CN1090193C - 由藻酸盐制备糖醛酸嵌段的方法 - Google Patents
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Abstract
揭示了一种新方法，该方法通过M嵌段部分从固相中选择性的分级分离，由藻酸盐(主要是G嵌段藻酸盐或M嵌段藻酸盐)制备嵌段部分。还可以分离出MG嵌段部分。
Description
本发明涉及一种新型的由藻酸盐(主要是G嵌段藻酸盐和/或M嵌段藻酸盐)制备嵌段部分的方法。
技术背景
藻酸盐是由海生褐色藻类分离得到的。藻酸盐还产生于土壤细菌(如棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)和Azotobacter crococcum)以及多种不同的假单胞菌属细菌。然而，市售的藻酸盐通常是由褐色藻类得到的。
藻酸盐用于食物和药用、牙科用、美容用和其它工业产品。最普通的工业用途是基于它们的水解胶体和聚电解质的性能，这成为提供形成凝胶、增稠、稳定、溶胀和粘度这些性能的基础。
藻酸盐是藻酸的盐类，一种线形杂多糖，由(1→4)连接的β-D-甘露糖醛酸(记作M)和α-L-古洛糖醛酸(guluronic acid)(记作G)组成。这两个糖醛酸具有以下化学式：
β-D-甘露糖醛酸 α-L-古洛糖醛酸
聚合物以如下几种方式存在：甘露糖醛酸的均聚物序列(称为M嵌段)、古洛糖醛酸的均聚物序列(称为G嵌段)、甘露糖醛酸和古洛糖醛酸单元的混合序列(称为MG嵌段或交替嵌段)。
为了说明藻酸盐的结构，以下是一种可以想到的嵌段结构的示意图：
GMMMMMMMGGGGGGMGMGMGMGMGGGGGGGGGM
M嵌段 G嵌段 MG嵌段 G嵌段
通常，藻酸盐含有所有的这三种嵌段，一个嵌段基本上由3-30个单体单元组成。这些嵌段的分布情况取决于分离出藻酸盐的藻类的类型、该植物的年龄和部分，例如由茎杆得到的藻酸盐与由叶得到的藻酸盐具有不同的序列和嵌段组成。藻类收获那年的时间也会影响嵌段的组成和序列。根据我们目前所有的知识，在老L.hyperborea的茎杆中可发现最高的G含量。同一种类植物的叶具有较低的G含量和较短的G嵌段，但是该含量仍然比大多数其它种类的植物高。市售藻酸盐的G含量通常为25％-70％。
具有高含量M嵌段的来源例如是褐色藻属丛梗藻(Durvillea)、巨藻(Lessonia)和泡叶藻(Ascophyllum)这些种类。
已有技术
藻酸盐嵌段部分、G嵌段、M嵌段和MG嵌段的制备描述于以下出版物中：[A.Haug和O.Smidsrod(1966)的“通过部分水解研究藻酸的组成”Acta Chem.Scand.20，183-190]和[A.Haug，B.Larsen和O.Smidsrod(1967)“藻酸中糖醛酸残基序列的研究”Acta Chem.Scand.21，691-704]。
这两篇文章中描述的方法包括以下步骤：
a)将藻酸在100℃水解3-5小时，得到被分成古洛糖醛酸嵌段(G嵌段)、甘露糖醛酸嵌段(M嵌段)和交替嵌段(MG嵌段)的藻酸盐。MG嵌段溶解。在水解10-30分钟后中断水解，能获得最佳长度的MG嵌段。
b)过滤，然后从未溶解的G和M嵌段中除去溶解的MG嵌段；
c)用碱液将pH值调节至pH7，由此包含藻酸盐G嵌段和M嵌段部分的未溶解部分溶解；
d)用酸将pH值调节至pH 2.4-2.8，沉淀出G嵌段部分；
e)过滤；M嵌段仍然溶解；
f)用酸将pH值调节至pH 1.3或更低，以沉淀出M嵌段部分。
US专利5,503,771说明了一种凝胶悬浮液，它含有胶体金属或陶瓷颗粒、水和有效量的生物聚合物分散剂和摩尔重量最小为50,000克/摩尔、可以由非胶凝状态转化为胶凝状态的生物聚合物胶凝剂。生物聚合物分散剂可以选自藻酸盐的富含多甘露糖醛酸的水解产物、藻酸盐的富含多古洛糖醛酸的水解产物、许多具有形成凝胶性能的其它多糖类和这些多糖类的混合物。藻酸盐的富含多甘露糖醛酸的水解产物(对应于M嵌段藻酸盐)或者藻酸盐的富含多古洛糖醛酸的水解产物(即G嵌段藻酸盐)的制备方法与两篇上述文章中所述相同。
工业应用
近年来，发现多种多糖醛酸部分(尤其是藻酸盐的G嵌段和M嵌段部分)的数种新颖的用途。
G嵌段部分可以用作胶凝藻酸盐体系的流变性能调节剂。这一发明描述于申请日为1996年7月12日的挪威专利申请962936。
