CN109071436B - 一种吲哚生物碱类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种吲哚生物碱类化合物的制备方法和用途。本发明用采自南极普利兹湾深海海域的壳青霉PRB‑2(Penicillium crustosum PRB‑2)及化学合成的方法生产出结构新颖的吲哚生物碱类化合物。本发明的吲哚生物碱在体外和体内活性测试时均具有较好的抗甲型流感病毒活性，可作为新型滴鼻剂，鼻喷雾剂或口服制剂抗病毒药，用于预防和治疗甲型流感病毒感染。

Description

一种吲哚生物碱类化合物及其制备方法和用途

技术领域：

本发明涉及用壳青霉PRB-2(Penicillium crustosum PRB-2)(保藏编号是:CGMCC11573保藏日期：2015年11月03日)生产一种吲哚生物碱类化合物的方法、化学合成该类化合物的方法；本发明还涉及该类化合物在抗甲型流感病毒中的用途。

背景技术：

本发明人将壳青霉PRB-2(Penicillium crustosum PRB-2)(保藏编号是:CGMCC11573)在液体培养基中培养时添加吲哚(终浓度150mg/L)，从得到的发酵产物中分离出一个吲哚生物碱类化合物，且该化合物可以通过化学合成的方法获得。研究发现所示该吲哚生物碱化合物具有显著的抗病毒活性，表明上述吲哚生物碱进一步有可能开发成新型抗病毒药物。

发明内容：

本发明的目的是提供一种结构新颖的具有抗病毒活性的吲哚生物碱类化合物。

本发明的另一目的是提供该吲哚生物碱类化合物的生产方法。

本发明特别涉及如下实施方案：

1.式I＇化合物或其药学上可接受的盐

其中R₁为H、C_1-6烷基、C_2-6烯基或C_2-6炔基；

R₂相互独立地为H、卤素、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_2-6烯基、C_2-6烯氧基、C_1-6炔基或C_2-6炔氧基；

R₃相互独立地为H、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_2-6烯基、C_2-6烯氧基、C_2-6炔基或C_2-6炔氧基；

n为1、2、3或4。

2.结构如下式所示的化合物

3.实施方案2所述化合物的制备方法，其特征是发酵培养壳青霉PRB-2(Penicillium crustosum)，并添加吲哚(在培养基中的终浓度为150mg/L)，获取含有上述化合物的发酵物，然后从发酵物中分离纯化出该化合物。

4.实施方案3的制备方法，其中发酵使用的培养基组成(克/升)为：可溶性淀粉40.0，酵母膏1.0，味精2.0，蔗糖40.0，麦芽糖30.0，黄豆粉0.5，蛋白胨2.0，MgSO₄·7H₂O0.3，KH₂PO₄0.5。

5.实施方案3的制备方法，其中发酵条件为：在20℃-30℃内优选28℃静置培养，培养时间在20-40天内优选30天。

6.实施方案3所述的制备方法，其中将所述发酵物经Sephadex LH20凝胶柱层析，甲醇为溶剂，再经反相中压MPLC及反相半制备HPLC分离纯化得该化合物。

7.实施方案1或2所述化合物的化学合成方法，其包括

使式III化合物

其中R₃如实施方案1中所定义；

与式IV化合物

其中n、R₁、R₂如权利要求1中所定义；

在有机溶剂中在90-150℃、优选100-120℃、最优选110℃反应3h，得到实施方案1的式I＇化合物。

在实施方案7中，有机溶剂优选自非质子性溶剂二氧六环、DMSO、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃和二氯甲烷等，更优选二氧六环。

