CN110426510B - 一种硬骨鱼类耐碱性能的评价方法 - Google Patents

一种硬骨鱼类耐碱性能的评价方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种硬骨鱼类耐碱性能的评价方法，通过碳酸盐碱度胁迫对测试鱼血浆氮废物浓度的影响，确定鱼类的碱度耐受性。本发明的实验鉴定周期短，不受外界水质条件限制，不需要花费大量实验费用，非致死；较为经济、方便快捷、非致死的耐碱鉴定方法。

Description

一种硬骨鱼类耐碱性能的评价方法
技术领域
本发明属于碱度耐受性的评价领域，特别涉及一种硬骨鱼类耐碱性能的评价方法。
背景技术
pH和碱度变化是水产养殖过程及某些天然水域环境对鱼类造成胁迫的关键因子。我国有6.9亿亩盐碱水资源，遍及我国19个省市和自治区，大多属于非海洋咸水，这些盐碱水资源既不能为人畜饮用，也不能用于农业直接利用，大部分处于荒芜的状态。我国率先在华北滨海地区及沿黄地区开展了盐碱水养殖，在河北、山东、江苏、天津、甘肃、宁夏、陕西、山西、吉林、河南、新疆等省市自治区均有不同程度盐碱水资源渔业开发利用，为盐碱水资源的开发利用开创了新途径，为新时期渔业转型升级提供了新的解决途径，多次被列为国家渔业发展规划。2019年年初农业农村部联合十部委颁发的《关于加快推进水产养殖业绿色发展的若干意见》将盐碱水养殖列为拓展渔业发展空间、渔业转型升级的重点方向。虽然国盐碱水养殖产业已经初具规模，但由于盐碱水受气候、人类活动等影响较大，缺少适宜大规模推广的耐盐碱品种和驯养技术制约了盐碱渔业发展，鱼类耐碱性能的评价是开展高盐碱水养殖和选育耐盐碱品种的技术基础。
目前国内外尚缺少鱼类耐碱性能评价的有效方法，现阶段研究大多数以96h半致死浓度来判定鱼类对碱度的耐受性。半致死方法存在问题是：首先往往半致死采用的碱度浓度较高，较自然真实碱度浓度差别较大，不能直接用于评估鱼类对天然碱度浓度的耐受性；其次，致死性试验不能判断鱼类对高碱环境的适应过程，无法为盐碱水驯养技术提供参考；第三，致死浓度下鱼类各项生理机能发生实质性改变，不能直接作为鱼类耐碱选育的指标。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种硬骨鱼类耐碱性能的评价方法，目前国内外尚缺少鱼类耐碱性能评价的有效方法，现阶段研究大多数以96h半致死浓度来判定鱼类对碱度的耐受性。半致死方法存在问题是：首先往往半致死采用的碱度浓度较高，较自然真实碱度浓度差别较大，不能直接用于评估鱼类对天然碱度浓度的耐受性；其次，致死性试验不能判断鱼类对高碱环境的适应过程，无法为盐碱水驯养技术提供参考；第三，致死浓度下鱼类各项生理机能发生实质性改变，不能直接作为鱼类耐碱选育的指标，本发明克服了上述技术问题。旨在为耐盐碱鱼类的选育和驯养提供技术基础。
本发明的一种硬骨鱼类碱度耐受性的评价方法，包括：
(1)胁迫评价用碱溶液的配制：
配制28-34mmol/L，pH为8.8-9.6的碳酸盐溶液；
(2)胁迫方法：
将鱼分组并在对照组水中稳定后，分别换同体积的步骤(1)中的碳酸盐溶液、对照组水开始胁迫，胁迫周期为24h；
注：鱼分组具体为：分为两组，每组三个重复，每个重复20尾鱼；其中两组分别换同体积的碳酸盐溶液、对照组水(如淡水等)。
样品采集：
并按照设定的取样时间抽取血样，并获得对应血浆氨氮浓度(血氨浓度)；
(3)判定标准：血氨稳定时间、最高值、24h恢复程度：