此外，G嵌段和M嵌段的用途如上述US专利中所述：生物聚合物分散剂(它可以是藻酸盐的G嵌段或M嵌段部分)能够将胶体颗粒分散在水中，由此形成非团聚的悬浮液，该悬浮液具有易流动的低粘度以使得最终悬浮液能够在开始胶凝之前转移至模具中，然后对产品进行热解和烧结。
主要目的是得到分散的产物，其中形成凝胶，确保分散的颗粒保持在适当的位置。
G嵌段的其它用途例如是作为低粘性的絮凝剂，它可用来除去毒性金属离子(如铅、锶和钡)。
可以获得富含M嵌段的藻酸盐，被称为多M藻酸盐，它显示对于一定的细胞在免疫防御机理方面有激发效应，从而能够防止例如侵染和辐射损伤。因此，这类M嵌段藻酸盐用来与药用产品的制备相结合。这一发明描述于EP-B2-506326/US 5,169,840中。可以想到，本发明制得的M嵌段可以通过常规有机化学方法或生物技术方法被聚合。
有理由相信这些不同的糖醛酸嵌段具有与制造新产品有关的有价值的性能，尤其是在药物领域。
本发明所解决问题的说明
然而，已知方法具有缺点，这使得它不适合用于工业制造大量的不同糖醛酸嵌段。
问题在于当G嵌段和M嵌段部分都需溶解时的大体积，这是步骤(c)中的操作所必需的。这通过将pH值从低调节至中性来实现。为了避免溶液的粘度太高并由此产生在步骤(d)中G嵌段部分沉淀不足，使用0.25％-1％浓度的藻酸盐。结果，体积增量几乎是初始藻酸体积的100-400倍。
在步骤(d)从溶液中沉淀出G嵌段的过程中，必需用“稀”酸进行操作，以避免M嵌段也沉淀出来。这使得由稀释造成体积进一步增加。这一大体积的水溶液必须在随后的剩余步骤中得以保持，这使得这一过程的实践繁琐，不能在工业水平上进行实施。
发明的说明
现在令人惊奇地发现，根据本发明可以用一种解决以上问题的方法制备藻酸盐的嵌段部分，尤其是G嵌段和/或M嵌段部分。作为这一过程中的一个步骤，MG嵌段部分也可以分离并加以优化，如前所述。
本发明的由藻酸盐制备糖醛酸部分的方法包括以下步骤：
a)将藻酸用酸水解形成G嵌段、M嵌段和MG嵌段的部分，由此含有MG嵌段的部分溶解，含有G嵌段和M嵌段的部分保持不溶解；和
b)将不溶解的部分悬浮在水中，用碱液调节pH值至pH2.8-4.0，最好的是pH值为3.0-3.5，由此含有M嵌段的部分溶解，而含有G嵌段的部分保持不溶解。
较好的是在该过程中实施一个或多个以下的附加步骤：
(i)在步骤a)和/或步骤b)后通过过滤、离心或其它合适的方法将不溶解部分与溶解部分分离；
(ii)在步骤b)之后分离酸形式或盐形式的G嵌段部分；
(iii)分离含有M嵌段的部分
(i)通过用酸将pH值调节至pH 1.4-0.5以沉淀出M嵌段部分
或(ii)通过使用薄膜技术，然后是除去水和干燥M嵌段部分的步骤
或(iii)用醇沉淀出M嵌段部分
(iv)在步骤b)中将pH值调节至3.5-4.0，得到具有高纯度的G嵌段部分；
(v)在步骤b)中将pH值调节至2.8-3.0，以高产率得到G嵌段部分；
(vi)在步骤b)中将pH值调节至3.0-3.5，尤其是pH值为3.3，以较高产率得到具有较高纯度的G嵌段部分；
(vii)在步骤i)中将pH值调节至1.3，以沉淀出M嵌段部分；
(viii)使用高M含量的藻酸制得具有高纯度的M嵌段和/或以高产率制得M嵌段；
(ix)使用高G含量的藻酸制得具有高纯度的G嵌段和/或以高产率制得G嵌段；
(x)在步骤a)中于40-100℃用0.05-5M的酸水解藻酸；
(xi)在步骤a)中在水解10-30分钟后中断水解以分离MG嵌段，在除去这些嵌段之后，继续水解直至M嵌段部分大部分溶解；
通常，本发明的方法可以通过实施以下步骤进行：
a)于40-100℃用浓度在0.05-5M范围内的酸水解藻酸，以使得含有MG嵌段的部分溶解；
b)通过过滤、离心或另一种合适的方法将含有溶解的MG嵌段的部分与含有G嵌段和M嵌段的不溶解部分分离；
c)将不溶解部分悬浮在水中，用碱液调节pH值至pH 2.8-4.0，最好为pH3.0-3.5，由此含有M嵌段的部分溶解；
d)通过过滤、离心或另一种合适的方法将含有G嵌段的不溶解部分与含有M嵌段的溶解部分分离；
以及可以有
e)以纯净形式制备含有M嵌段的部分
(i)将pH值用酸调节至pH 1.4-0.5，以沉淀出M嵌段部分
或(ii)通过使用薄膜技术，然后是除去水和干燥M嵌段部分的步骤
或(iii)用醇沉淀出M嵌段部分。
