros resíduos de aminoácidos também podem estar presentes, por exemplo, resíduos de aminoácidos não naturais. Os resíduos de aminoácidos também podem compreender uma modificação química, por exemplo, podem ser um derivado quimicamente modificado de um aminoácido proteinogênico. Exemplos de modificações incluem modificações pós-traducionais naturais (estas são bem conhecidas na arte) e modificações de grupos de proteção (isto é, a introdução de um grupo de proteção ligado a um grupo quimicamente reativo, como uma cadeia lateral reativa ou o grupo amina, amida ou carboxílico nos terminais peptídicos, tais grupos protetores sendo também conhecidos no estado da técnica — ver, por exemplo, Chem. Rev. 2009 109 2455-2504).

[0022] Cada molécula de peptídeo tem um primeiro resíduo de aminoácido terminal que é adjacente ao substrato e outros aminoácidos para se ligar à espécie ativa redox e ao receptor. O primeiro resíduo de aminoácido terminal pode ser o resíduo de aminoácido N-terminal ou o resíduo de aminoácido C-terminal do peptídeo. De preferência, o primeiro resíduo de aminoácido terminal é o resíduo de aminoácido C- terminal.

[0023] O primeiro resíduo de aminoácido terminal é de preferência um resíduo de cisteina, particularmente quando o substrato eletricamente condutor compreende ouro ou é um substrato de ouro. Sabe-se que a cisteina se liga vantajosamente ao ouro através de sua cadeia lateral de tiol. Assim, dependendo de um peptídeo possuindo um resíduo de cisteina terminal fornece uma ligação pronta dos peptídeos (por exemplo, por auto-montagem) ao substrato.

[0024] O primeiro resíduo de aminoácido terminal pode opcionalmente compreender um grupo de proteção química, de modo que não compreenda um grupo amina livre (onde o primeiro resíduo de aminoácido terminal está no N-terminal) ou um grupo de ácido carboxílico livre (onde o primeiro resíduo de aminoácido terminal está no C-terminal) que de outra forma estaria presente. Muitos grupos de proteção química para os peptídeos N- terminal e C-terminal são bem conhecidos na técnica (ver novamente, por exemplo, Chem. Rev. 2009 109 2455-2504). Um exemplo de grupo protetor para um amino ácido N-terminal é um grupo acetila (isto é, um grupo -C(O)CH;3 ligado ao grupo amina livre). Um exemplo de grupo protetor para um aminoácido C- terminal é um grupo NH>2 (ou seja, ligado ao ácido carboxílico livre). Tal um aminoácido C-terminal protegido é conhecido como um aminoácido C-terminal amidado.

[0025] O segundo aminoácido terminal é ligado a cada uma da espécies ativas redox e ao receptor. Tipicamente, a ligação a uma da espécies ativas redox e ao receptor é através do grupo amina livre ou ácido carboxílico do segundo aminoácido terminal. Preferencialmente, esta ligação é feita através do grupo aminoácido livre do segundo aminoácido terminal (isto é, na forma de realização preferida em que o segundo resíduo de aminoácido terminal é o resíduo de aminoácido N-terminal). Mais preferencialmente, são a espécies ativas redox que estão ligadas através do ácido carboxílico livre ou, mais preferencialmente, do grupo amina livre do segundo aminoácido terminal. Tipicamente, a ligação da outra da espécies ativas redox e do receptor (este de preferência sendo o receptor) é através de um grupo lateral reativo presente no segundo aminoácido terminal. Exemplos de alfa-aminoácidos contendo tais grupos laterais reativos adequados incluem ácido glutâmico, lisina, ácido aspártico, arginina, histidina, cisteina e tirosina. Assim, estes aminoácidos constituem “segundos resíduos de aminoácidos terminal preferidos. Particularmente preferidos são o ácido glutâmico, ácido aspártico e lisina, sendo o ácido glutâmico e ácido aspártico os mais preferidos. Em outros aspectos preferidos, o segundo aminoácido terminal é selecionado a partir de ácido glutâmico e lisina, mais preferencialmente ácido glutâmico.

[0026] O peptídeo contém de um a três resíduos de aminoácidos não terminais entre o primeiro resíduo de aminoácido terminal e o segundo aminoácido terminal. Quando a molécula de peptídeo tem de quatro a cinco resíduos de aminoácidos de comprimento, então ela contém de dois a três resíduos de aminoácidos não terminais. Quando a molécula de peptídeo tem quatro resíduos de aminoácidos de comprimento, ela contém dois resíduos de aminoácidos não terminais.

[0027] Os resíduos de aminoácidos não terminais podem ser iguais ou diferentes. De preferência, os aminoácidos não terminais têm cadeias laterais fisicamente pequenas e/ ou não polares, de modo a promover o seu empilhamento na monocamada e/ ou a densidade de moléculas de peptídeos na monocamada. Exemplos de tais aminoácidos incluem alanina, glicina, valina, leucina e isoleucina. Um resíduo de aminoácido não terminal preferido é a alanina. Em uma forma de realização particularmente preferida, todos os resíduos de aminoácidos não terminais são resíduos de alanina.

[0028] Exemplos de moléculas de peptídeos têm uma sequência selecionada a partir de Glu-Ala-Ala-Cys, Glu-Ala-Ala-Ala-Cys, Lys-Ala-Ala-Cys e Lys-Ala-Ala-Ala-Cys (onde o N-terminal está no primeiro aminoácido citado). Tais peptídeos são preferencialmente protegidos no C-terminal, por exemplo, amidados. Assim, os peptídeos particularmente preferidos incluem Glu-Ala-Ala- Cys-NH2, Glu-Ala-Ala-Ala-Cys-NH>2, Lys-Ala-Ala-Cys-NH> e Lys-Ala-Ala-Ala- Cys-NH>.

[0029] Sem estar limitado pela teoria, considera-se que a capacidade do peptídeo para proporcionar um desempenho de biossensor particularmente benéfico pode estar ligado a distâncias que ela oferece entre: (a) a superfície do eletrodo e a espécies ativas redox; e (b) a espécies ativas redox e o receptor. Será apreciado que essas distâncias surgem em consequência do comprimento da cadeia (três a cinco e, de preferência, quatro resíduos de aminoácidos) do peptídeo e a ligação de ambas a espécies ativas redox e do receptor ao mesmo aminoácido (isto é, o segundo aminoácido terminal). Essas características físicas do peptídeo, que podem otimizar o desempenho eletrônico do eletrodo, combinam-se com as outras vantagens de utilizar uma monocamada peptídica em vez de outras formas de monocamada, conforme discutido em outro documento neste documento.

Receptor

[0030] O receptor é capaz de se ligar à espécie alvo. Tal como descrito acima, ele está ligado ao segundo aminoácido terminal do peptídeo que está disposto sobre o substrato.

[0031] De preferência, o receptor é capaz de se ligar especificamente à espécie alvo. “Capaz de se ligar especificamente à espécie alvo” normalmente significa ter uma constante de ligação à espécie alvo pelo menos 50 vezes maior que a constante de ligação a qualquer/quaisquer outra(s)

substância(s) presente(s) no meio transportador, de preferência pelo menos 100 vezes maior e mais preferencialmente ainda pelo menos 200 vezes maior.

[0032] Os exemplos de receptores adequados incluem anticorpos, fragmentos de anticorpos, ácidos nucleicos, aptâmeros, oligossacarídeos, peptídeos e proteinas. De preferência, o receptor é selecionado a partir de aptâmeros, anticorpos, ácidos nucleicos e peptídeos. Mais preferencialmente, o receptor é um aptâmero ou anticorpo, e mais preferencialmente um aptâmero.

[0033] O anticorpo ou o fragmento de anticorpo pode ser selecionado a partir de uma ou mais das classes IgA, 1gD, IgE, 1gG e IgM. Em uma forma de realização preferida, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo é do tipo IgG. O anticorpo se liga seletivamente à espécie alvo. O anticorpo ou o fragmento de anticorpo pode ser derivado de um mamífero, incluindo, mas não se limitando a, um mamífero selecionado a partir de um humano, um camundongo, um rato, um coelho, uma cabra, uma ovelha e um cavalo. O aptâmero pode ser selecionado a partir de um aptâmero de peptídeo, um aptâmero de DNA e um aptâmero de RNA.

[0034] Claramente, a escolha do receptor para um determinado eletrodo é determinada pela identidade da espécie alvo. Para uma espécie alvo específica, deve ser selecionado um receptor correspondente que seja capaz de se ligar (de preferência se ligar especificamente) à espécie alvo. Como um exemplo ilustrativo, se a espécie alvo for a proteina NS1 da dengue (concentrações sanguíneas significativas das quais estão associadas à infecção pelo vírus da dengue), então o receptor deverá ser uma substância capaz de se ligar (de preferência se ligar especificamente) à proteina NS1 da dengue, como uma anticorpo NS1 da dengue.

