CN108949936A - 一种镁离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器 - Google Patents

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CN108949936A CN201810638245.5A CN201810638245A CN108949936A CN 108949936 A CN108949936 A CN 108949936A CN 201810638245 A CN201810638245 A CN 201810638245A CN 108949936 A CN108949936 A CN 108949936A
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罗云波
许文涛
黄昆仑
杜再慧
田晶晶
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明提供一种镁离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器，包括：(1)切割体系，(2)sPCR扩增体系，(3)包含ABTS显色液的检测体系。本发明通过巧妙地设计引物、模板及探针，使得在镁离子存在下可对模板进行超快扩增，并使扩增产物在适宜环境中形成G四链体。进一步利用G四链体的类过氧化物酶活性进行显色，解决了传统PCR产物难于可视化检测的难题，实现了对镁离子的快速、可视化检测。不仅如此，本发明提供的传感器对镁离子具有高特异、高灵敏的特点，检测结果更加客观、准确。

Description

一种镁离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域，具体地说，涉及一种镁离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器。
背景技术
镁，化学符号是Mg，原子序数是12，原子量是24，属第IIA族，是一种银白色有金属光泽的金属，在自然界中分布较广。中国营养学会建议，成年男性每天约需镁350毫克，成年女性约为300毫克，孕妇以及喂奶期女性约为450毫克，2-3岁儿童为150毫克，3-6岁为200毫克。可耐受最高摄入量(UL)定为700mg/d。镁是人体细胞内的主要阳离子，浓集于线粒体中，仅次于钾和磷，在细胞外液仅次于钠和钙居第三位，是体内多种细胞基本生化反应的必需物质。镁是一种参与生物体正常生命活动及新陈代谢过程必不可少的元素。镁缺乏在临床上主要表现为情绪不安、易激动、手足抽搐、反射亢进等，正常情况下，由于肾的调节作用，口服过量的镁一般不会发生镁中毒。当肾功能不全时，大量口服镁可引起镁中毒，表现为腹痛、腹泻、呕吐、烦渴、疲乏无力，严重者出现呼吸困难、紫绀、瞳孔散大等。
常见的镁离子的检测方法主要有原子光谱法，包括原子吸收光谱、电感耦合等离子体发射光谱法和焚光光谱法，可见分光光度法，流动注射化学发光法和微分电位溶出法等，但是这些检测方法都需要昂贵的仪器和经过专业培训的操作人员，样品前处理也比较繁琐，不具有普遍适用性。因此，研究出简单快速、成本低廉、可准确定量的检测方法十分必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种镁离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器。
本发明的另一目的是提供基于生物传感器技术检测镁离子的方法。
为了实现本发明目的，发明人根据镁离子的特异性核酶，设计通用隔断引物对其进行超快聚合酶链式反应(super Polymerase Chain Reaction,sPCR)，结合富G序列在K+存在条件下形成具有类过氧化物酶活性的G四链体，构建了一种新型的基于隔断引物的镁离子切割型功能核酸比色传感器。
第一方面，本发明提供一种镁离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器，包括：(1)切割体系，(2)sPCR扩增体系，(3)包含ABTS显色液的检测体系。
所述检测体系用于对待测样品依次经由所述切割体系、sPCR扩增体系进行反应后所得产物进行显色检测；
其中，所述切割体系包括底物链和酶链：
底物链：5′-GTCACGAGTCACTATrA—GGAAGATGGCGAAA-3′
酶链：5′-TTTCGCCATCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGACTCGTGAC-3′
其中，rA表示核糖核酸；-表示镁离子切割位点；
所述sPCR扩增体系包括：正向隔断引物、反向引物、模板：
正向隔断引物：5′-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-隔断物-CCAACCCGCCCTACCCACTCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′
反向引物：5′-GGAAGATGGCGAAATTCGGGGC-3′