当沉淀出M嵌段部分以后，可以通过过滤、离心、洗涤和干燥或类似方法在随后的步骤中将该M嵌段部分与剩余的酸部分或醇部分分离，这是专门技术人员熟悉的。可用于步骤e)(ii)的膜技术可以例如是渗析或其它膜过滤技术。用来去除水和干燥M嵌段部分的步骤可以例如是冷冻干燥或喷雾干燥。在步骤e)(iii)中，可以使用任何能被有效去除的醇，如异丙醇。
已有技术的方法代表了M嵌段和G嵌段的分级沉淀法，而另一方面本发明的方法则代表了分级分离法(fractionated release)。这就得到了本发明方法的一个主要优点，就是所需的体积降低至一个小部分，因此该方法可以在工业级上实施。而且，另一个优点是显著地降低了调节pH值的化学试剂的消耗，从而大大地降低了成本。
图2示出了两种方法的示意图。
可见，本发明方法与已有技术方法的主要不同之处在于在除去含有交替MG嵌段的溶解部分之后，包含M嵌段和G嵌段的整个未溶解部分是不溶解的。代之以完全中和，选择在2.8-4.0范围内的pH值，这样能有选择地分离M嵌段部分，而G嵌段部分保持不溶解。因此，于此有关的步骤所需要的体积基于以下原因会减少：只有含M嵌段的部分要被溶解因而待溶解的固体减少。而且，溶解部分只含有一种嵌段(即M嵌段)而不是一种混合物，这就不必在高度稀释的溶液中进行操作。
如前所述，根据已有技术在步骤c)中使用了0.25-1％的藻酸盐溶液，这意味着体积的增量在100-400倍的范围内。然而，根据本发明该步骤中体积的增量为10-20倍。必需的含水溶液体积从100-400倍降低至10-20倍。这意味着与老方法相比，新方法在整个步骤中所用的体积最多为老方法所用体积的1/10。
工作体积大大减少是本发明的一个明显的优点，因为如前所述，它使得本发明的方法在工业上可行。
本发明方法与已有技术相比的另一个主要优点是显著降低了化学试剂的消耗，因此大大降低了成本。这是因为根据已有技术的方法所需的碱液用量是将pH值从强酸(pH1)调节至中性(pH7)溶液，而根据本发明的方法pH值调节是从强酸(pH1)调节至pH3.5(即只是对藻酸盐嵌段的羧酸基团进行“一半”中和)，这样碱液的所需用量就减半了。
因此，使用本发明方法沉淀出M嵌段部分的酸用量降低至已有技术所需酸用量的10％。如果使用其它技术制备纯净的M嵌段，那么可以完全不用酸。
表3示出了本发明方法相对于已知方法的化学试剂的相对体积和消耗量概况。
令人非常惊奇的是，可以进行有选择性的M嵌段和G嵌段的分级分离而仍能得到高纯度的G嵌段部分，不必进行对该部分进行单独溶解和沉淀。
实际上，使用本发明方法能够以99％的纯度分离出G嵌段部分。当然纯度和产率之间存在相互关系，这可以通过步骤c)中pH调节来得到。
参见表1，表1示出：
1)沉淀物中古洛糖醛酸(guluronate)的含量(FG沉淀物)，
2)悬浮液中古洛糖醛酸的含量(FG溶解)，
3)G嵌段的产率(产率％)，以水解后沉淀物的％计算取决于步骤c)中经调节的pH值。在水解步骤中，损失了约50％的称量的藻酸盐。计算得到的产率是步骤a)中过滤后分离出的沉淀物为基础的。
为了得到高纯度(FG沉淀物＝0.99)，步骤c)中的pH值必须调节至4.0-4.1。然而，此处的产率也大大地降低(24.4％)。
如果对于最终产物具有高纯度并不同样是决定性的话，可以通过在步骤c)中将pH值调节至2.8来实现超过90％的产率。
通常最好选择一个对纯度和产率都是折衷的值，如pH3.3，在该pH值时可以约80％的产率制得纯度超过90％的产物。
可用于本发明方法的酸可以是任何不具有氧化性能的酸，如强酸(如盐酸和硫酸)或弱酸(如草酸和乙酸)。水解步骤可以用专门技术人员通常所用的方式进行。选用的酸浓度通常在0.05-5M的范围内，更好是0.1-1M，合适的例子是0.3M的盐酸。
通常最好的是使用NaOH作为碱液，但是也可以使用对该方法中以前步骤所用的酸具有中和作用从而能够进行上述pH值调节的任何其它化合物。合适的浓度范围是1-10M NaOH。
膜技术方法例如可以包括渗析或其它的膜过滤方法。此处重要的方面是，降低溶液中盐的高含量。所需的去除水和随后干燥产物的方法例如是用冷冻干燥或喷雾干燥法，可能与干燥之前用醇进行沉淀和洗涤连用。
在本文的上下文中，“藻酸盐的G嵌段部分”或“藻酸盐的M嵌段部分”一词分别意指包括具有高含量的古洛糖醛酸和甘露糖醛酸的低分子的藻酸盐或藻酸。任何在嵌段中含有至少两个G单元的多糖类或多糖类片断属于本发明“G嵌段部分”的表述范围，给M嵌段部分的含义与此相同。然而，较好的是制得平均摩尔重量为1000-100,000g/mol的多糖类部分。对于“G嵌段部分”，更好的是制得摩尔重量在1000-50,000g/mol的范围内，最好的是摩尔重量在2000-40,000g/mol的范围内。