通过血浆氨氮浓度稳定时间、及24h恢复程度来评价碱度耐受性级别；
其中血氨稳定时间12h-24h、24h恢复程度大于50％，为高耐碱性级别；
血氨稳定时间大于24h，24h恢复程度30-50％为中耐碱级别；
血氨稳定时间大于24h，24h恢复程度小于30％为低耐碱级别。
所述碳酸盐溶液为Na2CO3和NaHCO3配置并静置24h后使用。
进一步地，碱溶液的配制具体为：根据天然盐碱水碱度特征和一般鱼类对碱度的耐受范围，设置32mmol/L(CA32)，pH8.8-9.6碳酸盐碱度组，以淡水对照组。试验用水均采用过滤淡水，用Na2CO3(AR)和NaHCO3(AR)按比例配制成相应的碱度，全部溶解后稳定24h使用。试验中全程监测pH值和碳酸盐碱度，pH值的测定采用DELTA320型精密pH计(MettlerToledo)，碳酸盐碱度的测定采用酸碱滴定法。
所述步骤(2)中鱼具体为：供试鱼试验开始前在室内暂养48h天以上，暂养期间每天饱食投喂两次，投喂量为体重的5％，每天换水，不间断充气，暂养用水要求，pH7.6-8.2，温度17.0±0.5℃，溶氧9.14±0.03mg/L，氨氮0.01±0.01mmol/L，试验选取大小一致健康个体，评价前48h停止投喂。
所述对照组水为淡水或碱度为0-3mM的水。
进一步地，所述步骤(2)中胁迫具体为：根据鱼体大小选择暂养水体(如过滤淡水)并分组，每组设置3个重复，每个重复20尾鱼，胁迫前暂养6h后，分别换同体积对照水(如过滤淡水)、32mmol/L碱水(pH为8.8-9.6)开始胁迫，胁迫周期24h。
所述步骤(2)中取样时间为0h、6h、12h、24h。
所述步骤(2)中按照设定的取样时间抽取血样，并获得对应血浆氨氮浓度具体为：取样时间设定为0h、6h、12h、24h。取样时分别从各试验组取5尾鱼，用浓度为0.5g/L的MS-222麻醉后尾静脉抽取血液，立即离心，取上清在液氮中速冻，转入-80℃冰箱中保存备测。
所述步骤(2)中血浆氨氮浓度为利用Berthelot反应得到，具体方法参照血氨测定试剂盒(A086，南京建成)说明书，按照比例减少样品和试剂用量使其适用于酶标仪测定，检测波长630nm的吸光值，根据标准曲线换算成氨氮浓度。
所述步骤(3)中血氨稳定时间具体是指碱度胁迫后鱼体内血氨浓度升高波动后恢复稳定的时间；24h恢复程度是指碱度胁迫后鱼体内血氨浓度升高波动后，24h恢复稳定时血氨浓度为胁迫前初始浓度百分比，24h恢复程度＝胁迫24h血氨浓度/胁迫前血氨初始浓度×100％。
有益效果
本发明根据鱼类耐碱性的生理学基础，建立一种非致死性、可以连续观测的一种适用于硬骨鱼类适应高碱环境的评价方法；
本发明的实验鉴定周期短，不受外界水质条件限制，不需要花费大量实验费用，非致死；较为经济、方便快捷、非致死的耐碱鉴定方法；
对于大部分淡水鱼类，高pH环境带来的压力首先可能是抑制氨氮(NH3)的排泄。在中性水体环境中，水生动物将氮以NH3的形式通过鳃排出到体外，在水中转化为离子氨NH4+，维持动物体内外NH3浓度梯度差，使得体内NH3得以顺利排出。而在高pH水环境中，由于H+浓度的减少降低了NH3向NH4+的转化，使得动物体内外NH3浓度梯度差降低，体内CO2浓度减少，血液中pH的升高，形成了呼吸性碱中毒。同时碱性环境会抑制氨排泄，从而使鱼体内血氨升高而对鱼体产生毒害作用。当淡水硬骨鱼暴漏于碱水中排氨率会立即降低，相对应的血浆氨浓度升高。部分鱼类进化了高血氨的耐受性，某种意义上鱼体内氨的变化趋势能够反映鱼类对高碱水的耐受性，本发明根据鱼类耐碱性的生理学基础，建立一种非致死性、可以连续观测的一种适用于硬骨鱼类适应高碱环境的评价方法。