模板：5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACCTCAGTATCAGTGCTATACGTCGATCAGTAGCCCCGAATTTCGCCATCTTCCCCACCACCGCCTCGTAACTCAACTTCC-3′。
其中，所述正向隔断引物中的隔断物为聚六乙二醇。其它能够阻止PCR延伸的隔断结构也可用于本发明。
所述DNA聚合酶为Ex Taq DNA聚合酶，所述缓冲液为10×Ex Taq Buffer，二者与所述dNTP均购自赛默飞科技(Thermo Scientific Life Technologies)。
本发明所述的检测体系包括：酶活缓冲液，氯高铁血红素溶液。
其中，所述酶活缓冲液为：100mM Tris、120mM NaCl、10mM MgCl2、100mM KCl，pH8.4。
所述氯高铁血红素溶液为20mM的氯高铁血红素原液与上述酶活缓冲液按照2μL：1mL的比例混合后的氯高铁血红素稀释溶液。
本发明还提供前述传感器在检测镁离子方面中的应用，所述检测可表现为定性检测或定量检测。
第二方面，本发明提供了一种利用前述传感器对镁离子进行定性检测的方法，包括如下步骤：
S1、向所述切割体系中加入待测样品，进行切割反应；
S2、将S1所得切割产物加入所述sPCR扩增体系中进行超快聚合酶链式反应，得sPCR产物；
S3、利用所述检测体系对所述sPCR产物进行检测。
S1具体如下：将底物链与酶链按等摩尔比例混合，用缓冲液稀释至浓度1μM-2μM，85℃-95℃加热15min，然后降温至25-37℃，得到核酶液；向35μL所述核酶液中加入待测样品溶液，形成40μL体系，于36-38℃孵育4-6min，然后加入4-6μL终止液，得到切割产物。
进一步地，所述检测体系包括酶活缓冲液和氯高铁血红素稀释溶液，将酶活缓冲液、氯高铁血红素稀释溶液和sPCR产物按体积比为8:1:1混匀(总体积为100μL)，在35-38℃条件下反应20-40min，加入与前述混合物等体积的ABTS显色液，混匀，35-38℃避光孵育，肉眼进行监测。
第三方面，本发明提供了一种利用前述传感器对镁离子进行定量检测的方法，包括如下步骤：
SI、制作标准曲线：
利用已知浓度的镁离子溶液，构建具有不同镁离子浓度的切割体系，sPCR扩增与检测步骤与前述定性检测的步骤相同；
以镁离子浓度为横坐标，以OD415值为纵坐标，绘制标准曲线；
SII、按照前述定性检测方法对待测样品进行检测，将测得的OD415值代入标准曲线，计算得到待测样品中镁离子的含量，实现对镁离子的定量检测。
本发明提供一种基于生物传感器技术检测镁离子的方法，首先设计镁离子特异性核酶，包括底物链和酶链，将底物链与酶链进行杂交形成具有特异性镁离子切割活性的核酶，当镁离子存在的条件下发生切割反应，切割下来的核酸片段作为反向引物(即目标引发分子)，与正向隔断引物一起对模板进行PCR扩增反应，所得PCR产物的一端带有一段单链核酸序列；所述PCR产物在K+存在条件下，形成G四链体，催化H2O2和ABTS显色，进而完成对镁离子的快速可视化检测。或者
通过PCR产物促发HCR反应，使得HCR产物在K+存在条件下形成G四链体，催化H2O2和ABTS显色，进而完成对锌离子的快速可视化检测。
本发明中，显色液可用TMB替代。
所述底物链和酶链的碱基序列如下：
底物链：5′-GTCACGAGTCACTATrA—GGAAGATGGCGAAA-3′
酶链：5′-TTTCGCCATCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGACTCGTGAC-3′
其中，rA表示核糖核酸；-表示镁离子切割位点；
所述正向隔断引物的5′端具有富G碱基序列，3′端含有可与模板结合的碱基序列，所述富G碱基序列和可与模板结合的碱基序列之间至少设有一阻断物，所述阻断物可阻断PCR延伸。
优选地，所述阻断物为聚六乙二醇。
优选地，所述底物链的3′端添加有一段可增加所述反向引物与模板结合Tm值的碱基序列，使得PCR退火温度控制在50-60℃。
前述的方法，镁离子检测中所用的底物链、酶链、正向隔断引物、反向引物和模板的碱基序列如下(SEQ ID NO:1-5)：
底物链：5′-GTCACGAGTCACTATrA—GGAAGATGGCGAAATTCGGGGC-3′
酶链：5′-TTTCGCCATCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGACTCGTGAC-3′
正向隔断引物：5′-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-聚六乙二醇-CCAACCCGCCCTACCCACTCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′
反向引物：5′-GGAAGATGGCGAAATTCGGGGC-3′
模板：5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACCTCAGTATCAGTGCTATACGTCGATCAGTAGCCCCGAATTTCGCCATCTTCCCCACCACCGCCTCGTAACTCAACTTCC-3′