在实施方案7中，优选地，式IV化合物的R₁、R₂为氢或甲基；和/或式III化合物的R₃为甲基。

8.实施方案7的合成方法，其还包括制备式III化合物的以下步骤：

a)使化合物1

在溶剂THF中与还原剂NaBH₃(CN)反应，得到化合物2，

b)在BF₃·Et₂O存在下使化合物2与R₃COOH反应，得到式II化合物

其中R₃如实施方案1中所定义；

c)使式II化合物与HCHO、NaOAc、AcOH反应，得到式III化合物，

其中R₃如实施方案1中所定义。

实施方案8的步骤a的反应在室温(r.t.)进行，反应2h。

实施方案8的步骤b的反应在90℃进行，反应16h。

实施方案8的步骤c的反应在80℃进行,反应16h。

实施方案8中，式II和式III化合物的R₃优选为甲基。

9.药物组合物，其包含实施方案1或2中的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的赋形剂。

实施方案9的药物组合物优选地为片剂、溶液剂、混悬剂形式的，更优选地为滴鼻剂或鼻喷雾剂形式的。

10.实施方案1或2所述化合物在制备抗病毒药物中的用途。

在实施方案10中，优选地，所述病毒为甲型流感病毒，例如H1N1(A/California/04/2009；Cal09)，H1N1(A/PR8/34；PR8)和H3N2(A/swine/Minnesota/02719/2009；Minnesota)。

本发明的化合物可以通过任意适宜的给药途径包括口服和胃肠外途径来进行给药。胃肠外给药包括静脉内、肌内和皮下注射、输注或经鼻给药。口服途径给药的制剂包括但不限于片剂、溶液剂、混悬剂等。经鼻给药的制剂包括但不限于滴鼻剂或鼻喷雾剂。

因此，在实施方案10中，优选地，所述药物为口服和胃肠外给药的药物，优选地为片剂、溶液剂、混悬剂，更优选地为滴鼻剂或鼻喷雾剂。

当描述本发明的化合物时，除非上下文另外指示，使用的术语按照以下定义解释。在本文没有定义的术语和简称以本领域的通用含义理解。

文中所用的术语“卤素”包括例如氟、氯、溴或碘。

文中所用的术语“烷基”指完全饱和的支链的或无支链的烃基团。烷基优选包含1-20个碳原子，更优选1-6个碳原子、1-4个碳原子或1-2个碳原子。烷基的代表性示例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基和正己基等。

文中所用的术语“烷氧基”指烷基-O-，其中烷基是上文所定义的。优选地，烷氧基含有1-6个、优选1-4个、更优先1-2个碳。烷氧基的代表性示例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、2-丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基、环丙基氧基、环己基氧基等。

文中所用的术语“烯基”指具有一个或多个碳-碳双键的支链或无支链的烃基团。烯基优选包含2-20个碳原子，更优选2-6个碳原子、2-4个碳原子或2-3个碳原子。烯基的代表性示例包括但不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基等。

文中所用的术语“烯氧基”指烯基-O-，其中烯基是上文所定义的。烯氧基优选包含2-6个碳原子、更优选2-4个碳原子或2-3个碳原子。烯氧基的代表性示例包括但不限于乙烯氧基、丙烯氧基、丁烯氧基等。

文中所用的术语“炔基”指具有一个或多个碳-碳叁键的支链或无支链的烃基团。炔基优选包含2-20个碳原子，更优选2-6个碳原子、2-4个碳原子或2-3个碳原子。炔基的代表性示例包括但不限于乙炔基、丙炔基、丁炔基等。

文中所用的术语“炔氧基”指炔基-O-，其中炔基是上文所定义的。炔氧基优选包含2-6个碳原子、更优选2-4个碳原子或2-3个碳原子。炔氧基的代表性示例包括但不限于乙炔氧基、丙炔氧基、丁炔氧基等。

文中所用的术语“药学上可接受的盐”指保持本发明化合物的生物学效应和性能的盐，并且该盐在生物学上或其它方面不是不被期望的。所述盐的非限制性示例包括本发明化合物的无毒的、无机或有机的碱或酸的加成盐。在许多情况下，由于碱性或酸性基团的存在，本发明化合物能够形成酸盐和/或碱盐。可以用无机酸和有机酸形成药学上可接受的酸加成盐。可以由其衍生得到盐的无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。可以由其衍生得到盐的有机酸包括例如乙酸、丙酸、羟基乙酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。可以用无机和有机碱形成药学上可接受的碱加成盐。可以由无机碱衍生得到的盐包括例如钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝盐等；特别优选的是铵、钾、钠、钙和镁盐。可以由其衍生得到盐的有机碱包括例如伯胺、仲胺和叔胺、取代的胺(包括天然存在的取代的胺)、环状的胺等，尤其例如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺和乙醇胺。其它合适的盐的清单可以见于Remington氏药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)，第20版，Mack出版公司(Mack Publishing Company)，Easton，Pa.，(1985)，将其引入文中作为参考。