“片断”一词意指包括整个藻酸盐链的小的部分，尤其是那些具有主要由古洛糖醛酸单体(所谓的G嵌段)或甘露糖醛酸单体(所谓的M嵌段)或交替的古洛糖醛酸和甘露糖醛酸(所谓的MG嵌段)组成的共同特征的部分。
作为本发明方法的原料，可以使用任何含有藻酸的材料，如藻类，或是其叶、茎杆或缠系器官。因此，在本发明的方法中不必在使用藻酸之前分离藻酸。
还可以使用任何藻酸盐作为本方法的原料，从而第一步a)将是转变成藻酸的过程而无需对其进行分离。然而，在一定的情况下最好分离藻酸然后再进行随后的加工步骤。在大多数情况下，最简单的方法是使用市售的藻酸盐/藻酸作为本发明的原料。
在本发明的说明书和所附的权利要求书中，“藻酸”一词用来描述所有含有藻酸或藻酸盐的原料，如藻类或者纯度或高或低的藻酸和藻酸盐。
根据所需的用途，选择具有高或低的G嵌段含量或M嵌段含量或可能的MG含量的藻酸以得到最大产率的最终产物，不管是G嵌段部分、M嵌段部分还是MG部分。
在所附的权利要求书中以另外形式进一步对本发明加以说明。
实施例材料
以下通过实施例和附图及表格对本发明作更详细的说明并给出实施例。
在附图和表格中使用以下缩写：″产率％″它是以步骤b)(酸水解)后未溶解部分为基础计算的。在这一酸水解
步骤中损失约50％的称量的藻酸/藻酸盐。″FG″ 它代表在经分离的材料中古洛糖醛酸单元的分数，是得到的G的纯
度的量度。当FG＝1时，该部分具有100％的G嵌段。FM将是1-FG。
该值是基于经分离的部分的NMR光谱测得的。″FM″ 它代表在经分离的材料中甘露糖醛酸单元的分数，是得到的M的纯
度的量度。当FM＝1时，该部分具有100％的M嵌段。FG将是1-FM。
该值是基于经分离的部分的NMR光谱测得的。″DPn″ 平均的聚合程度，即是每个嵌段平均含有多少个单体的量度。
实施例1
根据本发明制备G嵌段
选择Pronova Biopolymer a.s in Drammen，Norway出售的ProtanalTM LFR5/60的一种高G含量的藻酸盐(65％ G单元)作为原料用于制备。该方法按如下所列进行：
1.将100ml 0.3M HCl加入1.0g藻酸盐中并搅拌过夜。
2.滗析去酸，加入新的50ml 0.3M HCl。
3.在水浴(100℃)中水解5小时。
4.滗析去酸，用50ml不含离子的水洗涤沉淀物。滗析去水并加入新的水(50ml)。
5.随后用NaOH调节悬浮液至不同的最终pH值(3.8-5.3)。
6.将悬浮液置于搅拌机上过夜，然后进行离心。
7.向沉淀物中加入新的水并将pH值调节至6.5-7.0。
8.对上层清液(6.)和沉淀物(7.)中的藻酸盐进行量(FS)和化学组成(NMR)的分析。
用于确定碳水化合物总量的FS分析方法的说明可见于[M.Dubois等的分析化学，卷28，No.3，第350-356页(1956年3月)]。
表1
在水解、洗涤和调节pH值之后沉淀物和悬浮液中古洛糖醛酸的含量。该表还示出了在水解后、调节pH值之前分离出的沉淀物中的“G嵌段”的产率百分数，I＝不溶的；S＝可溶的。
n.d.是指“未测定”。
| pH | 部分 | FG | FM | (水解后不溶材料)的产率％ | DPn |
| 2.85 | I(G嵌段) | 0.81 | 0.19 | 92.4 | 18.7 |
| S(M嵌段) | 0.24 | 0.76 | 7.6 | n.d. | |
| 3.34 | I(G嵌段) | 0.92 | 0.08 | 77.9 | 19.9 |
| S(M嵌段) | 0.17 | 0.83 | 22.1 | 13.1 | |
| 3.72 | I(G嵌段) | 0.97 | 0.03 | 67.4 | 17.5 |
| S(M嵌段) | 0.51 | 0.49 | 32.6 | 13.3 | |
| 3.86 | I(G嵌段) | 0.96 | 0.04 | 52.6 | 17.2 |
| S(M嵌段) | 0.64 | 0.36 | 47.4 | 16.5 | |
| 3.93 | I(G嵌段) | 0.96 | 0.04 | 55.4 | 16.2 |
| S(M嵌段) | 0.61 | 0.39 | 44.6 | 15.1 | |