其中，rA表示核糖核酸；-表示镁离子切割位点。
本发明还提供与上述方法配套的检测试剂盒，所述试剂盒至少包括以下成分：底物链、酶链、正向隔断引物和模板等。
本发明试剂盒的检测分析原理：首先将底物链与酶链进行杂交形成具有特异性镁离子切割活性的核酶，当镁离子存在的条件下发生切割反应，切割下来的核酸片段可以与模板结合进行PCR延伸，由于通用的正向隔断引物的隔断作用阻碍了聚合酶的延伸，使得PCR产物是带有长富G序列的单链，PCR产物在适宜的缓冲条件下(缓冲液中含有K+)形成G四链体，催化H2O2和ABTS显色，进而完成对Mg2+的检测。
具体检测方法如下：
1)核酶的构建：将底物链与酶链I按等摩尔比例混合，用缓冲液稀释至浓度1μM-2μM，85-95℃加热15min，然后缓慢降至25-37℃(大约耗时45min)，即得核酶液；
2)切割反应：向35μL上述核酶液中加入待测样品溶液，形成40μL体系，于37℃孵育4-6min，然后加入4-6μL终止液，得到切割产物；
3)超速PCR反应：配制由正向隔断引物、切割产物、模板、DNA聚合酶、dNTP、反应缓冲液和ddH2O组成的PCR反应体系，进行PCR扩增反应；
4)显色反应：将80μL酶活缓冲液、10μL氯高铁血红素溶液与10μL PCR产物混合，于37℃反应30min，加入100μL ABTS显色液，混匀，37℃避光孵育5-10min，根据加入显色液前后溶液颜色的变化来判断待测样品中是否含有镁离子以及镁离子浓度的高低。可通过肉眼直接观察溶液颜色的变化，或利用酶标仪测定溶液的OD值变化。
其中，步骤1)所述缓冲液的配方为：140mM NaCl,50mM Tris,pH 7.5。
步骤2)所述终止液的配方为：0.2M EDTA，2M NaCl,0.5M Tris。
步骤4)所述酶活缓冲液的配方为：100mM Tris、120mM NaCl、10mM MgCl2、100mMKCl，pH8.4。
步骤4)所述氯高铁血红素溶液的配制方法为：用DMSO配制浓度为20mM的氯高铁血红素原液，将2μL氯高铁血红素原液与1mL所述酶活缓冲液混合，即得。
优选地，步骤3)中PCR反应体系如下：
PCR反应程序如下：90-95℃ 2s，55-60℃ 3s，30-40个循环。优选地，PCR反应程序为：95℃ 2s，58℃ 3s，36个循环。
配制一系列浓度的镁离子标准溶液，按照上述方法进行检测。步骤4)利用酶标仪测定溶液OD415值来判断显色情况，并根据溶液颜色变化绘制显色的标准曲线：y＝0.1008x+0.0255，R2＝0.9974，从而可实现对镁离子的定量检测。
本方法的镁离子检测限是0.5-15μM。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明通过建立一种隔断快速扩增镁离子切割型功能核酸比色传感器，用于镁离子的快速可视化检测。根据镁离子的特异性核酶，设计隔断引物对其进行超快聚合酶链式反应，结合富G序列在K+存在条件下形成具有类过氧化物酶活性的G四链体，构建了一种新型的基于通用隔断引物的镁切割型功能核酸比色传感器，并提供了一种快速、可视的镁离子检测新方法。使样品的检测时间大大缩短，检出限达μM级，而且本发明成功解决了PCR产物的可视化问题，对解决现场实时快速检测具有重要的现实意义。
(一)本方法首次构建了隔断引物，对模板进行超快扩增，将耗时3小时左右的传统PCR过程缩减到10分钟，显著减少了PCR反应的用时。
(二)引物的隔断作用阻碍了聚合酶的延伸，获得单链核酸序列。
(三)结合G四链体的类过氧化物酶活性进行显色，PCR产物可直接与ABTS发生颜色变化，解决了传统PCR产物难于可视化检测的难题。
(四)本方法可实现镁离子的大批量、快速检测。
附图说明
图1为本发明实施例1中镁离子核酶制备并切割验证的结果；其中，泳道1：核酶-Mg；泳道2-4：切割体系。
图2为本发明实施例1中超速PCR仪的外观结构。
图3为本发明实施例1中超速PCR扩增产物的胶图；其中，泳道1：DNA Marker2000；泳道2-3：镁离子超速PCR产物。
图4为本发明实施例1中根据不同浓度镁离子及溶液颜色变化绘制显色的标准曲线。
图5为本发明实施例2中生物传感器特异性检测结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
本发明中，ABTS显色液的配方为：1mL DNAzyme底物缓冲液，柠檬酸0.933g，蒸馏水100mL，5μL ABTS底物溶液，1μL 30％H2O2。
DNAzyme底物缓冲液：即为pH 3.6的柠檬酸盐缓冲液，配方为：Na2HPO4.12H2O1.843g，柠檬酸0.933g，蒸馏水100mL。
ABTS底物溶液：取20mg 2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐粉末(购自Sigma公司)溶于1mL DMSO，即得。
实施例1镁离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器的建立