文中所用的术语“药学上可接受的赋形剂”包括在制备药物组合物时可以使用的任何溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、所述类似的物质和其组合，其是本领域普通技术人员所公知的，见，例如，Remington氏药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)，第18版，Mack出版公司(Mack Printing Company)，1990，pp.1289-1329，引入文中作为参考。

附图说明

图1：化合物I的化学合成方法。

图2：化合物I的体外抗甲型流感病毒作用。A)化合物I对于病毒PR8(MOI＝0.1)的抑制作用。B)化合物I对于病毒的直接灭活作用。C)化合物I抗病毒的广谱性。D)化合物I的病毒抗药性。

图3：化合物I通过靶向HA蛋白抑制甲型流感病毒复制。A)化合物I在体外发挥作用的阶段测试。HA滴度为Mean±S.D.(n＝3)，*P<0.05vs.病毒对照组。B)化合物I对于PR8毒株的NA蛋白活性的抑制作用。C)化合物I和抗HA抗体对甲型流感病毒株Cal09，PR8和H3N2(Minnesota)中的鸡红细胞凝集的抑制效果。D)化合物I对病毒HA介导的膜融合的抑制作用。

图4：化合物I的体内抗甲型流感病毒活性评价。A)化合物I对感染甲型流感病毒小鼠肺部病毒滴度的影响。数值为±S.D.(n＝4)，Significance：*P<0.05，**P<0.01vs.病毒对照组。B)化合物I对感染甲型流感病毒小鼠的生存率的影响。Significance：*P<0.05，**P<0.01vs.安慰剂组。C)化合物I对感染甲型流感病毒小鼠体重的影响。数值为±S.D.(n＝6)。D)化合物I对小鼠肺部组织所产生的细胞因子TNF-α和IL-6量的影响。数值为±S.D.(n＝3)，Significance：##P<0.01vs.正常组；*P<0.05，**P<0.01vs.病毒对照组。

本发明的化合物Ⅰ可通过微生物在含吲哚的发酵培养条件下来获取含有该类化合物的发酵物，然后从发酵物中采用Sephadex LH20凝胶柱层析，反相中压MPLC，反相半制备HPLC方法分离纯化得到；该化合物还可以通过化学合成的方法获得。

本发明的下述实施例中列举了利用PRB-2(Penicillium crustosum PRB-2)(保藏编号是:CGMCC 11573)制备本发明式Ⅰ化合物的实例、化学合成本发明式Ⅰ化合物的实例及本发明式Ⅰ化合物的抗病毒活性测试的实例。

具体实施方式：

在如下的实施例中所指的化合物Ⅰ的化学结构(结构式中的阿拉伯数字是化学结构中碳原子或氮原子的标位)是：

实施例1化合物Ⅰ的发酵生产及分离精制

1.发酵生产

生产菌的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取壳青霉PRB-2(Penicilliumcrustosum PRB-2)(保藏编号是:CGMCC 11573)适量，接种到PDA固体平面培养基上，在28℃培养箱中培养4天。

取固体平面培养4天的壳青霉PRB-2(Penicillium crustosum PRB-2)适量，接种到装有300mL培养基[培养基组成(克/升)：可溶性淀粉40.0，酵母膏1.0，味精2.0，蔗糖40.0，麦芽糖30.0，黄豆粉0.5，蛋白胨2.0，MgSO₄·7H₂O 0.3，KH₂PO₄0.5]的1000mL锥型瓶中，并加入吲哚(45mg，由500μL DMSO溶解)，使其在培养基中的终浓度为150mg/L，在28℃条件下静置培养30天，获得发酵产物。

2.浸膏的获得

将所得发酵液直接用等量乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯相，减压浓缩，得粗浸膏，共1.2克。

3.化合物的分离精制

浸膏(1.2克)用甲醇溶解后，以甲醇为溶剂进行LH20柱层析，分为4个流份。组分2先以C-18 ODS中压柱层析，以甲醇-水为溶剂进行梯度洗脱，最后经反相半制备高效液相色谱(甲醇：水＝75:25)得化合物Ⅰ(15mg)。

化合物Ⅰ乳白色粉末，分子式C₂₈H₂₇NO₆，HR-ESI-MS m/z:474.1910[M+H]⁺，计算值474.1911。IR(KBr)v_max3345，2923，1625，1330，744cm^-1。¹H和¹³C-NMR数据见表1。