| 4.07 | I(G嵌段) | 0.99 | 0.01 | 24.4 | 15.2 |
| S(M嵌段) | 0.73 | 0.27 | 75.6 | 13.4 | |
| 4.38 | I(G嵌段) | n.d. | n.d. | 3 | n.d. |
| S(M嵌段) | 0.82 | 0.18 | 97 | 15.7 | |
| 4.83 | I(G嵌段) | n.d. | n.d. | 3 | n.d. |
| S(M嵌段) | 0.79 | 0.21 | 97 | 15.0 | |
| 5.62 | I(G嵌段) | n.d. | n.d. | 3 | n.d. |
| S(M嵌段) | 0.76 | 0.24 | 97 | 15.9 |
可见，得到的产率和纯度是与pH值有关的。
当pH值为4.07时得到最大纯度，FG(沉淀物)为0.99。但另一方面产率低，仅为24.4％。
在步骤c)中通过将pH值调节至2.85能得到最大的产率，但是纯度并不相应地高，FG(沉淀物)为0.81。
其原因是随着pH值的增加，大部分G嵌段部分会与M嵌段部分一起溶解。这也表现于栏FG(溶液)中，其中当pH值在2.85-4.38范围内上升时该数据也上升。
图1示出了沉淀物(即在步骤c)调节pH值之后步骤d)的不溶部分)的FG与pH值的相关性。此外，还示出了步骤d)中分离出的G嵌段的产率与pH值的相关性。可以看出，当pH值超过4时不溶解部分全部消失。
同时，溶液的FG值表明，在pH值为3.5之后，G嵌段加快溶解。
实施例2
根据已有技术(Smidsrod.Haug等)制备G嵌段和M嵌段部分
选择与实施例1相同的藻酸盐(即高G含量的藻酸盐LFR5/60)作为制备G嵌段的原料。M嵌段也由该原料制得。
选择得自巨藻(Macrocystis pyrifera)的藻酸盐，由The NutraSweet KelcoCompany出售的高M含量的藻酸盐(60％ M单元)制备M嵌段。G嵌段也是由该原料制得的。
基于本说明书上文提及的Smidsrod和Haug的出版物，进行如下制备：
1.将5.0g藻酸盐分散在500ml 0.3M HCl中，并置于100℃的水浴上5小时。
2.冷却并离心。除去酸水解产物(即离心后的上层清液)。
3.用5M NaOH将离心后含有G嵌段和M嵌段部分的沉淀物中和至pH7，这两种部分均溶解。
4.通过稀释将溶液中的藻酸盐浓度调节至1％。
5.通过HCl滴定将pH值降低至2.4。所用的酸强度是在pH值为2.4时得到藻酸盐浓度在0.25-0.5％的范围内。本文指定Smidsrod和Haug的出版物为参考文献，以上所述的这一点在该文献中有说明。进行离心。用5MNaOH对含有G嵌段的沉淀物进行中和，渗析并进行冷冻干燥。
6.用1M HCl将步骤5.中上层清液的pH值降低至1.3。进行离心。用5MNaOH对含有M嵌段部分的沉淀物进行中和，渗析并进行冷冻干燥。
结果列于表2中，它示出了产率(％)和分离出的部分的FG和FM。此外，还示出了平均的聚合程度DPn。
如这些数据所示，可以用该发明方法由不同性质的藻酸盐制备G嵌段和M嵌段部分，而即使是使用浓缩10倍多的溶液，结果是产率或纯度低得不可接受。除了这一点，还有一个显著的不同点，就是只有本发明的新方法才是工业上可行的。即使当浓度为10％时，可以工业化实现各个部分的纯度和产率。同时，这样就可以对10倍多用量的藻酸盐部分(水解后)进行操作，这在实践中意味着如果使用老方法和新方法，在两种情况下都达到80％的所要结果，而新方法可制得10倍多的所需产物。
实施例3
根据本发明制备G嵌段和M嵌段但有三种不同的浓度：1％、5％和10％
选择与实施例1相同的藻酸盐(即高G含量藻酸盐LFR5/60)作为制备G嵌段的原料。M嵌段也由该由原料制得。
选择得自巨藻的藻酸盐，由The NutraSweet Kelco Company出售的高M含量的藻酸盐(60％ M单元)制备M嵌段。G嵌段也是由该原料制得的。
该方法如下所列进行：
1.将100ml 0.3M HCl加入20.0g藻酸盐中并搅拌过夜。
2.滗析去酸，加入新的50ml 0.3M HCl。
3.在水浴(100℃)中水解5小时。
4.滗析去酸，用50ml不含离子的水洗涤沉淀物。滗析去水并加入新的水(50ml)。
5.随后用NaOH调节悬浮液至pH3.5，加入水直至1000ml、200ml或100ml，分别制得浓度为1％、5％或10％的藻酸盐。
