CN108844903A - 一种适用于碱水环境下鱼类氨排泄率的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种针对碱水环境下鱼类排氨率的测定方法；包括：将每尾鱼独立淡水稳定后，换同体积碱水胁迫，称量鱼体质量和体长；分别取胁迫前后的水样，每200mL水样中依次加入10μL试剂I、20μL试剂II、10μL试剂III后在25～35℃黑暗孵育；630nm波长下检测吸光值；标准曲线制作过程中采用改进标曲，标曲用水的碱度与实验水体浓度一致，分别将水样的吸光值代入氨氮浓度和吸光值的标准曲线方程，得出胁迫前后的水样中的氨氮浓度；按氨氮排泄率计算公式计算得到碱水环境下鱼类排氨率。本发明解决了常规测定方法在碱水环境下应用误差高的问题，提高测定准确率，为鱼类对碱性环境的适应机制研究提供基础技术。

Description

一种适用于碱水环境下鱼类氨排泄率的测定方法
技术领域
本发明涉及生理学领域，尤其涉及一种适用于鱼类氨排泄率的测定方法，具体来说是一种针对碱水环境下鱼类氨排泄率的测定方法。
背景技术
鱼类的氮废物排泄是鱼类能量代谢的重要环节，氨和尿素是蛋白和核苷酸代谢的重要产物，也是鱼类氮废物排泄的主要形式。鱼类氮废物排泄受N摄入量、水体pH、盐度、温度、环境NH3和特殊行为等多种因素的影响。氨是鱼类主要的氮代谢终产物，它主要由肝脏、肾脏和肌肉中的α-氨基酸经脱氨基作用产生。海水和淡水硬骨鱼在水中以氨氮形式排泄氮废物，氨氮占总氮废物排泄的60-95％。氨不但可以以非离子形式的NH3排泄，还可以离子形式的NH4 +排泄。
碱性环境会抑制氨排泄，从而使鱼体内血氨升高而对鱼体产生毒害作用。当淡水硬骨鱼暴漏于碱水中排氨率会立即降低，相对应的血浆氨浓度升高。造成排氨率降低的原因之一是高碱度导致鳃边界层用于捕获NH3的合成NH4 +的H+减少。的平衡方程的pK大约为9.5(15℃)，环境中水的pH升高相应的鳃中水的pH升高或者使H+浓度降低，H+浓度降低使平衡朝向NH3合成。鳃中水的pH升高降低了ΔpH，从而降低了排氨率。
因此测定碱性环境下氨排泄的变化对于揭示鱼类对碱性环境的适应机制极为重要。目前用于测定水环境中氨浓度主要采用Berthelot反应：氨、苯酚和次氯酸盐在碱性环境下发生反应，生成蓝色的靛酚。这种方法可以直接检测淡水和海水中的氨，且对氨检测的特异性较高，有机氮、亚硝酸盐和硝酸盐等含氮化合物对检测影响很小。但是这一方法直接应用碱水环境时则误差较大，目前尚缺少有针对碱水(pH＞9.0)环境下鱼类排氨率的测定的有效方法。
发明内容
本发明的目的是建立一种针对碱水环境下鱼类排氨率的测定方法，解决了常规测定方法在碱水环境下应用误差高的问题，提高测定准确率，为鱼类对碱性环境的适应机制研究提供基础技术。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明涉及一种针对碱水环境下鱼类排氨率的测定方法，所述测定方法包括如下步骤：
1)将每尾鱼独立用淡水稳定预设时间t1后，换同体积碱水胁迫预设时间t2；称量鱼体质量和体长；
2)分别取步骤1)胁迫前后的水样，每200mL水样中依次加入10μL试剂I、20μL试剂II、10μL试剂III后在25～35℃黑暗孵育；所述试剂I为苯酚的乙醇溶液，试剂III为硝普钠水溶液，试剂II为2∶1的二氯异氰尿酸钠水溶液和柠檬酸钠/NaOH水溶液的混合溶液；
3)630nm波长下检测吸光值；分别将水样的吸光值代入氨氮浓度和吸光值的标准曲线方程，得出步骤1)胁迫前后的水样中的氨氮浓度；
4)按如下式所述的氨氮排泄率计算公式计算得到碱水环境下鱼类排氨率；
其中，AER为氨氮排泄率，单位为μmol N/kg/h；[Tamm]i和[Tamm]f分别为初始和结束总氨氮浓度，单位为μmol N/L；V为水体体积，单位为L；Δt为排泄初始和结束时间差，单位为h；m为鱼体体重，单位为kg。