[0035] EM uma forma de realização preferida, os pesos moleculares (medidos, por exemplo, em kDa) do receptor e da espécie alvo, respectivamente, são controlados de modo a otimizar a sensibilidade do eletrodo para detectar a espécie alvo. Em particular, verificou-se que a faixa do efeito de campo que dá origem à sensibilidade do eletrodo à presença de uma espécie alvo pode ser otimizada diminuindo a magnitude do peso molecular do receptor em relação ao peso molecular da espécie alvo, ou seja, aumentando a razão do peso molecular da espécie alvo para o peso molecular do receptor. Consequentemente, espécies receptoras de baixo peso molecular podem ser preferíveis para otimizar a sensibilidade, como por exemplo, através do uso de receptores de aptâmeros, em comparação com receptores de anticorpos. Este efeito pode pelo menos em parte ser atribuível a um receptor fisicamente menor e de menor peso molecular, permitindo um acesso mais íntimo da espécie alvo ligada à espécie ativa redox e à superfície subjacente do eletrodo. O papel dos tamanhos relativos da espécie alvo e receptoras também é ilustrado esquematicamente na Figura 1, como discutido em mais detalhes no Exemplo 2.

[0036] Assim, a razão preferida de peso molecular da espécie alvo para peso molecular do receptor (Mvwa"Yº/ MyecePtor) pode, por exemplo, ser pelo menos 0,5, mais preferencialmente pelo menos 1,0, mais preferencialmente ainda pelo menos 10 e particularmente preferencialmente pelo menos 25. Não existe um limite determinado no limite superior da razão preferida do peso molecular da espécie alvo para peso molecular do receptor, mas um limite superior nocional prático pode por exemplo ser da ordem de não mais do que 1000, por exemplo, não mais do que 500 ou não mais de 200.

Espécies ativas redox

[0037] Como descrito acima, a espécie ativa redox é anexada ao segundo aminoácido terminal do peptídeo que é disposto no substrato.

[0038] Não existe uma limitação particular à identidade da espécies ativas redox. No entanto, exemplos de espécies ativas redox adequadas incluem um complexo químico metálico compreendendo um metal de transição como Fe, Ru, Ti, V, Mn, Cr, Co, Ni, Nb ou Mo ou azul de metileno. Outros exemplos representativos de espécies ativas redox adequadas incluem sistemas redox à base de ósmio, ferrocenos, quinonas e porfirinas, incluindo derivados dos mesmos. Os derivados do quinina incluem p-benzoquinona e hidroquinona. Preferencialmente, a espécie ativa redox é ferroceno ou um derivado do mesmo, por exemplo uma alquila (por exemplo, alquila C1-6) ou um derivado de acila. Mais preferencialmente, a espécie ativa redox é um ferroceno.

Uso do eletrodo

[0039] O eletrodo pode ser usado para detecção por espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) de uma espécie alvo. Por exemplo, um método de EIS adequado para detectar uma espécie alvo compreende: (A) colocar em contato um meio transportador que pode compreender a referida espécie alvo com um eletrodo da presente invenção; (B) obter uma ou mais medições eletroquímicas do referido eletrodo; e (C) determinar a partir das referidas medições eletroquímicas se a espécie alvo está presente no meio transportador.

[0040] O eletrodo pode ser aplicado a métodos que já são conhecidos na técnica para detecção por EIS de uma espécie alvo. Tais métodos são descritos, por exemplo, nos documentos WO 2015/022483, WO 2016/120606, Biosensors and Bioelectronics 50 (2013) 437-440 e Biosensors and Bioelectronics 57 (2014) 96-102, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência em sua totalidade. O presente pedido não é uma cartilha sobre este assunto. No entanto, para facilitar a compreensão, um exemplo desse método de EIS, como divulgado anteriormente no documento WO 2016/120606, é descrito em mais detalhes abaixo.

[0041] A espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) é uma técnica conhecida pelo técnico no assunto. Geralmente, um potencial de CA variável é aplicado em um potencial de polarização (ou CC) entre um eletrodo em funcionamento e um contra-eletrodo. Convencionalmente, o EIS envolve a varredura em uma faixa de frequências de CA ow. A razão do sinal de entrada (normalmente o potencial variável) para o sinal de saída (normalmente a corrente variável) permite que a impedância seja calculada. Geralmente, existe uma diferença de fase entre o sinal de entrada e o sinal de saída, de modo que a impedância pode ser considerada uma função complexa Z*, tendo uma parte real (às vezes denominada Z') e uma parte imaginária (às vezes denominada Z).

[0042] A faixa de frequência do potencial de CA variável aplicado pode variar de 1 mHz a 10 MHz. A amplitude do potencial de CA aplicado, que normalmente está na forma de uma onda senoidal, pode ser de 1 mV a 100 mV, opcionalmente de 5 mV a 50 mV, opcionalmente de 5 mV a 20 mV, opcionalmente de 5 mV a 15 mV, opcionalmente 8 mV a 12 mV, opcionalmente cerca de 10 mV.

[0043] Ao realizar uma medição EIS, o potencial de polarização (ou potencial de corrente direta) pode ser definido em qualquer valor desejado. Esse potencial de DC ou polarização é conhecido aqui como o potencial aplicado. Um exemplo de método da presente invenção envolve a obtenção de uma pluralidade de medições da impedância complexa através de uma faixa de potenciais aplicados (o que permite a integração subsequente sobre a tensão aplicada), isto é, um número de medições EIS são obtidas cada uma com tensões selecionadas diferentes. Tipicamente, a pluralidade de medições da impedância complexa obtida pelo EIS é de pelo menos três medições, de preferência pelo menos cinco medições, como pelo menos dez ou até pelo menos vinte medições, ou seja, a faixa de potenciais aplicados tipicamente compreende pelo menos três potenciais diferentes aplicados, de preferência pelo menos cinco potenciais aplicados diferentes, como pelo menos dez ou mesmo pelo menos vinte potenciais aplicados diferentes.

[0044] Na etapa de conversão da pluralidade de medições de Z*

em uma pluralidade de medições do componente real da capacitância complexa, C', medições de C' em uma frequência selecionada (fixa/ única) 6 são utilizadas. Como seria de conhecimento de um técnico no assunto, C' normalmente varia conforme é muda (isto é, C' é uma função de o&). A frequência adequada selecionada & vai naturalmente depender da construção de um eletrodo em particular, e da natureza do método de detecção a ser realizado. No entanto, a determinação de uma frequência selecionada adequada o é rotineira. O técnico no assunto poderia facilmente, por exemplo, identificar um valor de & onde os valores obtidos de C' são satisfatoriamente elevados (por exemplo, no ou próximo do valor máximo de C' em toda a faixa de frequências aplicadas em uma varredura de rotina EIS) e/ ou responsivos à característica particular do ambiente local do eletrodo que se procura sondar. Princípios análogos se aplicam quando a pluralidade de medições de Z* é convertida em uma pluralidade de medições do componente imaginário da capacitância complexa, C”.

[0045] A conversão de Z* na frequência selecionada w em C' e/ ou C” é rotineira e bem conhecida na técnica. Em particular, em uma análise EIS prática padrão, a função de impedância complexa Z*(€<) em um potencial específico pode ser convertida fasorialmente em capacitância complexa C*(w) com seus componentes reais e imaginários, usando a equação C*(w) = 1/ inZ*(w).

[0046] A integração das medições de C' e/ ou C” em função da tensão aplicada também pode ser realizada rotineiramente, por exemplo, usando “área sob os métodos gráficos” quando C', C” ou qualquer combinação de C' e C” são plotados em relação à tensão aplicada e/ ou por meio de algoritmos computadorizados de rotina e bem conhecidos para integrar os dados empiricamente derivados.

[0047] A integração de C' e C” na frequência selecionada é em função da tensão aplicada fornece um “valor de medição integrada” que é adequado para a detecção. Especificamente, um valor de medição integrada derivado da integração de C' está relacionado à densidade de estados (DOS) do sistema, ou seja, reflete a capacitância quântica. Um valor de medição integrada derivado da integração de C” está relacionado à condutância do sistema.

[0048] Na prática, às vezes pode ser preferível (por pura simplicidade de operação) obter o valor de medição integrada pela integração de apenas um de C' e C” na frequência selecionada à em função da tensão aplicada. Em uma primeira forma de realização preferida, portanto, a pluralidade de medições de Z* é convertida em uma pluralidade de medições do componente real da capacitância complexa, C' na frequência selecionada é e essas medições são convertidas em função da tensão aplicada para obter o valor de medição integrada. Além disso, em uma segunda forma de realização preferida, a pluralidade de medições de Z* é convertida em uma pluralidade de medições do componente imaginário da capacitância complexa, CC” na frequência selecionada é e essas medições são convertidas em função da tensão aplicada para obter o valor de medição integrada.