6.将悬浮液置于搅拌机上过夜，然后进行离心。
7.向沉淀物中加入新的水并将pH值调节至6.5-7.0。
8.对上层清液(6.M嵌段)和沉淀物(7.G嵌段)中的藻酸盐进行中和、渗析和冷冻干燥。随后对由两种性质的藻酸盐分离出的G嵌段和M嵌段的部分进行量(FS)和化学组成(NMR)的分析。
结果示于表2中，它示出了产率(％)、由巨藻属藻酸盐分离出的部分的FG和FM。此外还示出了平均的聚合程度DPn。
表2
用新方法和老方法由相等地水解的数批低G含量(巨藻)和高G含量(Laminaria hyperborea，LFR 5/60)的藻酸盐分离出的M嵌段和G嵌段的化学组成、DPn和产率。在新方法中，还研究了分离体积(release volume)的效果。I＝不溶的；S＝可溶的。
| 系列 | 部分 | FG | FM | (水解后不溶材料)的产率％ | DPn |
| “老” | G嵌段 | 0.88 | 0.12 | 31 | 25 |
| 巨藻 | M嵌段 | 0.10 | 0.90 | 69 | 25 |
| “老” | G嵌段 | 0.92 | 0.08 | 87 | 28 |
| LFR 5/60 | M嵌段 | 0.07 | 0.92 | 13 | 19 |
| “新”1％ | I(G嵌段) | 0.89 | 0.11 | 7 | 23 |
| 巨藻 | S(M嵌段) | 0.15 | 0.85 | 93 | 19 |
| “新”1％ | I(G嵌段) | 0.97 | 0.03 | 77 | 22 |
| LFR 5/60 | S(M嵌段) | 0.23 | 0.77 | 23 | 20 |
| “新”5％ | I(G嵌段) | 0.81 | 0.19 | 35 | 19 |
| 巨藻 | S(M嵌段) | 0.13 | 0.87 | 65 | 19 |
| “新”5％ | I(G嵌段) | 0.92 | 0.08 | 85 | 24 |
| LFR 5/60 | S(M嵌段) | 0.27 | 0.73 | 15 | 13 |
| “新”10％ | I(G嵌段) | 0.79 | 0.21 | 49 | 20 |
| 巨藻 | S(M嵌段) | 0.15 | 0.85 | 51 | 18 |
| “新”10％ | I(G嵌段) | 0.97 | 0.03 | 80 | 21 |
| LFR 5/60 | S(M嵌段) | 0.22 | 0.78 | 20 | 15 |
进行这些试验以比较取决于所使用的老方法或新方法而得到的两种部分能达到的纯度和产率。
实施例4
用于由藻酸盐制备G嵌段和M嵌段部分的两种方法的过程步骤的总的表现
1.将普通的藻酸盐分散在500ml 0.3M HCl中。置于水浴(100℃)5小时。
“老”方法的藻酸盐浓度＝1％，“新”方法的藻酸盐浓度可以增至10％。
“已有技术”
2.冷却和离心。
除去酸水解液(离心后的上层清液)，(用5M NaOH)将pH值调节至7，进行渗析和冷冻干燥。
3.将藻酸盐的浓度调节至1％。浓度较高会导致共沉淀，纯度较差。这使得体积显著增加(100倍体积/干藻酸)。
4.通过HCl滴定将pH值降低至2.4。调节酸强度，以便使在pH值为2.4时的藻酸盐浓度在0.25-0.5％的范围内。体积增至200-400倍。进行离心。对沉淀物进行中和、渗析和冷冻干燥，制得G嵌段。
5.将步骤4.中上层清液的pH值降低至1.3。体积进一步增加。进行离心。
对沉淀物进行中和、渗析和冷冻干燥，制得M嵌段。
“本发明”
2.冷却和离心。
除去酸水解液(离心后的上层清液)，(用5M NaOH)将pH值调节至7，进行渗析和冷冻干燥。
3.将沉淀物(含有G嵌段和M嵌段)悬浮在水中，用5M NaOH将pH值调节至例如3.5。这样，藻酸的浓度在5-10％的范围内。体积是10-20倍体积/干藻酸。如前所述，pH值在2.8-4.5之间变化(改变产率和纯度的比值)。调节pH值并保温(incubation)超过24小时。
4a.上层清液含有M嵌段。中和或者保持酸形式，渗析并冷冻干燥。
4b.不溶部分是G嵌段。中和或者保持酸形式，渗析并冷冻干燥。
表3示出了化学试剂的体积和消耗量。将已有技术的消耗量作为1，强调了根据本发明能够在这些项目上实现大幅度降低。
表3
“老” “新”
碱液 1 0.5
酸 1 0.1(0)