优选的，所述氨氮浓度和吸光值的标准曲线方程是基于改进标曲获得的，所述改进标曲用水的碱度与碱水环境中的碱水浓度一致；所述标准曲线方程是通过包含如下步骤的方法获得的：
A1、配制标准溶液：NH4Cl(AR)100～110℃烘2～4h，配制成浓度为1mM的标准液；然后加入无氨水配制成100μM的标准溶液备用；
A2、通过将标准溶液和碱水混合分别配制氨氮浓度为0μM、3μM、6μM、9μM、12μM、15μM、18μM、21μM、24μM、27μM、30μM的标准样品；
A3、步骤A2中各氨氮浓度浓度的标准样品，每200mL标准样品中依次加入10μL试剂I、20μL试剂II、10μL试剂III后在25～35℃黑暗孵育；
A4、630nm波长下检测吸光值，获得吸光值与氨氮浓度的标准曲线方程。
优选的，标准样品中加入的碱水与步骤1)中的碱水的碱度一致。
优选的，步骤1)中，所述预设时间t1为6-8h，所述预设时间t2为24-96h，期间每24h换水一次。
优选的，步骤2)中，所述苯酚的乙醇溶液是在每100mL95％乙醇溶解入10g苯酚制备而得。
优选的，步骤2)中，所述硝普钠水溶液是在每100mL去离子水中溶解入0.5g制备而得。
优选的，步骤2)中，所述二氯异氰尿酸钠水溶液是在每100mL去离子水中溶解入0.4g二氯异氰尿酸钠制备而得；所述柠檬酸钠/NaOH水溶液是在每100mL去离子水中溶解入40g柠檬酸钠和3.2g Na0H制备而得。
优选的，步骤2)中，所述孵育时间为0.5～1.5h。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
目前没有针对碱水环境下鱼类氨排泄的专用方法，尤其是在标准曲线制作过程中如果采用淡水或者海水中的方法会导致测定结果误差较大；而本发明解决了常规测定方法在碱水环境下应用误差高的问题，提高测定准确率，为鱼类对碱性环境的适应机制研究提供基础技术。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例
本实施例涉及一种针对碱水环境下鱼类排氨率的测定方法，具体操作如下：
配制试剂：
试剂I：10g苯酚溶于100mL95％乙醇中。
试剂II：试剂A(0.4g二氯异氰尿酸钠溶于100mL去离子水中，现配现用)与试剂B(40g柠檬酸钠+3.2g NaOH溶于100mL去离子水)按体积比2∶1比例混匀。
试剂III：0.5g硝普钠溶于100mL去离子水中。
检测步骤：
1、根据鱼体大小将每尾鱼(体重1-2g)分别独立放在盛有600mL淡水的聚乙烯缸中，稳定6h后换同体积碱水开始胁迫，胁迫周期96h，期间每24h换水一次。
2、分别于淡水稳定阶段0、6h，胁迫时间段6h、12h、18h、24h、48h、72h、96h取水样3mL，冻存于-20℃，待检测。实验结束后称量鱼体质量和体长。
3、将水样在室温下解冻(样品解冻过一次后，最好不要再用于氨浓度分析)，涡旋。
4、配制标准溶液：NH4Cl(AR)105℃烘3h，配制成浓度为1mM的标准液。然后用15mL离心管取1mL标准液(1mM NH4Cl)加入9mL无氨水配制成100μM的标准溶液备用。标准曲线的设置按照表1，两个重复，依次加入。因碱度会干扰检测结果，采用改进标曲，标准品中加入的碱水需与样品碱度保持一致。
5、取200mL水样依次加入96孔酶标板中，每个样品设置两个重复。
6、依次加入试剂I10μL，试剂II20μL，试剂III10μL。
7、25～35℃黑暗孵育1h。
8、630nm波长下检测吸光值。
9、将样品的吸光值代入标准曲线方程，即可得出水样中的氨氮浓度。
10、氨氮排泄率计算公式：