1、实验材料
SYBR Gold核酸染料、核酸分子量标准ultra-low range DNA ladder、dNTP、ExTaq DNA聚合酶、10×Taq buffer、氯高铁血红素、氯化镁、2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二胺盐(ABTS)、H2O2、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、MES、LiCl、Tris、乙二胺四乙酸二钠，硫酸，四甲基联苯胺，尿素，均购自赛默飞科技(Thermo Scientific LifeTechnologies)。实验用水均来自Milli-Q纯水系统。
序列设计如下(SEQ ID NO:1-5)：
注：核酶切割目标产物和扩增模板3’端序列互补；
核酶底物链末端所添加的加粗碱基序列是为了增加与模板结合Tm值；切割位点用“-”表示；
17E核酶底物链-Mg和核酶酶链-Mg共同组成镁离子的特异性核酶(核酶-Mg)。
2、核酶的构建及切割反应体系的验证
将4μL核酶底物链-Mg(10μM母液)与4μL核酶酶链-Mg(10μM母液)用缓冲液(终浓度为140mM NaCl,50mM Tris,pH 7.5)稀释至40μL，95℃加热15min，然后缓慢降至37℃，大约耗时45min。
加入5μL氯化镁溶液(1μM母液)，形成40μL体系，于37℃下孵育5分钟，在40μL体系中加入5μL终止液(浓度为0.2M EDTA，2M NaCl,0.5M Tris)，混匀后4摄氏度保存。用20％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证，得到镁离子核酶切割后的小片段，证明镁离子核酶的制备与切割成功(图1)。
3、超速PCR装置的搭建以及超速PCR反应体系的建立与验证
超速PCR装置的主要结构如图2所示，其具体的结构、连接方式和工作原理、工作过程包括：超速PCR装置的温度变化经由一个95℃的高温水浴锅和一个58℃的中温水浴锅来实现。采用Light Cycler型号的毛细管(20μL，04 929 292 001，Roche)作为PCR样品室。通过快速离心的方式，样品会分别聚集到各个毛细管一端；离心完成后带有样品的毛细管被固定在一个专用的塑料支架上。
镁离子超速PCR体系如下：
在实际检测中，切割产物是指上述切割反应体系中，用待测样品替换标样。
在冰上配制10μL反应体系，迅速置于超速PCR反应装置中进行温度控制。超速PCR反应程序：95℃ 2s，58℃ 3s，36个循环，总计3min。
完成超速PCR反应过程，使用2％琼脂糖凝胶电泳验证超速PCR反应体系的扩增效果，反应条件：120V 0.5h，拍照系统：Molecular Imager Gel Doc XR(Bio-Rad)。
实验结果表明，在切割产物存在时可以使模板在短时间内进行扩增(图3)。
4、显色模块的建立与验证
80μL酶活缓冲液(100mM Tris、120mM NaCl、10mM MgCl2、100mM KCl，pH8.4)，10μL氯高铁血红素溶液与10μL PCR产物，混匀后37℃反应30min，使PCR产物结合氯高铁血红素形成具有类过氧化物酶活性的G四链体结构，加入100μL ABTS显色液，混匀，37℃避光孵育10min，酶标仪测定OD415。
所述氯高铁血红素溶液的配制方法为：用DMSO配制浓度为20mM的氯高铁血红素原液，将2μL氯高铁血红素原液与1mL所述酶活缓冲液混合，即得。
5、镁离子超灵敏、可视化的快速检测
根据上述优化体系，分别加入不同浓度的0.5、1、5、10、15μM的Mg2+的切割产物进行超快PCR，PCR产物在适宜的缓冲条件下形成G四链体进行ABTS显色，根据颜色变化绘制显色的标准曲线(图4)。
Mg2+检测范围是0.5-15μM(可在此范围内实现定量检测)，最低检出限是0.12μM。
实施例2传感器的特异性考察
按照实施例1构建的生物传感器，分别将0.5μM Mg2+、50μM的Ag+、Cu2+、Zn2+、Cd2+、Hg2+、Cr3+、Fe2+加入到体系中进行检测，结果表明，所建立的Mg2+生物传感器具有较好的特异性(图5)。
实施例3加标实验
取高纯水用实施例1构建的生物传感器进行检测，Mg2+无检出，对其进行加标实验，连续测定多次所得结果见表1。
表1 Mg2+加标回收实验结果
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种镁离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器
<130> KHP181111559.2
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtcacgagtc actataggaa gatggcgaaa ttcggggc 38
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tttcgccatc ttctccgagc cggtcgaaat agtgactcgt gac 43