体积 1 0.1-0.025
如果选择其它技术来制备纯净的M嵌段(喷雾干燥)，则要除去新方法的分离过程中酸的消耗量。
实施例5
按照已有技术(Haug，Larsen和Smidsrod 1967)用有限的水解时间优化制备交替(MG)嵌段
选择由Laminaria hyperborea的叶分离得到的藻酸盐(其FG＝0.48，交替序列含量高(FGM，MG＝0.18))作为制备该部分的原料。藻酸盐是Pronova Biopolymer A/S市售的。
1.向5.0g藻酸盐中加入100ml 0.3M HCl。
2.在水浴(100℃)上水解20分钟。
3.冷却并进行离心。
4.用NaOH中和上层清液(含MG嵌段)，渗析并冷冻干燥。
表4中结果示出了分离出的MG部分的单体组成、平均的聚合程度(DPn)和产率(％)。
表4
MG嵌段的制备
| 部分 | FG | FM | (藻酸盐初始量的)产率％ | DPn |
| MG嵌段 | 0.41 | 0.59 | 5.1 | 24.3 |
Claims (32)
1.一种由藻酸盐制备古洛糖醛酸均聚物序列的部分的方法，所述方法包括以下步骤：
a)用酸对藻酸进行水解，以形成古洛糖醛酸均聚物序列、甘露糖醛酸均聚物序列和甘露糖醛酸和古洛糖醛酸单元的混合序列这些部分，由此含有甘露糖醛酸和古洛糖醛酸单元的混合序列的部分溶解，含有古洛糖醛酸均聚物序列和甘露糖醛酸均聚物序列的部分保持不溶解，
其特征在于：
b)将不溶解的部分悬浮在水中，用碱液将pH值调节至pH 2.8-4.0，由此含有甘露糖醛酸均聚物序列的部分溶解，而含有古洛糖醛酸均聚物序列的部分保持不溶解，
在步骤b)之后以酸形式或盐形式分离出古洛糖醛酸均聚物序列部分。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤a)和/或步骤b)之后通过过滤、离心或沉淀使不溶解部分与溶解部分分离。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤b)中将pH值调节至3.5-4.0，得到古洛糖醛酸均聚物序列的部分。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤b)中将pH值调节至2.8-3.0，得到古洛糖醛酸均聚物序列的部分。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤b)中将pH值调节至3.0-3.5，制得古洛糖醛酸均聚物序列的部分。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于在步骤b)中将pH值调节至3.3。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于使用甘露糖醛酸含量为甘露糖醛酸单元占60％的藻酸制备甘露糖醛酸均聚物序列。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于使用古洛糖醛酸含量为古洛糖醛酸单元占65-70％的藻酸制备古洛糖醛酸均聚物序列。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤a)中于40-100℃用0.05-5mol/1的酸对藻酸进行水解。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤a)中在水解10-30分钟后中断水解以分离出甘露糖醛酸和古洛糖醛酸单元的混合序列，随后完成水解直至甘露糖醛酸均聚物序列部分被溶解。
11.一种由藻酸盐制备甘露糖醛酸均聚物序列的部分的方法，所述方法包括以下步骤：
a)用酸对藻酸进行水解，以形成古洛糖醛酸均聚物序列、甘露糖醛酸均聚物序列和甘露糖醛酸和古洛糖醛酸单元的混合序列这些部分，由此含有甘露糖醛酸和古洛糖醛酸单元的混合序列的部分溶解，含有古洛糖醛酸均聚物序列和甘露糖醛酸均聚物序列的部分保持不溶解，
其特征在于：
b)将不溶解的部分悬浮在水中，用碱液将pH值调节至pH2.8-4.0，由此含有甘露糖醛酸均聚物序列的部分溶解，而含有古洛糖醛酸均聚物序列的部分保持不溶解，
从步骤b)获得的溶解部分中如下分离出含甘露糖醛酸均聚物序列的部分：
(i)通过用酸将pH值调节至pH1.4-0.5以沉淀出甘露糖醛酸均聚物序列部分