表1 化合物Ⅰ的¹H和¹³C NMR数据(500和125MHz，in DMSO-d₆)^a

a)本表信号归属基于HMQC及HMBC图谱解析结果。

b)此栏中的数字和代号分别代表在HMBC谱中与相应行中的¹H给出偶合相关信号的¹³C核。

实施例2化合物Ⅰ的化学合成方法

如图1所示，化合物Ⅰ的合成反应中的试剂和条件为：a)NaBH₃(CN)，THF，r.t.，2h，89％；b)BF₃·Et₂O，AcOH，90℃，16h，70％；c)HCHO，NaOAc，AcOH，80℃，16h，65％；d)indol，dioxane，110℃，3h，33％。

1.化合物4的合成

将2.00g(14.5mmol)化合物1和3.00g(47.6mmol)化合物NaBH₃(CN)溶于30ml THF中，室温搅拌，反应2小时后，加入100ml 1M HCl搅拌2小时，乙酸乙酯萃取(50ml×3)。合并有机相，无水Na₂SO₄干燥，减压浓缩，柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝50：1)，得浅黄色固体2(1.60g，89％)。

将1.00g(8.06mmol)化合物2溶于10.0ml BF₃·Et₂O中，缓慢加入0.92ml(16.1mmol)AcOH,升温至90℃，搅拌16小时，加饱和的Na₂CO₃淬灭反应，乙酸乙酯萃取(50ml×3)。合并有机相，无水Na₂SO₄干燥，减压浓缩，柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝15：1至石油醚：乙酸乙酯＝5：1变梯度)，得浅黄色固体3(930mg，70％)。

将795mg(4.80mmol)化合物3和65mg(0.48mmol)NaOAc溶于30.0ml AcOH中,缓慢加入1.06ml(37％的水溶液，14.4mmol)HCHO溶液，升温至80℃，搅拌反应16小时后，将反应液冷却至室温，滤除不溶物，滤液加入到200ml饱和Na₂CO₃溶液中进行中和，然后用乙酸乙酯萃取(50ml×3)。合并有机相，无水Na₂SO₄干燥，过滤，减压浓缩，柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝15：1至石油醚：乙酸乙酯＝5:1变梯度)，得浅黄色固体4(737mg，65％)。¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ13.24(s，1H)，9.41(s，1H)，7.51(s，1H)，5.24(s，2H)，2.55(s，3H)，2.19(s，3H)，2.14(s，3H)。

2.化合物I的合成

将40mg(0.168mmol)化合物4和9.83mg(0.084mmol)吲哚溶于1ml二氧六环中，110℃搅拌反应3小时后，将反应液冷却至室温，减压浓缩，用1ml DMSO溶解后加1ml甲醇稀释，过滤不溶物，用HPLC分离，首先用乙腈、水(乙腈：水＝50％-100％变梯度)为流动相制备，再用甲醇、水(甲醇：水＝75％，含千分之一的三氟乙酸)为流动相制备，得浅黄色固体化合物I(13.3mg，34％)。

实施例3化合物的抗病毒活性测试

1.体外抗病毒活性测试

(1)实验样品及实验方法

被测样品溶液的配制 测试样品为上述实施例1和2中分离精制的化合物I纯品。精密称取适量样品，用DMSO配制成所需浓度的溶液，供测活性。

抗H1N1流感病毒活性测试采用CPE抑制，空斑实验等方法进行评价，以抗病毒药物金刚烷胺为阳性对照药，比较化合物对流感病毒引起的细胞病变(CPE)的抑制作用以及对于病毒增殖的抑制作用。将流感病毒H1N1 A/PR8/34(PR8)(MOI＝0.1)加到MDCK细胞上于37℃吸附1小时，弃上清液，加入含待测化合物的DMSO溶液(终浓度6.25-50μg/ml)，37℃保温48小时。一方面收集细胞培养液离心去细胞碎片后进行血凝试验测定病毒滴度来评价化合物对于病毒增殖的影响。另一方面将细胞用PBS洗3次后，用结晶紫溶液(1％的结晶紫溶解于20％乙醇和3.7％甲醛的水溶液中)染色，之后置于酶标仪上测定630nm处的光密度OD值用于计算病毒抑制率。抑制率按照以下公式计算：病毒抑制率(％)＝(药物对照组OD值-病毒对照组OD值)/(细胞对照组OD值-病毒对照组OD值)*100％。化合物I对于病毒的直接灭活作用利用空斑实验测定，大约50-100PFU/的PR8病毒与化合物I(0，6.25，12.5，25，50μg/ml)在37℃预处理60min，病毒液其后利用病毒空斑实验检测空斑形成。