[0049] No entanto, como ambos C' e C” podem ser usados, também será aparente para o técnico no assunto que um valor de medição integrada pode ser obtido através da integração de qualquer combinação de C' e C”, na frequência selecionada é em função da tensão aplicada. Por exemplo, qualquer soma dos valores de C' e C” (onde C' e/ ou C” é possivelmente ponderada com quaisquer constantes negativas ou positivas) ou qualquer múltiplo ou quociente dos valores de C' e C" pode ser usado.

[0050] O valor da medição integrada é normalmente comparado com um ou mais valores de referência. O(s) valor(es) de referência pode(m) ser obtido(s) através da obtenção de um ou mais valores de medição integradas correspondentes em condições em que a concentração da espécie alvo já é conhecida. Em outras palavras, o(s) valor(es) de referência é/são usados para calibrar o valor de medição integrada obtido quando o método é executado em condições de teste com valores esperados que seriam obtidos em condições conhecidas específicas. A calibração de um aparelho para uso em aplicações de detecção é bem conhecida e rotineira na técnica, inclusive em métodos baseados em EIS.

[0051] Na etapa (A) do método da presente invenção, um meio transportador que pode compreender a referida espécie alvo é colocado em contato com um eletrodo da presente invenção. A resposta eletroquímica do sistema é sensível à presença da espécie alvo. Assim, se o meio transportador contiver a espécie alvo, então um valor de medição integrada específico será obtido. O valor da medição integrada será diferente se o meio transportador não contiver a espécie alvo. Da mesma forma, mudanças no valor de medição integrada ocorrerão à medida que a concentração da espécie alvo no meio transportador mudar.

[0052] O meio transportador está preferencialmente na forma líquida, embora também sejam possíveis meios gasosos. O líquido transportador (ou gás) pode ser qualquer líquido (ou gás) no qual a espécie alvo possa ser suspensa ou dissolvida (ou dispersa). Em uma forma de realização, o líquido transportador compreende água. Em uma forma de realização, o líquido transportador compreende um fluido biológico. Um fluido biológico pode ser um fluido que foi obtido de um sujeito, que pode ser um humano ou um animal. Em uma forma de realização, o líquido transportador compreende um fluido biológico não diluído. Um fluido biológico não diluído no presente contexto é um fluido biológico obtido de um sujeito, por exemplo, um humano ou animal, que não foi diluído com outro líquido. O fluido biológico pode ser selecionado a partir de sangue, urina, lágrimas, saliva, suor e líquido cefalorraquidiano. Opcionalmente, o meio transportador compreende um fluido biológico obtido de um sujeito, por exemplo, um humano ou animal, e um diluente. O diluente pode ser adicionado ao fluido biológico depois de ter sido obtido do sujeito. O diluente pode incluir um meio líquido, por exemplo, um meio líquido selecionado a partir de água e um álcool, por exemplo, um álcool, por exemplo, etanol. O meio transportador pode ainda compreender um tampão. O tampão pode compreender um fosfato.

[0053] A espécie alvo é uma substância que pode ou não estar presente no meio transportador, opcionalmente em conjunto com uma ou mais espécies não alvo, e que os usuários desejam detectar/ revelar. Mais tipicamente, o método é um para determinar a concentração da referida espécie alvo no referido meio transportador.

[0054] Embora esse método possa ser usado para detectar uma variedade de espécies alvo, um aspecto particularmente útil é a detecção de uma espécie de interesse diagnóstico. A detecção sensível de biomarcadores em amostras fisiológicas é de crescente interesse no diagnóstico. Os métodos da presente invenção podem ser utilizados para detectar de forma sensível e seletiva (e determinar a concentração) de biomarcadores específicos, especificamente fornecendo um substrato de eletrodo que é funcionalizado com porções receptoras que são capazes de se ligar especificamente ao biomarcador de interesse.

[0055] Exemplos de espécies alvo incluem aquelas selecionadas a partir do grupo que consiste em proteina CRP, insulina e um marcador de um ou mais de neurodegeneração, câncer, infarto do miocárdio, diabetes e trauma geral.

[0056] Mais geralmente, as espécies alvo adequadas para detecção de acordo com os métodos da invenção incluem proteinas, polipeptídeos, anticorpos, nanopartículas, drogas, toxinas, gases nocivos, produtos químicos perigosos, explosivos, partículas virais, células, organismos multicelulares, citocinas e quimiocinas, ganietócitos, organelas, lipídios, sequências de ácidos nucleicos, oligossacarídeos, intermediários químicos de vias metabólicas e macromoléculas. Em formas de realização preferidas, a espécie alvo compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em, uma molécula biológica, mais adequadamente uma macromolécula biológica, mais adequadamente um polipeptídeo. Um biomarcador é um exemplo de molécula biológica de interesse particular.

[0057] Se a espécie alvo é ou compreende uma proteina, a proteina pode ser selecionada a partir de, mas não está limitada a, proteinas nativas, proteinas desnaturadas, fragmentos de proteina e proteinas expressas em procariotos ou eucariotos. A proteina pode ter seu significado normal na técnica, e mais preferencialmente “proteina” refere-se a uma molécula de polipeptídeo. Esse polipeptideo pode compreender modificações como glicosilação; fosforilação ou outras modificações.

[0058] Se a espécie alvo for um anticorpo, o anticorpo pode ser selecionado a partir de uma ou mais das classes IgA, IgD, IgE, IgG e IgM.

[0059] Se a espécie alvo for uma nanopartícula, a nanopartícula pode ser selecionada, mas não está limitada a, uma ou mais nanopartículas isolantes, metálicas ou semicondutoras.

[0060] Se a espécie alvo for um medicamento, o medicamento pode ser selecionado, entre outros, a partir de álcool (por exemplo, etanol), anfetaminas, nitrato de amila, heroína, cetamina, esteroides anabolizantes, LSD, solventes, cannabis, cocaína (como cloridrato de cocaína ou “coca'), tabaco, tranquilizantes, crack (ou seja, base livre de cocaína), ecstasy e/ ou gama- hidroxibutirato (GHB). Alternativamente, em algumas formas de realização, o medicamento pode ser uma substância medicinal.

[0061] A espécie alvo pode ser uma droga candidata, por exemplo, uma entidade química ou biológica que pode ser testada ou rastreada para uma atividade ou propriedade específica usando a presente invenção.

[0062] Se a espécie alvo for uma toxina, a toxina pode ser selecionada a partir de, mas não está limitada a, uma ou mais toxinas originárias de animais, plantas ou bactérias.

[0063] Se a espécie alvo for uma partícula viral, a partícula viral pode ser selecionada a partir de, mas não está limitada a, uma ou mais partículas virais com e sem um genoma.

[0064] Se a espécie alvo for uma célula, a célula pode ser selecionada a partir de, mas não está limitada a, uma ou mais células progenitoras pluripotentes, células humanas (por exemplo, células B, células T, mastócitos, fagócitos, neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, células endoteliais), células cancerígenas (por exemplo, aquelas originárias do fígado, osso cervical, pâncreas, colorretal, próstata, epiderme, cérebro, mama, pulmão, testicular, renal, bexiga), organismos unicelulares de origem não humana, algas, fungos, bactérias, células vegetais, óvulos do parasita, plasmodia e micoplasma.

[0065] Se a espécie alvo for uma organela, a organela pode ser selecionada a partir de, mas não está limitada a, um ou mais núcleos, mitocôndrias, aparelho de Golgi, retículo endoplasmático, lisossomo, fagossomo, membranas intracelulares, membranas extracelulares, citoesqueleto, membrana nuclear, cromatina, matriz nuclear e cloroplastos.

[0066] Se a espécie alvo for um lipídeo, o lipídeo pode ser selecionado a partir de, mas não está limitado a, um ou mais lipídios de sinalização, lipídios estruturais, fosfolipídios, glicolipídios e ácidos graxos.

[0067] Se a espécie alvo for a sequência de ácido nucleico, a sequência de ácido nucleico pode ser selecionada a partir de, mas não está limitada a, um ou mais de DNA, cDNA, RNA, rRNA, mRNA, miRNA e tRNA.

[0068] Se a espécie alvo for um oligossacarídeo, o oligossacarídeo pode ser selecionado a partir de, mas não está limitado a, um ou mais dos oligossacarídeos de origem humana, animal, vegetal, fúngica ou bacteriana.

[0069] A espécie alvo pode ser qualquer antígeno ou analito que seja indicativo de uma doença específica.