或(ii)通过使用薄膜技术，然后是除去水和干燥甘露糖醛酸均聚物序列部分的步骤
或(iii)用醇沉淀出甘露糖醛酸均聚物序列部分。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于在步骤a)和/或步骤b)之后通过过滤、离心或沉淀使不溶解部分与溶解部分分离。
13.如权利要求1 1所述的方法，其特征在于在步骤b)中将pH值调节至3.5-4.0，得到古洛糖醛酸均聚物序列的部分。
14.如权利要求11所述的方法，其特征在于在步骤b)中将pH值调节至2.8-3.0，得到古洛糖醛酸均聚物序列的部分。
15.如权利要求11所述的方法，其特征在于在步骤b)中将pH值调节至3.0-3.5，制得古洛糖醛酸均聚物序列的部分。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于在步骤b)中将pH值调节至3.3。
17.如权利要求11所述的方法，其特征在于在步骤i)中将pH值调节至1.3，以沉淀出甘露糖醛酸均聚物序列的部分。
18.如权利要求11所述的方法，其特征在于使用甘露糖醛酸含量为甘露糖醛酸单元占60％的藻酸制备甘露糖醛酸均聚物序列。
19.如权利要求11所述的方法，其特征在于使用古洛糖醛酸含量为古洛糖醛酸单元占65-70％的藻酸制备古洛糖醛酸均聚物序列。
20.如权利要求11所述的方法，其特征在于在步骤a)中于40-100℃用0.05-5mol/1的酸对藻酸进行水解。
21.如权利要求11所述的方法，其特征在于在步骤a)中在水解10-30分钟后中断水解以分离出甘露糖醛酸和古洛糖醛酸单元的混合序列，随后完成水解直至甘露糖醛酸均聚物序列部分被溶解。
22.一种由藻酸盐制备古洛糖醛酸均聚物序列和甘露糖醛酸均聚物序列的部分的方法，所述方法包括以下步骤：
a)用酸对藻酸进行水解，以形成古洛糖醛酸均聚物序列、甘露糖醛酸均聚物序列和甘露糖醛酸和古洛糖醛酸单元的混合序列这些部分，由此含有甘露糖醛酸和古洛糖醛酸单元的混合序列的部分溶解，含有古洛糖醛酸均聚物序列和甘露糖醛酸均聚物序列的部分保持不溶解，
其特征在于：
b)将不溶解的部分悬浮在水中，用碱液将pH值调节至pH 2.8-4.0，由此含有甘露糖醛酸均聚物序列的部分溶解，而含有古洛糖醛酸均聚物序列的部分保持不溶解，
在步骤b)之后以酸形式或盐形式分离出古洛糖醛酸均聚物序列部分，
从步骤b)获得的溶解部分中如下分离出含甘露糖醛酸均聚物序列的部分：
(i)通过用酸将pH值调节至pH 1.4-0.5以沉淀出甘露糖醛酸均聚物序列部分
或(ii)通过使用薄膜技术，然后是除去水和干燥甘露糖醛酸均聚物序列部分的步骤
或(iii)用醇沉淀出甘露糖醛酸均聚物序列部分。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于在步骤a)和/或步骤b)之后通过过滤、离心或沉淀使不溶解部分与溶解部分分离。
24.如权利要求22所述的方法，其特征在于在步骤b)中将pH值调节至3.5-4.0，得到古洛糖醛酸均聚物序列的部分。
25.如权利要求22所述的方法，其特征在于在步骤b)中将pH值调节至2.8-3.0，得到古洛糖醛酸均聚物序列的部分。
26.如权利要求22所述的方法，其特征在于在步骤b)中将pH值调节至3.0-3.5，制得古洛糖醛酸均聚物序列的部分。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于在步骤b)中将pH值调节至3.3。
28.如权利要求22所述的方法，其特征在于在步骤i)中将pH值调节至1.3，以沉淀出甘露糖醛酸均聚物序列的部分。
29.如权利要求22所述的方法，其特征在于使用甘露糖醛酸含量为甘露糖醛酸单元占60％的藻酸制备甘露糖醛酸均聚物序列。
30.如权利要求22所述的方法，其特征在于使用古洛糖醛酸含量为古洛糖醛酸单元占65-70％的藻酸制备古洛糖醛酸均聚物序列。
31.如权利要求22所述的方法，其特征在于在步骤a)中于40-100℃用0.05-5mol/l的酸对藻酸进行水解。
32.如权利要求22所述的方法，其特征在于在步骤a)中在水解10-30分钟后中断水解以分离出甘露糖醛酸和古洛糖醛酸单元的混合序列，随后完成水解直至甘露糖醛酸均聚物序列部分被溶解。
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