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgggtaggg cgggttggcc aacccgccct acccactcat cgcaccgtca aaggaacc 58
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggaagatggc gaaattcggg gc 22
<210> 5
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcatcgcacc gtcaaaggaa cctcagtatc agtgctatac gtcgatcagt agccccgaat 60
ttcgccatct tccccaccac cgcctcgtaa ctcaacttcc 100

Claims (10)

1.一种镁离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器，其特征在于，包括：(1)切割体系，(2)sPCR扩增体系，(3)包含ABTS显色液的检测体系；
所述检测体系用于对待测样品依次经由所述切割体系、sPCR扩增体系进行反应后所得产物进行显色检测；
其中，所述切割体系包括底物链和酶链：
底物链：5′-GTCACGAGTCACTATrA—GGAAGATGGCGAAA-3′
酶链：5′-TTTCGCCATCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGACTCGTGAC-3′
其中，rA表示核糖核酸；-表示镁离子切割位点；
所述sPCR扩增体系包括：正向隔断引物、反向引物、模板：
正向隔断引物：5′-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-隔断物-CCAACCCGCCCTACCCACTCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′
反向引物：5′-GGAAGATGGCGAAATTCGGGGC-3′
模板：5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACCTCAGTATCAGTGCTATACGTCGATCAGTAGCCCCGAATTTCGCCATCTTCCCCACCACCGCCTCGTAACTCAACTTCC-3′。
2.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述正向隔断引物中的隔断物为聚六乙二醇。
3.根据权利要求1或2所述的传感器，其特征在于，所述检测体系包括：酶活缓冲液和氯高铁血红素溶液。
4.权利要求1-3任一项所述传感器在检测镁离子方面中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测为定性检测或定量检测。
6.利用权利要求1-3任一项所述传感器对镁离子进行定性检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、向所述切割体系中加入待测样品，进行切割反应；
S2、将S1所得切割产物加入所述sPCR扩增体系中进行超快聚合酶链式反应，得sPCR产物；
S3、利用所述检测体系对所述sPCR产物进行检测。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，S1具体如下：将底物链与酶链按等摩尔比例混合，用缓冲液稀释至浓度1μM-2μM，85℃-95℃加热15min，然后降温至25-37℃，得到核酶液；向35μL所述核酶液中加入待测样品溶液，形成40μL体系，于36-38℃孵育4-6min，然后加入4-6μL终止液，得到切割产物。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述检测体系包括酶活缓冲液和氯高铁血红素稀释溶液，将酶活缓冲液、氯高铁血红素稀释溶液和sPCR产物按体积比为8:1:1混匀，在35-38℃条件下反应20-40min，加入与前述混合物等体积的ABTS显色液，混匀，35-38℃避光孵育，肉眼进行监测。
9.利用权利要求1-3任一项所述传感器对镁离子进行定量检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
SI、制作标准曲线：
利用已知浓度的镁离子溶液，构建具有不同镁离子浓度的切割体系，sPCR扩增与检测步骤与权利要求6中的步骤相同；
以镁离子浓度为横坐标，以OD415值为纵坐标，绘制标准曲线；
SII、按照权利要求6所述的方法对待测样品进行检测，将测得的OD415值代入标准曲线，计算得到待测样品中镁离子的含量，实现对镁离子的定量检测。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述不同镁离子浓度的浓度区间为0.5-15μM。
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