O alvo pode ser selecionado a partir de, por exemplo, proteina NS1 da dengue, proteina C reativa (proteina CRP), enzima de conversão da angiotensina | (peptidil-dipeptidase A) 1; adiponectina; receptor específico para o produto final de glicosilação avançada; glicoproteina alfa-2-HS; angiogenina, ribonuclease, família da RNase A, 5; apolipoproteina A- 1; apolipoproteina B (incluindo o antígeno Ag(x)); apolipoproteina E; proteina X associada a BCL2; CLL de células B/ linfoma 2; complemento C3; ligando 2 de quimiocina (motivo C-C); CD 14, solúvel; CD 40, solúvel; cdk5; relacionado à pentraxina; catepsina B; dipeptidil peptidase IV; Fator de crescimento epidérmico; endoglina; Fas; fibrinogênio; ferritina; hormônio de crescimento 1; alanina aminotransferase; fator de crescimento de hepatócitos; haptoglobina; proteina de choque térmico 70kDa 1 B; molécula de adesão intercelular 1; fator de crescimento semelhante à insulina 1 (somatomedina C); receptor de fator de crescimento 1 semelhante a insulina; proteina 1 de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina; proteina 2 de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina; proteina 3 de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina; interleucina 18; receptor de interleucina 2 alfa; receptor de interleucina 2 beta; interleucina 6 (interferon beta 2); receptor de interleucina 6; transdutor de sinal de interleucina 6 (gp130, receptor de oncostatina M); interleucina 8; activina A; leptina (homólogo da obesidade, camundongo); ativador do plasminogênio, tecido; proopiomelanocortina (adrenocorticotropina/ beta-lipotropina/ hormônio estimulador de alfa-melanócitos/ hormônio estimulador de beta-melanócitos/ beta-endorfina); proinsulina; resistina; selectina e (molécula de adesão endotelial 1); selectina P (proteina da membrana granular 140kDa, antígeno CD62); inibidor de serpin peptidase, clado E (nexina, inibidor de ativador do plasminogênio tipo 1), membro 1; quinase regulada por soro/ glicocorticoide; globulina de ligação a hormônios sexuais; fator de crescimento transformador beta 1 (doença de Camurati-Engelmann); Inibidor de TIMP metalopeptidase 2; superfamília de receptores de fator de necrose tumoral, membro 1 B; molécula de adesão celular vascular 1 (VCAM-1); fator de crescimento endotelial vascular; produtos de degradação do fator Il, fator V, fator VIII, fator IX, fator XI, fator XII, F/ fibrina, complexo trombina-antitrombina III, fibrinogênio, plasminogênio, protrombina e fator de von Willebrand e similares. Marcadores úteis para diabetes incluem, por exemplo, proteina C reativa; glicose; insulina; TRIG; GPT; HSPA1 B; IGFBP2; LEP; ADIPOQ; CCL2; ENG; HP; IL2RA; SCp; SHBG; e TIMP2. As espécies alvo atualmente preferidas incluem uma espécie alvo selecionada a partir do grupo que consiste em proteina CRP, insulina e um marcador de um ou mais de neurodegeneração, câncer, infarto do miocárdio, diabetes e trauma geral. Outro exemplo de espécie alvo é a proteina NS1 da dengue.

[0070] A espécie alvo pode, por exemplo, compreender ou consistir em alfa-sinucleina (a-sync).

[0071] A espécie alvo pode ser um alvo associado ao monitoramento do diabetes. Em uma forma de realização, o alvo pode ser selecionado a partir de glicose, insulina, receptor alfa da interleucina 2 (IL2-RA), proteina C reativa (CRP) e hemoglobina glicada (HbAlc). Se a espécie alvo for glicose, as porções receptoras podem ser selecionadas a partir de, por exemplo, o elemento de reconhecimento molecular do ensaio GDH-FAD ou uma proteina de ligação glicose/ galactose (“GGBP”) (Scholle et al., Mol. Gen. Genet 208: 247- 253 (1987)). Se o alvo for IL-2RA, as porções receptoras podem compreender ou consistir em um anticorpo monoclonal específico para IL-2RA. Se a espécie alvo é ou compreende proteina C reativa, de preferência esta é uma proteina C reativa humana. Se a espécie alvo é ou compreende proteina C reativa, as porções receptoras podem compreender ou consistir em anti-CRP. Se a espécie alvo é ou compreende insulina, as porções receptoras podem compreender um anticorpo de insulina.

[0072] Exemplos de espécie alvo específicas atualmente de interesse particular incluem um antígeno ou analito selecionado a partir do grupo que consiste na enzima de conversão da angiotensina | (peptidil-dipeptidase A); adiponectina; receptor específico para o produto final de glicosilação avançada; glicoproteina alfa-2-HS; angiogenina, ribonuclease, família da RNase A, 5; apolipoproteina A-1; apolipoproteina B (incluindo o antígeno Ag(x)); apolipoproteina E; Proteina X associada a BCL2; CLL de células B/ linfoma 2; complemento C3; ligando 2 de quimiocina (motivo C-C); CD 14, solúvel; CD 40, solúvel; cdk5; relacionado à pentraxina; catepsina B; dipeptidil peptidase IV; Fator de crescimento epidérmico; endoglina; Fas; fibrinogênio; ferritina; hormônio de crescimento 1; alanina aminotransferase; fator de crescimento de hepatócitos; haptoglobina; proteina de choque térmico 70kDa 1 B; molécula de adesão intercelular 1; fator de crescimento semelhante à insulina 1 (somatomedina C); receptor de fator de crescimento 1 semelhante a insulina; proteina 1 de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina; proteina 2 de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina; proteina 3 de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina; interleucina 18; receptor de interleucina 2 alfa; receptor de interleucina 2 beta; interleucina 6 (interferon beta 2); receptor de interleucina 6; transdutor de sinal de interleucina 6 (gp130, receptor de oncostatina M); interleucina 8; activina A; leptina (homólogo da obesidade, camundongo); ativador do plasminogênio, tecido; proopiomelanocortina — (adrenocorticotropina/ — beta-lipotropina/ — hormônio estimulador de alfa-melanócitos/ hormônio estimulador de beta-melanócitos/ beta-endorfina); proinsulina; resistina; selectina e (molécula de adesão endotelial 1); selectina P (proteina da membrana granular 140kDa, antígeno CD62); inibidor de serpin peptidase, clado E (nexina, inibidor de ativador do plasminogênio tipo 1), membro 1; quinase regulada por soro/ glicocorticoide; globulina de ligação a hormônios sexuais; fator de crescimento transformador beta 1 (doença de Camurati-Engelmann); Inibidor de TIMP metalopeptidase 2; superfamília de receptores de fator de necrose tumoral, membro 1 B; molécula de adesão celular vascular 1 (VCAM-1); fator de crescimento endotelial vascular; produtos de degradação do fator Il, fator V, fator VIII, fator IX, fator XI, fator XII, F/ fibrina, complexo trombina-antitrombina III, fibrinogênio, plasminogênio, protrombina e fator de von Willebrand e similares. Marcadores úteis para diabetes incluem, por exemplo, proteina C reativa; glicose; insulina; TRIG; GPT; HSPA1 B; IGFBP2; LEP; ADIPOQ; CCL2; ENG; HP; IL2RA; SCp; SHBG; e TIMP2.

[0073] Embora a detecção por espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) de uma espécie alvo represente uma aplicação representativa e exemplar do eletrodo da invenção, o eletrodo também pode ser aplicado a outros usos, métodos e aparelhos. Por exemplo, impedância é uma técnica dependente do tempo, baseada em uma perturbação de onda senoidal. Assim, outras técnicas dependentes do tempo podem ser usadas como uma alternativa à impedância. Um exemplo de uma técnica alternativa é a voltametria de onda quadrada, que é uma técnica dependente de tempo baseada em uma perturbação de onda quadrada.

[0074] Assim, a presente invenção também se estende de maneira mais geral ao uso do eletrodo da invenção para detecção eletroquímica de uma espécie alvo, por exemplo, utilizando uma técnica eletroquímica dependente do tempo (incluindo, mas não se limitando a voltametria de onda quadrada). À presente invenção também se estende geralmente a um método eletroquímico de detecção de uma espécie alvo, cujo método compreende: (A) colocar em contato um meio transportador que pode compreender a referida espécie alvo com um eletrodo; (B) obter uma ou mais medições eletroquímicas do referido eletrodo; e (C) determinar a partir das referidas medições eletroquímicas se a espécie alvo está presente no meio transportador. As medições eletroquímicas podem ser medições de impedância ou outras medições eletroquímicas dependentes do tempo (incluindo, mas não se limitando a, medições voltamétricas de onda quadrada). Para evitar dúvidas, o exemplo de espécie alvo, meios transportadores e similares em relação a esses usos e métodos são como discutidos em outras partes deste documento.

Aparelho

[0075] A presente invenção também fornece um aparelho para uso em um método de detecção, tipicamente um método de detecção da presente invenção. Este aparelho compreende um espectrômetro eletroquímico compreendendo o eletrodo de trabalho como descrito aqui.