其中，AER为氨氮排泄率(μmol N/kg/h)，[Tamm]i和[Tamm]f分别为初始和结束总氨氮浓度(μmol N/L)，V为水体体积(L)，Δt为排泄初始和结束时间差，m为体重(kg)。
表1氨氮浓度测定标准曲线设置
注：因碱度会干扰检测结果，标准品中加入的碱水需与样品碱度保持一致。
附：普通标曲方法与改进标曲(改进标曲用水的碱度与实验水体浓度一致)方法测定误差对比：从表2中可以看出不同碱水氨氮浓度在普通标曲中都表现出了较高的误差，平均误差达到4.15umol/L；使用改进标曲误差明显降低，平均误差为0.27umol/L，误差下降了93％。
表2普通标曲方法与改进标曲方法测定误差对比

Claims (8)

1.一种针对碱水环境下鱼类排氨率的测定方法，其特征在于，所述测定方法包括如下步骤：
1)将每尾鱼独立用淡水稳定预设时间t1后，换同体积碱水胁迫预设时间t2；称量鱼体质量和体长；
2)分别取步骤1)胁迫前后的水样，每200mL水样中依次加入10μL试剂I、20μL试剂II、10μL试剂III后在25～35℃黑暗孵育；所述试剂I为苯酚的乙醇溶液，试剂III为硝普钠水溶液，试剂II为体积比为2∶1的二氯异氰尿酸钠水溶液和柠檬酸钠/NaOH水溶液的混合溶液；
3)630nm波长下检测吸光值；分别将水样的吸光值代入氨氮浓度和吸光值的标准曲线方程，得出步骤1)胁迫前后的水样中的氨氮浓度；
4)按如下式所述的氨氮排泄率计算公式计算得到碱水环境下鱼类排氨率；
其中，AER为氨氮排泄率，单位为μmol N/kg/h；[Tamm]i和[Tamm]f分别为初始和结束总氨氮浓度，单位为μmol N/L；V为水体体积，单位为L；Δt为排泄初始和结束时间差，单位为h；m为鱼体体重，单位为kg。
2.根据权利要求1所述的针对碱水环境下鱼类排氨率的测定方法，其特征在于，所述标准曲线方程是基于改进标曲获得的，所述改进标曲用水的碱度与碱水环境中的碱水浓度一致；所述标准曲线方程是通过包含如下步骤的方法获得的：
A1、配制标准溶液：NH4Cl 100～110℃烘2～4h，配制成浓度为1mM的标准液；然后加入无氨水配制成100μM的标准溶液备用；
A2、通过将标准溶液和碱水混合分别配制氨氮浓度为0μM、3μM、6μM、9μM、12μM、15μM、18μM、21μM、24μM、27μM、30μM的标准样品；
A3、分别取步骤A2中各氨氮浓度的标准样品，每200mL标准样品中依次加入10μL试剂I、20μL试剂II、10μL试剂III后在25～35℃黑暗孵育；
A4、630nm波长下检测吸光值，获得吸光值与氨氮浓度的标准曲线方程。
3.根据权利要求2所述的针对碱水环境下鱼类排氨率的测定方法，其特征在于，标准样品中加入的碱水与步骤1)中的碱水的碱度一致。
4.根据权利要求1所述的针对碱水环境下鱼类排氨率的测定方法，其特征在于，步骤1)中，所述预设时间t1为6-8h，所述预设时间t2为24-96h，期间每24h换水一次。
5.根据权利要求1所述的针对碱水环境下鱼类排氨率的测定方法，其特征在于，步骤2)中，所述苯酚的乙醇溶液是在每100mL95％乙醇溶解入10g苯酚制备而得。
6.根据权利要求1所述的针对碱水环境下鱼类排氨率的测定方法，其特征在于，步骤2)中，所述硝普钠水溶液是在每100mL去离子水中溶解入0.5g制备而得。
7.根据权利要求1所述的针对碱水环境下鱼类排氨率的测定方法，其特征在于，步骤2)中，所述二氯异氰尿酸钠水溶液是在每100mL去离子水中溶解入0.4g二氯异氰尿酸钠制备而得；所述柠檬酸钠/NaOH水溶液是在每100mL去离子水中溶解入40g柠檬酸钠和3.2g NaOH制备而得。
8.根据权利要求1所述的针对碱水环境下鱼类排氨率的测定方法，其特征在于，步骤2)中，所述孵育时间为0.5～1.5h。
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