化合物I抗病毒的广谱性和病毒抗药性也进行了评价。化合物I抗病毒的广谱性采用三种不同甲型流感病毒流行株H1N1(A/PR8/34；PR8)、H1N1(A/California/04/2009；Cal09)和H3N2(A/swine/Minnesota/02719/2009；Minnesota)结合MDCK细胞模型进行评价，MDCK细胞感染高剂量的PR8、Cal09或Minnesota(MOI＝3.0)，然后利用不同浓度的化合物I处理细胞，24h后利用HA试验检测病毒滴度，以相对病毒对照组的HA滴毒的百分率来表示抑制率高低。化合物I的病毒抗药性通过利用低剂量的化合物I(25μg/ml)和金刚烷胺(25μg/ml)处理PR8毒株并连续传代5代进行抗性试验，然后检测细胞上清中的病毒滴度来评价。

(2)实验结果

抗H1N1流感病毒活性测试显示化合物I对流感病毒引起的细胞病变(CPE)有明显的抑制作用，且在6.25-50μg/ml的范围内呈现明显的剂量依赖性(图2A)，化合物I的IC₅₀为34μM，优于阳性对照药金刚烷胺(IC₅₀为157μM)。病毒空斑实验结果表明化合物I在6.25μg/ml以上浓度预处理病毒还能够显著抑制病毒空斑形成(图2B)，说明其对于病毒颗粒还有直接的灭活作用。

化合物I在3.125-50μg/ml的浓度范围内对于PR8，Cal09和Minnesota病毒株的增殖都具有显著的抑制作用(图2C)，说明化合物I具有广谱的抗甲型流感病毒作用。抗性试验研究表明金刚烷胺在病毒传代4代和5代时对于病毒增殖的抑制作用明显下降(抑制率减为60％和40％)，说明产生了抗药性；而化合物I对于病毒的抑制作用在病毒传代5代之后仍然接近90％，明显优于金刚烷胺(图2D)。

综上所述，化合物I具有显著的抗甲型流感病毒作用，且具有广谱性和不易产生耐药性的特点。

2.化合物I抗病毒靶点的确定

(1)实验方法

化合物I体外抗病毒作用的阶段利用时间依赖的添加实验(time-of-additionassay)来确定。先将MDCK细胞用四种不同的处理方法来感染甲型流感病毒株PR8(MOI＝0.1)：i)预处理病毒：在感染前，用50μg/ml的化合物I在37℃下将病毒预处理1h；ii)预处理细胞：在感染前，用50μg/ml的化合物I先预处理MDCK细胞1h；iii)吸附时处理：将MDCK细胞在含有50μg/ml化合物I的培养基中进行感染，在吸附1h后，换不含化合物I的培养液继续培养；iv)吸附后处理：感染1h后，移除未吸附的病毒，然后将含有50μg/ml化合物I的培养液加入细胞中。在24小时后，利用HA试验来检测细胞上清中的病毒滴度来评价抗病毒活性高低。

化合物I对病毒NA蛋白和HA蛋白的抑制作用利用神经氨酸酶(NA)活性抑制实验和血凝抑制实验(hemagglutination inhibition assay)来评价。神经氨酸酶活性抑制实验，即在96孔荧光酶标板中分别加入不同浓度化合物I(12.5-200μg/ml)10μL，加入适量的PR8粗酶液30μL，混匀后室温反应，以扎那米韦(zanamivir)为阳性对照药。30min后加入10μL水，10μL MES(2-N-吗啡啉-乙磺酸)(pH＝3.5)缓冲液，10μL CaCl₂溶液和30μL底物MUNANA溶液至总体积100μL，充分混匀后37℃孵育30min后加入终止液，利用荧光酶标仪测定荧光强度值(ex＝355nm，em＝460nm)，并计算抑制率。而血凝抑制试验则是先将化合物I或抗HA抗体先于流感病毒PR8,Cal09或Minnesota于37℃共孵育1h，其后在96孔板中2倍梯度稀释，并在各孔中加入鸡红细胞并混匀后于4℃放置1-2h后观察结果。