[0076] O aparelho opcionalmente compreende ainda (a) um receptor configurado para receber, a partir do referido espectrômetro eletroquímico, dados de entrada compreendendo uma pluralidade de medições de impedância complexa, Z*, através de uma faixa de potenciais aplicados; e (b) um processador configurado para (i) converter a referida pluralidade de medições de Z* em uma pluralidade de medições do componente real e/ ou imaginário da capacitância complexa, C' e/ ou C”, a uma frequência selecionada o e (ii) integrar as referidas medições de C', C" ou combinação de C' e C”, na frequência selecionada é em função da tensão aplicada para obter um valor de medição integrada. O receptor e o processador podem fazer parte de um computador. A funcionalidade do receptor e do processador pode ser alcançada através da programação do computador para receber dados de entrada do método da invenção e processar esses dados em um valor de medição integrada, como descrito aqui.

[0077] O receptor pode receber os dados de entrada diretamente do espectrômetro ou indiretamente, por exemplo, lendo os dados de um arquivo de dados criado pelo espectrômetro.

[0078] Por “programação” entende-se que o computador é fornecido com código legível por computador, fornecendo instruções para executar as etapas de recebimento dos dados de entrada, conversão em partes reais e/ ou imaginárias de capacitância complexa, C' e/ ou C”, e integração para obter um valor de medição integrada de maneira automática, por exemplo, sem intervenção de um usuário. O computador pode, por exemplo, compreender um computador físico que é programado com um programa de computador adequado. Esse programa pode, por exemplo, ser fornecido em um meio de armazenamento para implementação pelo computador ou por uma rede de computadores. O meio de armazenamento pode ser parte integrante do próprio computador, como um disco rígido, ou um meio de armazenamento removível, como um disco óptico ou dispositivo de armazenamento portátil, como um dispositivo de memória flash USB.

[0079] O aparelho pode, assim, ser utilizado para executar um método da presente invenção, pelo qual um operador realiza as medições necessárias (por exemplo, EIS) da etapa (A) do método da invenção usando o espectrômetro eletroquímico e em que as etapas subsequentes são então executado automaticamente para concluir o método de detecção.

[0080] O computador pode ainda ser programado para gerar dados gerados a partir do referido valor de medição integrada. Essa saída pode ser para um monitor e/ ou para um arquivo de computador e/ ou como um fluxo de dados para outro dispositivo. Esses dados podem compreender dados numéricos simples, correspondentes ao próprio valor de medição integrada. Alternativamente, os dados podem compreender uma indicação da presença, ausência ou concentração de uma substância sendo detectada ou uma indicação qualitativa ou quantitativa de um parâmetro ambiental detectado no sistema em estudo. Como será evidente para o técnico no assunto, o computador pode ser rotineiramente programado para fornecer esses dados, programando-o adicionalmente com valores de calibração (referência) relacionados ao valor de medição integrada.

[0081] Além disso, a invenção fornece um meio de armazenamento que armazena código legível por computador. Quando implementado, este código é capaz de fazer com que um receptor e processador, conforme definido aqui (isto é, como um computador, conforme explicado acima), execute as etapas associadas ao receptor e processador no aparelho da presente invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1: Eletrodos à base de peptídeo para biosensoriamento por EIS Reagentes químicos

[0082] A água ultra-pura foi obtida de um sistema Milli-Q 18,2 M x x cm e foi usada em todas as soluções. Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, resina Rink Amida e anidrido 3-ferrocenilpropiônico foram adquiridos da AAPPTEC e da Sigma Aldrich Co. (EUA). Todos os solventes e produtos químicos utilizados eram de grau analítico.

Aparelho eletroquímico

[0083] Um potenciostato Autolab equipado com um módulo FRA32 (METROHM Instruments) foi utilizado para medições eletroquímicas. Uma configuração de três eletrodos foi usada para as medições que consistem em um eletrodo de ouro de 2,0 mm de diâmetro da METROHM, um contra-eletrodo de malha de platina e um eletrodo de referência prata/ cloreto de prata (Ag | AgCl, preenchido com 3,0 M KCI). Todos os potenciais relatados são relativos a um eletrodo de referência Ag | AgCl.

Síntese dos Peptídeos marcados com Redox

[0084] Os vários peptídeos foram produzidos manualmente por síntese de peptídeos em fase sólida (SPPS) usando protocolos Fmoc em resina Rink Amida (0,48 mmol! 9”).

[0085] O acoplamento foi realizado com um excesso molar de 2 vezes em relação ao componente amino na resinay usando diisopropilcarbodiimida (Dic)! 1-hidroxibenzotriazol (HOBt). Os grupos Fmoc foram desprotegidos usando 4-metilpiperidina/ dimetilformamida a 20% (DMF)

por 1 e 20 min. Para os peptídeos da invenção, a sonda de ferroceno redox foi introduzida no N-terminal por reação com um equivalente molar de anidrido 3- ferrocenilpropiônico equivalente em 5 ml de DCM/ DMF (1: 1) por 24 h. À clivagem de peptídeo a partir da resina e a remoção dos grupos protetores de cadeia lateral foram realizadas com 94% de TFA, 2,5% de 1,2-etanoditiol, 2,5% de H2O e 1% de triisopropilsilano durante 2 h. Depois disso, o peptídeo foi precipitado com éter dietílico, separado do material não peptídico solúvel por centrifugação. O resíduo foi extraído em uma mistura 1: 1 de solvente A (0,045% (v/ v) de TFA/ H2O) e o solvente B (0,036% (v/ v) de TFA/ ACN) e liofilizado. O produto bruto foi purificado por HPLC em um Beckman System Gold usando uma coluna Phenomenex Jupiter C18 de fase reversa semi-preparativa (250 x 10 mm), embalada com partículas esféricas de 5 um e tamanho de poro de 300 À. Utilizou-se uma eluição de gradiente linear de 20 a 50% do solvente B durante 90 min. A taxa de fluxo foi de 5 ml! min”! à temperatura ambiente e o volume de injeção foi de 5 ml; A detecção por UV foi realizada a 220 nm. A pureza do peptídeo foi confirmada usando um sistema analítico Shimadzu com uma coluna Phenomenex Jupiter C18 de fase reversa (150 x 4,6 mm), empacotada com partículas esféricas de 5 um e tamanho de poro de 300 À, usando um gradiente linear de 5 a 95% do solvente B por 30 min, uma taxa de fluxo de 1,0 ml min' e detecção UV a 220 nm. A identidade do peptídeo foi analisada em um espectrômetro de massa com armadilha de íons usando um sistema Brucker no modo positivo, confirmando o peso molecular do peptídeo de 635 9/ mol.

Pré-tratamento do eletrodo

[0086] As superfícies dos eletrodos de ouro foram preparadas por polimento mecânico com blocos de óxido de alumínio com partículas de tamanho de 0,05 um. Os eletrodos foram polidos eletroquimicamente em 0,5 M de NaOH entre -0,7 V e -1,7 V (500 ciclos). Os eletrodos foram imersos em EtOH sob agitação por 20 min. Uma série de varreduras de maior alcance, de -0,1 a 14 V,

foram, em seguida, conduzidas em 0,5 M de H2SO4s a uma velocidade de varredura de 0,1 V s-1. O pico de redução da camada de óxido de ouro formada na varredura anódica foi utilizado para calcular a área eletroativa real do eletrodo (posteriormente utilizada na normalização).

Construção do sensor

[0087] O sensor foi preparado por imersão dos eletrodos de Au limpos em uma solução contendo 2 mM de peptídeo marcado com redox em H2O0/ ACN (1: 1) durante 16 h (25 ºC). Após ser muito enxaguado com água deionizada, os grupos carboxila da cadeia lateral do ácido glutâmico foram ativados com N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida a 0,4 M (EDC)/ N- hidroxissuccinimida a 0,1 M (NHS), usando uma solução aquosa solução por 30 min. Os eletrodos modificados foram então incubados em anti-CRP a 1 uM de anticorpo em PBS (solução) (pH 7,4) durante 1 h à temperatura ambiente; posteriormente, CV e EIS foram realizados para confirmar a imobilização do anticorpo. Para o peptídeo que contém Lys, depois de enxaguar abundantemente com água deionizada, os grupos carboxila do anti-CRP foram ativados com N-(3-dimetilaminopropil)-N “-etilcarbodiimida a 0,4 M (EDC)/ N- hidroxissuccinimida a 0,1 M (NHS), usando uma solução aquosa por 30 min. Os eletrodos modificados foram então incubados em anticorpo anti-CRP a 1 uM em PBS (solução) (pH 7,4) por 1 h em temperatura ambiente; posteriormente, CV e EIS foram realizados para confirmar a imobilização do anticorpo. A etapa final envolveu a incubação em solução de BSA a 0,1% por 30 minutos para desativar qualquer grupo carboxila ativo remanescente.

[0088] Uma curva de calibração foi obtida por imersão do biossensor em PBS (pH 7,4) contendo quantidades crescentes e específicas de CRP variando de 10 pM a 10 nM. O tempo de incubação foi de 30 minutos para cada concentração e os eletrodos foram lavados com solução de PBS antes da análise eletroquímica. A resposta relativa em várias concentrações de CRP foi definida como: RR %crP = ((RRcge — RRg1ank) + RRgiank ) X 100, onde RRCRP é o inverso da capacitância redox (1/ Cr) em uma concentração específica de CRP. Para avaliar a especificidade interfacial, o biossensor foi incubado em solução de HSA (1 mM) por 30 min e a capacitância redox foi medida.

Medições eletroquímicas

[0089] Todas as medições eletroquímicas foram realizadas em uma célula contendo 20 mM de eletrólito de suporte de TBACIO;, dissolvido em acetonitrila e água (1: 4 (V/ v)). O CV foi realizado a uma taxa de varredura de 100 mV s entre 0,0 V e 0,7 V em relação ao Ag | AgCl. As medições de impedância eletroquímica foram realizadas na faixa de frequência de CA de 100 kHz a 0,1 Hz com amplitude de 10 mV (pico a pico). O potencial de polarização de CC foi definido como o potencial formal do peptídeo marcado com ferroceno redox (0,36 V, determinado por CV). As medições foram verificadas quanto à conformidade com a teoria dos sistemas lineares de Kramers-Kronig. A espectroscopia de capacitância derivada da impedância foi realizada determinando a capacitância, usando a relação C*(wÀ) = 1/iwWZ"*(w), onde vw é a frequência angular e / é V(-1).

Resultados e discussão

[0090] Os eletrodos foram funcionalizados usando uma variedade de peptídeos diferentes para formar o SAM. Os eletrodos funcionalizados foram então submetidos a medições de EIS (usando CRP como uma espécie alvo representativa, utilizando anticorpo anti-CRP como receptor) para avaliar seu respectivo desempenho para aplicações de biossensibilidade. Os resultados estão resumidos na Tabela 1.

| nes [E A Estrutura peptídica por década detecção Yo nM Fe-Lis-Ala-Ala-Cys-NH> 10,50 +2,30 | 0,31 + 0,24 Tabela 1: Comparação entre desempenho de eletrodos com base em diferentes peptídeos

[0091] Na Tabela 1, Fc refere-se a uma espécie ativa de ferroceno redox. O anticorpo anti-CRP foi, em cada caso, ligado ao resíduo de aminoácido terminal não-cisteina (ou seja, Ala em Ac-Cys-Ala-Ala-Lys(Fc)-Ala-Ala-COOH, Lys em Fc-Lys-Ala-Ala-Cys-NH> e Glu em cada um dos Fc-Glu-Ala-Ala-Cys-NH2 e Fc-Glu-Ala-Ala-Ala-Cys-NH>). Ac-Cys-Ala-Ala-Lys(Fc)-Ala-Ala-cCOOH corresponde ao peptídeo descrito por Santos et al. em Biosensors e Bioelectronics 68 (2015) 281-287). O limite de detecção realizável para todos os Fc-Lys-Ala-Ala-Cys-NH2, Fc-Glu-Ala-Ala-Cys-NH2 e Fc-Glu-Ala-Ala-Ala-Cys- NH>2 foi encontrado como sendo melhor do que o alcançado usando Ac-Cys-Ala- Ala-Lys(Fc)-Ala-Ala-COOH. Particularmente sensibilidades elevadas foram alcançadas ao usar Fc-Lys-Ala-Ala-Cys-NH2 e Fc-Glu-Ala-Ala-Ala-Cys-NH2. À combinação ótima do limite de detecção e sensibilidade foi conseguida quando se utiliza Fc-Glu-Ala-Ala-Ala-Cys-NH>. Exemplo 2 : Estudos adicionais de eletrodos baseados em peptídeos para biossensibilidade por EIS Reagentes químicos

[0092] A 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), N- hidroxissuccinimida (NHS) e perclorato de tetrabutilamônio (TBA-CIO4) foram adquiridos da Sigma-Aldrich. A proteina C reativa humana (CRP) e o anticorpo policlonal humano (Ab) da CRP humana também foram adquiridas da Sigma- Aldrich, enquanto a interleucina-6 (IL-6) e a IL-6 Ab foram compradas da Rhea

Biotech.

[0093] O peptídeo utilizado como suporte para os receptores foi o Fc-Glu-Ala-Ala-Cys, sintetizado manualmente por síntese de peptídeos em fase sólida, utilizando protocolos Fmoc na resina rink amina (0,48 mmol g). O acoplamento foi realizado com um excesso molar de 2 vezes em relação ao componente amino na resina, usando diisopropilcarbodiimida (Dic 1- hidroxibenzotriazol (HOBt). Os grupos Fmoc foram desprotegidos usando 4- metilpiperidina/ dimetilformamida a 20% (DMF) por 80 min. A sonda de ferroceno redox foi introduzida no N-terminal por reação com um equivalente molar de anidrido 3-ferrocenilpropiônico em 5 ml de DOM/ DMF (1: 1) por 24 h. A clivagem do peptídeo foi realizada através da remoção dos grupos de proteção de cadeia lateral com 94% de ácido trifluoroacético (TFA), 2,5% de 1,2-etanoditiol, 2,5% de H2O e 1% de triisopropilsilano durante 2 h. O peptídeo foi então precipitado com éter dietílico e separado da solução reacional por centrifugação.

[0094] Solução salina tamponada com fosfato (PBS) foi preparada usando as seguintes concentrações de sal: 8 g L' de NaCl, 0,2 gL de KH2PO:, 1,15 gL de NaH2PO. * 12H20, 0,2 g L? de KCl e 0,2 g L'? de NaNO;, atingindo um pH esperado de 7,4.

Breve descrição dos receptores e dos biomarcadores alvo

[0095] A CRP é uma proteina sintetizada pelo fígado. A CRP existe na forma de pentâmeros com protômeros idênticos, levando a uma proteina de — 118 kDa. A CRP, que está presente no sangue de indivíduos saudáveis, serve como biomarcador de inflamação causada por infecção ou lesão, hipertensão e doenças cardiovasculares. Níveis séricos de CRP superiores a 3,0 mg L' são indicativos de risco de diabetes.

[0096] A IL-6 humana é uma glicoproteina de 26 kDa e um membro da família das citocinas, que afeta as funcionalidades do sistema imunológico. Está envolvida no processo de diferenciação das células mieloides e nas funções homeostática e neuroendócrina. A superexpressão da IL-6 está associada a doenças cardiovasculares, osteoporose, diabetes, artrite e tumores. O interesse crescente tem se concentrado na associação de IL-6 com doenças cardiovasculares.

Pré-tratamento do eletrodo

[0097] As superfícies dos eletrodos de ouro foram polidas mecanicamente usando blocos de óxido de alumínio (1 um, 0,3 um e 0,05 um) e polidas eletroquimicamente em solução de NaOH a 0,5 M (100 ciclos de -1,7 V a -0,7 V a uma taxa de varredura de 0,1 V s!). Após a limpeza eletroquímica, os eletrodos foram imersos em etanol puro por 30 min. O processo de polimento eletroquímico foi concluído com varreduras de voltametria cíclica (CV) em 0,5 M de H2SOa solução a 80 ºC (50 varreduras foram realizadas a partir de -0,2V a 1,5 V com uma velocidade de varredura de 0,1 V s!). A área do pico de redução obtida nessas medições de CV depende da área de superfície ativa do ouro. À área eletroativa da superfície de ouro polido pode ser obtida usando um fator de conversão de 410 uC cm?, que é a carga associada ao pico de redução. A razão da área eletroativa para a área geométrica do eletrodo (0,03142 cm?) é denominada rugosidade eletroquímica de superfície, que deve ser preferencialmente mantida abaixo de 1,5 para garantir propriedades de filme molecular confiáveis e estáveis.

Medições eletroquímicas

[0098] As medições de impedância eletroquímica (EIS) foram realizadas em um potenciostato AUTOLAB (da METROHM) equipado com um módulo de análise de resposta em frequência (FRA) usando um sistema de três eletrodos: um eletrodo de trabalho em disco de ouro (2,0 mm de diâmetro da METROHM, polido conforme descrito acima), um contra-eletrodo de placa de platina e um eletrodo de referência de prata/ cloreto de prata (Ag | AgCI, preenchido com KCI a 3,0 M). Todos os potenciais relatados neste exemplo são relativos a esta referência. Os dados de EIS foram adquiridos no potencial formal (cerca de 0,45 V) dos trocadores redox, ou seja, casal ferrocênio/ ferroceno redox, em frequências variando de 1 MHz a 0,1 Hz, com perturbação sinusoidal de amplitude de 20 mV (pico a pico). Os espectros de EIS também foram examinados para garantir que a relação Kramers-Kronig de invariância no tempo fosse satisfeita. Os diagramas de espectroscopia de capacitância foram obtidos pela conversão da impedância complexa (Z*) em capacitância complexa (C*), usando a relação C*(w) = 1/joZ*(w), onde & é a frequência angular e j é a raiz quadrada de -1.