化合物I对膜融合的抑制作用利用血凝素蛋白介导的细胞融合实验(HA syncytiaassay)来观察。即将表达PR8 HA的质粒转染Vero细胞16h后先用TPCK-胰酶处理10min后，在化合物I存在下培养15min，然后将pH降低至5.0，并在化合物I存在下继续培养10min。接下来换成完全培养基后在37℃孵育2h后利用改良吉菩萨染液Hema3Stat Pak染色后观察多核体的生成，并用显微镜拍照。

(2)实验结果

时间依赖的添加实验结果如图3A所示，无论在病毒的吸附期还是在预处理病毒时添加化合物I都可以显著地降低细胞上清中病毒的滴度，说明化合物I通过直接作用于病毒颗粒来阻断甲型流感病毒的吸附过程。其次，病毒吸附后加入化合物I也能抑制病毒的增殖但不具有统计学意义的显著性(图3A)。

NA活性抑制实验的结果如图3B所示，在12.5-200μg/mL浓度范围内化合物I对于NA的活性没有显著的抑制作用，最大抑制率低于20％，远低于阳性药物扎那米韦(87％)。因此，化合物I不是靶向于病毒的NA蛋白。血凝抑制试验结果如图3C所示，抗HA蛋白抗体在0.3125-5μg/mL浓度下显著抑制流感病毒PR8，Cal09和H3N2(Minnesota)引起的鸡红细胞凝集现象，暗示抗HA蛋白抗体可以通过结合HA蛋白来阻碍病毒附着到红细胞；而化合物I在3.125-50μg/mL浓度范围内也可以显著地抑制三种流感病毒引起的鸡红细胞凝集，说明化合物I潜在作用靶点为HA蛋白。

HA介导的膜融合实验结果如图3D所示，在不加化合物时，pH 7.0降低至5.0引起了表达HA蛋白的Vero细胞形成了很多的多核体(大的黑点区域)，而保持pH 7.0则无多核体形成；在加入50μg/ml浓度的化合物I之后可以显著抑制Vero细胞中HA介导的多核体形成，特别是酸化前和酸化阶段都加入化合物I的抑制效果最显著(图3D)，说明化合物I还可以抑制HA介导的膜融合。

综上所述，我们的研究结果表明化合物I主要通过靶向病毒HA蛋白来抑制甲型流感病毒的感染和增殖。

3.体内活性测试

(1)实验方法

利用鼠肺适应株H1N1(A/PR/8/34)病毒液滴鼻感染SPF级的kunming小鼠建立动物模型，用此小鼠模型检验化合物I在体内抗IAV感染的效果。将14-16g的SPF级的雌性kunming小鼠70只按体重分为病毒对照组(模型组)，正常对照组，阳性药奥司他韦(10mg/kg/day)组，化合物I灌胃组(5和10mg/kg/day)，化合物I滴鼻组(20和40μg/day)，每组10只。除正常组外，其它各组均在乙醚轻度麻醉下以4HAU/ml滴度的IAV病毒液滴鼻感染，每鼠40μL。连续给药7天，其中每组在感染4天后各取4只小鼠断食8h，称重后解剖并测定小鼠的肺指数(肺指数＝(肺重/体重)×100)和肺指数抑制率(肺指数抑制率＝(病毒组平均肺指数－实验组平均肺指数)/病毒组平均肺指数×100％)。此外，将肺组织匀浆之后，利用空斑实验检测肺病毒滴度高低，利用ELISA检测炎症因子的表达。利用高滴度(8HAU/ml)的病毒感染小鼠，分组和给药方式同上，连续观察14天，在小鼠体重减轻为初始体重的75％以下且皮毛异常行动缓慢时，对小鼠实行安乐死。最后统计14天内每天的小鼠死亡和体重情况。

(2)实验结果

空斑试验结果如图4A所示，通过化合物I口服或滴鼻给药4天后，肺部病毒滴度与病毒对照组相比均显著降低(p<0.05)，阳性药奥司他韦(10mg/kg/day)组也能使小鼠肺病毒滴度明显降低(p<0.05)，特别是40μg/day剂量的化合物I滴鼻给药组对于肺病毒滴度的抑制作用最为显著(p<0.01)(图4A)，优于奥司他韦组。生存试验结果如图4B及4C所示，化合物I口服或滴鼻给药均可提高病毒感染小鼠的生存率，且化合物I 40μg/day滴鼻给药时，相对于安慰剂组其对生存率的提高最为显著(p<0.01)。在感染14天时，安慰剂组只有40％的小鼠生存，而化合物I(40μg/day)滴鼻给药组的生存率达到100％，优于奥司他韦(10mg/kg/day)给药组(80％)；而安慰剂组小鼠的体重在感染后第4天(4p.i.)时开始下降，一周后相对初始重量大约减少23％-24％，而化合物I给药组小鼠的体重则逐渐增加，无下降趋势，且滴鼻给药(40μg/day)组效果最佳(图4C)。ELISA试验结果如图4D所示，流感病毒感染小鼠肺部组织产生的炎性细胞因子TNF-α和IL-6的含量与正常组相比明显增加(P<0.01)，而在化合物I口服或滴鼻给药4天后，TNF-α和IL-6的量与病毒对照组相比均显著减少(P<0.05)，其中滴鼻给药(40μg/day)组抑制效果最佳(P<0.01)(图4D)。

综上所述，动物实验结果显示化合物I滴鼻给药和灌胃给药方式均能显著降低甲型流感病毒感染小鼠的肺病毒滴度，提高小鼠生存率，抑制体重下降趋势并减少炎性因子的分泌，体现出很好的体内抗甲型流感病毒作用。

4.结论

化合物I在体外和体内活性测试时均具有较好的抗甲型流感病毒活性，具有开发成为新型滴鼻剂，鼻喷雾剂或口服制剂的潜力，用于预防和治疗甲型流感病毒引起的呼吸道感染。

Claims (17)

1.式I＇化合物或其药学上可接受的盐，

其中R₁为H或C_1-6烷基；

R₂为H；

R₃相互独立地为乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、正戊基、异戊基或正己基；

n为4。

2.式I＇化合物或其药学上可接受的盐，

其中R₁为H或C_1-6烷基；

R₂相互独立地为卤素；

R₃相互独立地为C_1-6烷基；

n为1或2。

3.式I＇化合物的化学合成方法，

其中R₁为H或C_1-6烷基；

R₂相互独立地为H或卤素；

R₃相互独立地为C_1-6烷基；

n为1或2；

其包括

使式III化合物

其中R₃如上面式I＇中所定义；

与式IV化合物

其中n、R₁、R₂如上面式I＇中所定义；

在有机溶剂中在90-150℃反应3h，得到式I＇化合物。

4.权利要求3所述的合成方法，其中有机溶剂优选自非质子性溶剂二氧六环、DMSO、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃和二氯甲烷等。

5.权利要求4所述的合成方法，其中有机溶剂是二氧六环。

6.权利要求3所述的合成方法，其中所述反应在100-120℃进行。

7.权利要求3所述的合成方法，其中所述反应在110℃进行。

8.权利要求3所述的合成方法，其中式IV化合物的R₁为氢或甲基。

9.权利要求3-8中任何一项所述的合成方法，其中式III化合物的R₃为甲基。

10.权利要求3-8中任何一项所述的合成方法，其还包括制备式III化合物的以下步骤：

a)使化合物1

在溶剂THF中与还原剂NaBH₃(CN)反应，得到化合物2，

b)在BF₃·Et₂O存在下使化合物2与R₃COOH反应，得到式II化合物

其中R₃如权利要求3中所定义；

c)使式II化合物与HCHO、NaOAc、AcOH反应，得到式III化合物

其中R₃如权利要求3中所定义。

11.权利要求10所述的合成方法，其中步骤a的反应在室温进行，反应2h。

12.权利要求10所述的合成方法，其中步骤b的反应在90℃进行，反应16h。

13.权利要求10所述的合成方法，其中步骤c的反应在80℃进行,反应16h。

14.权利要求10所述的合成方法，其中式II和式III化合物的R₃为甲基。

15.组合物，其包含权利要求1或2中的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的赋形剂，其为片剂、混悬剂形式的。

16.组合物，其包含权利要求1或2中的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的赋形剂，其为滴鼻剂或鼻喷雾剂形式的。

17.权利要求1或2所述化合物在制备抗病毒药物中的用途。

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