[0099] As medições de CV foram tomadas de -0,0 V a 0,7 V a uma taxa de varredura de 0,1 V s* para determinar o potencial formal em que os espectros de impedância foram registrados. As medições eletroquímicas dos eletrodos de ouro modificados quimicamente foram realizadas em 20 mM de TBA-CIO;: dissolvido em acetonitrila e água (1: 4 v/ v) como eletrólito de suporte. A presença de acetonitrila melhora ligeiramente a estabilidade redox e permite a dissolução de TBA-CIO4. Foi confirmado que o TBA-CIO« não tem influência prejudicial sobre o reconhecimento específico. Além disso, em estudos anteriores (Bueno, P. R.; Fernandes, F. C. B.; Davis, J. J. Nanoscale 2017, 9, 15362-15370), a constante de ligação de equilíbrio resolvida após este protocolo foi confirmada, dentro de um erro experimental, como sendo a mesma observada em Solução de PBS.

Fabricação da interface de biossensor

[00100] As junções moleculares redox-ativas foram obtidas quimicamente imergindo os eletrodos de disco de ouro recém limpos em soluções contendo trocadores de ferroceno redox por 16 h em temperatura ambiente. Eletrodos de ouro foram modificados usando soluções de 2 mM de peptídeos diluídos em acetonitrila e água [1: 1 (V/ v)]. Depois de modificar quimicamente os eletrodos, eles foram lavados brevemente em água deionizada e secos em nitrogênio. Os eletrodos de ouro modificados quimicamente foram imersos por 30 min em 200 ul de uma solução aquosa contendo EDC a 0,4 Me NHS a 0,1 M para ativar os grupos carboxílicos presentes nos peptídeos, após o que foram incubados por 1 h em soluções contendo receptores (1 uM em PBS). Após imobilização dos receptores, os eletrodos foram limpos com PBS, água destilada e secos sob nitrogênio, antes da caracterização por CV e EIS.

[00101] Os grupos carboxílicos não ligados foram bloqueados com solução de BSA a 0,1% contida em PBS (pH 7,4) por 30 min. Eletrodos modificados com peptídeos contendo os trocadores redox foram usados para detectar glicoproteina IL-6 humana ou CRP. Isto foi feito imobilizando o anticorpo IL-6, o anticorpo CRP (Ab) ou um aptâmero de DNA de CRP na monocamada peptídica. Após a construção da plataforma receptiva, sua estabilidade foi testada imergindo os eletrodos por 30 min em PBS (pH 74) e caracterizando-os por EIS. Este processo foi repetido três vezes em cada um dos ensaios; aqueles que variaram em menos de 5% das medições em branco foram considerados ensaios estáveis, sem deriva, prontos para uso.

[00102] Para testar os diferentes ensaios, as soluções foram preparadas em concentrações crescentes dos alvos, deixando o eletrodo cair por 30 min, seguido de limpeza em PBS e água destilada e secagem com nitrogênio para medições eletroquímicas subsequentes. Por exemplo, uma interface receptiva contendo aptâmeros de DNA de CRP Ab ou de CRP imobilizados no peptídeo redox foi usada para reagir com soluções contendo CRP em concentrações variando de 10 pM a 10.000. Uma monocamada peptídica redox foi usada para suportar uma camada de bioreconhecimento baseada em IL-6 Ab, que foi usada para interagir com IL-6 em concentrações variando de 750 pM a 380.000 pM. Todos os ensaios foram realizados incubando o alvo em meio PBS. A especificidade foi assegurada por testes de estabilidade e um controle negativo, ambos realizados por medições sucessivas em PBS

(pelo menos três repetições), a fim de garantir a estabilidade. O controle negativo foi avaliado especificamente por incubação em soluções de PBS contendo proteinas inespecíficas, tais como albumina sérica humana (HSA), fetuina ou BSA em concentrações crescentes e equivalentes às utilizadas para a detecção do alvo. Nenhuma variação significativa foi encontrada nos testes de estabilidade ou controle negativo (dentro de RR < 5%).

[00103] Os ensaios foram realizados com três eletrodos de trabalho diferentes e os erros padrão foram calculados a partir dessas repetições. As curvas analíticas foram obtidas através da representação gráfica da resposta relativa em percentagem, RR% = emrarço: -— cm cmo 100, de 1/C, em relação à concentração dos alvos. C, foi obtido como o componente real do gráfico de capacitância de Nyquist. A sensibilidade foi determinada a partir da inclinação da curva analítica construída usando a relação entre RR% e as concentrações alvo.

Resultados e discussão

[00104] Foi levantada a hipótese de que a sensibilidade do sistema EIS à concentração alvo dependeria da intimidade do acesso de espécies alvo ligadas à superfície do eletrodo e, portanto, da relação entre os tamanhos relativos das espécies alvo e receptoras (aproximada, por exemplo, por seus pesos moleculares relativos) Este princípio é ilustrado esquematicamente na Figura 1, que ilustra várias conformações e configurações estruturais. Como a sensibilidade foi predita como sendo influenciada pelo alcance do efeito de campo, que por sua vez é governado pela escala de comprimento associada a 1/C,, então: a) ilustra os casos em que uma sensibilidade intermediária é predita, enquanto b) ilustra a melhor sensibilidade esperada (acesso mais íntimo) e c) mostra o pior (acesso menos íntimo).

[00105] Para corroborar esta hipótese, foram realizadas experimentos usando o eletrodo funcionalizado com peptídeo e para comparar: (i) detecção de alvo de CRP usando um anticorpo ou receptor de aptâmero; e (ii) detecção do alvo de CRP ou alvo de IL-6 usando receptores de anticorpos.

[00106] A RR% em função da concentração alvo da CRP para (i) é mostrado na Figura 2, onde fica claro que foi obtida uma sensibilidade mais alta ao usar um aptâmero em vez do receptor de anticorpos e, portanto, quando a razão de pesos alvo: receptor foi maior (devido ao peso molecular muito mais baixo do receptor de aptâmero em comparação com o receptor de anticorpos). Para (ii), verificou-se que a proteina do receptor Ab-IL-6 testada de 150 kDa não conseguiu detectar sensivelmente as pequenas espécies alvo de IL-6 de apenas 26 kDa. Os resultados estão resumidos na Tabela 2.

alvo/ receptor) receptor) TESTE: TS O Rr O Rr Tabela 2: Comparação entre desempenho de eletrodos com base em diferentes pesos moleculares relativos de alvo e receptor

[00107] Assim, sistemas de ensaios com maior sensibilidade podem ser obtidos aumentando a razão entre o peso molecular da espécie alvo e o peso molecular da espécie receptora.

Exemplo 3: Aplicação do eletrodo ao diagnóstico do vírus da dengue

[00108] As medições de EIS foram realizadas usando um sistema de eletrodos construído e operado da mesma maneira que no Exemplo 1, com a exceção de que a espécie receptora era o anticorpo NS1 da dengue para detecção da proteina NS1 da dengue em amostras biológicas (sangue) obtidas de pacientes em São Paulo, Brasil. O peptídeo utilizado como suporte para os receptores foi Fc-Glu-Ala-Ala-Cys.

[00109] As amostras biológicas utilizadas foram amostras de sangue de dengue (positivas ou negativas). O ensaio foi realizado em condições cegas, nas quais não se sabia com antecedência quais amostras eram positivas (ou seja, continham proteina NS1 da dengue indicativa de infecção no paciente) ou negativas (não continham proteina NS1 da dengue).

[00110] Os resultados são mostrados na Figura 3. A resposta em % corresponde a: [(1/Cnrarger = 1 Gpiane) MU Capranel 100.

[00111] foi obtido como o componente real do gráfico de capacitância de Nyquist do espectro de impedância.

[00112] Como pode ser visto na Figura 3, o teste foi prontamente capaz de distinguir clara e inequivocamente entre amostras positivas e negativas, isto é, é adequado para o diagnóstico do vírus da Dengue. O sucesso do ensaio foi atribuído, pelo menos em parte, às seguintes propriedades do componente peptídico do eletrodo: (a) sua alta estabilidade que evita problemas de deriva que interferem na detecção; e (b) suas propriedades não incrustantes superiores que evitam a ligação não específica.

Claims (25)

REIVINDICAÇÕES

1. ELETRODO PARA USO NA DETECÇÃO ELETROQUÍMICA DE UMA ESPÉCIE ALVO, caracterizado pelo eletrodo compreender: (i) um substrato eletricamente condutor; (ii) uma monocamada peptídica compreendendo uma pluralidade de moléculas de peptídeo que são cada uma: (a) disposta sobre o substrato; (b) ligada a uma espécie ativa redox; e (c) ligada a um receptor que é capaz de se ligar à espécie alvo; em que: - as moléculas de peptídeos têm de três a cinco resíduos de aminoácidos de comprimento, incluindo um primeiro resíduo de aminoácido terminal que é adjacente ao substrato e um segundo aminoácido terminal; e - as espécies ativas redox e o receptor estão ligados, cada um, ao segundo aminoácido terminal.

2. ELETRODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo eletrodo ser para uso na detecção por espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) de uma espécie alvo.

3. ELETRODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelas moléculas de peptídeos terem cada uma quatro resíduos de aminoácidos de comprimento.

4. ELETRODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo primeiro resíduo de aminoácido terminal ser um resíduo de cisteina.

5. ELETRODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo primeiro resíduo de aminoácido terminal ser o resíduo de aminoácido C-terminal de cada uma das moléculas de peptídeo.

6. ELETRODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo segundo aminoácido terminal ser selecionado a partir do grupo que consiste em ácido glutâmico, lisina, ácido aspártico, arginina, histidina, cisteina e tirosina.

7. ELETRODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo segundo resíduo de aminoácido terminal ser ácido glutâmico ou lisina.

8. ELETRODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo segundo resíduo de aminoácido terminal ser ácido glutâmico.

9. ELETRODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelas moléculas de peptídeo terem um a três resíduos de aminoácidos não terminais entre o primeiro resíduo de aminoácido terminal e o segundo aminoácido terminal e em que o um a três resíduos de aminoácidos não terminais compreendem um ou mais resíduos de alanina.

10. ELETRODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por cada um dos um a três resíduos de aminoácidos não terminais ser um resíduo de alanina.

11. ELETRODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelas moléculas de peptídeos terem uma sequência selecionada a partir de Glu-Ala-Ala-Cys, Glu-Ala-Ala-Ala-Cys, Lys- Ala-Ala-Cys e Lys-Ala-Ala-Ala-Cys, e de preferência em que o C-terminal das moléculas de peptídeo é amidado.

12. ELETRODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pela monocamada peptídica ser uma monocamada de montagem automática.

13. ELETRODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo receptor ser selecionado a partir do grupo que consiste em aptâmeros, anticorpos, fragmentos de anticorpos,

oligossacarídeos, peptídeos e proteinas.

14. ELETRODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo receptor ser um aptâmero.

15. ELETRODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pela espécie ativa redox ser um complexo químico metálico compreendendo um metal de transição, tal como Fe, Ru, Ti, V, Mn, Cr, Co, Ni, Nb ou Mo ou azul de metileno.

16. ELETRODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pela espécie ativa redox ser um ferroceno.

17. ELETRODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo substrato eletricamente condutor ser um substrato de ouro.

18. ELETRODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pela espécie alvo ser um antígeno ou analito selecionado a partir do grupo que consiste em proteina NS1 da dengue, enzima de conversão da angiotensina | (peptidil-dipeptidase A) 1; adiponectina; receptor específico para o produto final de glicosilação avançada; glicoproteina alfa-2-HS; angiogenina, ribonuclease, família da RNase A, 5; apolipoproteina A-1; apolipoproteina B (incluindo o antígeno Ag(x)); apolipoproteina E; proteina X associada a BCL2; CLL de células B/ linfoma 2; complemento C3; ligando 2 de quimiocina (motivo C-C); CD 14, solúvel; CD 40, solúvel; cdk5; relacionado à pentraxina; catepsina B; dipeptidil peptidase IV; Fator de crescimento epidérmico; endoglina; Fas; fibrinogênio; ferritina; hormônio de crescimento 1; alanina aminotransferase; fator de crescimento de hepatócitos; haptoglobina; proteina de choque térmico 70kDa 1 B; molécula de adesão intercelular 1; fator de crescimento semelhante à insulina 1 (somatomedina C); receptor de fator de crescimento 1 semelhante a insulina; proteina 1 de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina; proteina 2 de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina; proteina 3 de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina; interleucina 18; receptor de interleucina 2 alfa; receptor de interleucina 2 beta; interleucina 6 (interferon beta 2); receptor de interleucina 6; transdutor de sinal de interleucina 6 (gp130, receptor de oncostatina M); interleucina 8; activina A; leptina (homólogo da obesidade, camundongo); ativador do plasminogênio, tecido; proopiomelanocortina (adrenocorticotropina/ beta-lipotropina/ hormônio estimulador de alfa-melanócitos/ hormônio estimulador de beta-melanócitos/ beta-endorfina); proinsulina; resistina; selectina e (molécula de adesão endotelial 1); selectina P (proteina da membrana granular 140KkDa, antígeno CD62); inibidor de serpin peptidase, clado E (nexina, inibidor de ativador do plasminogênio tipo 1), membro 1; quinase regulada por soro/ glicocorticoide; globulina de ligação a hormônios sexuais; fator de crescimento transformador beta 1 (doença de Camurati-Engelmann); Inibidor de TIMP metalopeptidase 2; superfamília de receptores de fator de necrose tumoral, membro 1 B; molécula de adesão celular vascular 1 (VCAM-1); fator de crescimento endotelial vascular; produtos de degradação do Fator Il, Fator V, Fator VIII, Fator IX, Fator XI, Fator XII, F/ fibrina, complexo trombina-antitrombina III, fibrinogênio, plasminogênio, protrombina e fator de von Willebrand e similares e marcadores úteis para diabetes incluem, por exemplo, proteina C reativa; glicose; insulina; TRIG; GPT; HSPA1 B; IGFBP2; LEP; ADIPOQ; CCL2; ENG; HP; IL2RA; SCp; SHBG; e TIMP2.

19. ELETRODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pela razão do peso molecular da espécie alvo, Mw2"Yº (kDa), e o peso molecular da espécie receptora, MyººePto" (kDa), é pelo menos 0,5, mais preferencialmente pelo menos 1,0, mais preferencialmente ainda pelo menos 10 e particularmente preferencialmente pelo menos 25.

20. —“ESPECTRÔMETRO ELETROQUÍMICO, caracterizado por compreender um eletrodo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19.

21. USO DE UM ELETRODO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pela detecção eletroquímica de uma espécie alvo.

22. USO DE UM ELETRODO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo referido sensor eletroquímico ser um sensor de impedância eletroquímica (EIS).

23. “MÉTODO ELETROQUÍMICO DE DETECÇÃO DE UMA ESPÉCIE ALVO, caracterizado pelo método compreender: (A) colocar em contato um meio transportador que pode compreender a referida espécie alvo com um eletrodo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19; (B) obter uma ou mais medições eletroquímicas do referido eletrodo; e (C) determinar a partir das referidas medições eletroquímicas se a espécie alvo está presente no meio transportador.

24. "MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo referido método eletroquímico ser um método de espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) e, de preferência, ser um método de espectroscopia de capacitância eletroquímica (ECS).

25. — MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 24, caracterizado pela etapa (C) compreender determinar a concentração da espécie alvo.

a) FP” PA >) , 9 A Á b Á h 7 7 o DD Interface A É O ma E E Biodetectora IO AR LCA Transdutor codochohodooo oodpockchodhon codochcoodhon CEA AA CEIA AAA QI AA AAA Eletrodo “vu lsolante O Receptor o Trocador Redox Alvo Figura 1 300 22 a) 18 b) 250 o 15 200 Fo | Ep = 150 | ( < 9 é 100 / + º 6 50 3 é o o 10 10 10º 10º 10 10º 10 Log [CRP] (pM) Log [CRP] (pM) Figura 2

SE 3 o 8: on

O x 7 pp—cs— o Positivo Negativo Figura 3

Resumo “ELETRODO PARA USO NA DETECÇÃO ELETROQUÍMICA DE UMA ESPÉCIE ALVO, ESPECTRÔMETRO ELETROQUÍMICO, USO DE UM

ELETRODO E MÉTODO ELETROQUÍMICO DE DETECÇÃO DE UMA ESPÉCIE ALVO” O presente pedido refere-se a um eletrodo adequado para uso na detecção eletroquímica de uma espécie alvo. O eletrodo compreende uma monocamada peptídica de comprimento definido e a uma extremidade da qual estão ligados uma espécie ativa redox e um receptor que é capaz de se ligar à espécie alvo. Também é fornecido um método eletroquímico de detecção de uma espécie alvo, que envolve o uso do eletrodo.