附图说明
图1为碳酸盐碱度胁迫对青海湖裸鲤幼鱼血浆氨氮浓度影响，其中“*”表示血浆氨氮浓度与胁迫前具有显著差异(P<0.05)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1.试验材料:
供试裸鲤幼鱼由青海湖裸鲤救护中心提供，试验开始前在室内暂养1个月以上，暂养期间每天饱食投喂两次，投喂量为体重的5％，每天换水，不间断充气。暂养用水为过滤自来水(开能AC/KDF150-1-300)，pH(7.63±0.05)，温度(17.0±0.5)℃，溶氧(9.14±0.03)mg/L，氨氮(0.01±0.01)mmol/L。试验选取大小一致、体质量为(1.39±0.09)g、体长为(5.12±0.07)cm的健康幼鱼，试验前48h停止投喂。
2.实验用水配制:
根据青海湖裸鲤生活史(性成熟裸鲤每年4～7月从青海湖溯游到淡水河道，完成产卵繁殖后，亲鱼及孵化后幼体再洄游到青海湖)、青海湖湖水碱度(32mmol/L)及裸鲤碱度急性胁迫试验结果。试验设置了32mmol/L(CA32)碳酸盐碱度组和一个淡水对照组。试验用水均采用过滤自来水，用Na2CO3(AR)和NaHCO3(AR)按比例配制成相应的碱度，全部溶解后稳定24h使用。试验中全程监测pH值和碳酸盐碱度(表1)。pH值的测定采用DELTA320型精密pH计(Mettler Toledo)，碳酸盐碱度的测定采用酸碱滴定法。
表1预设与实测的碱度值
Figure GDA0002210573690000041
3.试验方法
碱度急性胁迫试验：与氨氮和尿素氮排泄试验设计类似，试验水体150L，每组设置3个重复，每个重复20尾鱼，连续充气，稳定6h后换水进行胁迫，胁迫周期为24h。
4.样品采集
碱度急性胁迫试验取样：取样时间设定为0h、6h、12h、24h。取样时分别从各试验组取5尾鱼，用浓度为0.5g/L的MS-222麻醉后尾静脉抽取血液，立即离心，取上清在液氮中速冻，转入-80℃冰箱中保存备测。
5.血浆氨氮浓度测定
血浆中氨氮的测定方法利用Berthelot反应，具体方法参照血氨测定试剂盒(A086，南京建成)说明书，按照比例减少样品和试剂用量使其适用于酶标仪测定，检测波长630nm的吸光值，根据标准曲线换算成氨氮浓度。
6.碳酸盐碱度胁迫对裸鲤血浆氮废物浓度的影响
试验期间对照组和胁迫组裸鲤体态正常，未出现死亡现象。对照组试验期间血浆氨氮浓度较试验前均无显著性差异(P>0.05)。32mmol/L碱度组在各胁迫时间点血浆氨氮浓度均显著高于胁迫前浓度(P<0.05)(如图1所示)。
32mmol/L碱度组在12h血浆氨氮浓度达到最高，约为胁迫前的4.2倍，12h之后血浆浓度呈现降低趋势并趋于稳定，24h恢复到原来的54.5％。
从以上结果来看青海湖裸鲤属于高耐碱性级别。

Claims (4)

1.一种硬骨鱼类耐碱性能的评价方法，包括：
（1）配制28-34mmol/L，pH为8.8-9.6的碳酸盐溶液；其中碳酸盐溶液为Na2CO3和NaHCO3配制，并静置24h后使用；
（2）将鱼分组并在对照组水中稳定后，分别换同体积的步骤（1）的碳酸盐溶液、对照组水开始胁迫，胁迫周期为24h；并按照设定的取样时间抽取血样，并获得对应血浆氨氮浓度；其中取样时间为0 h、6 h、12 h、24 h；
（3）通过血氨稳定时间、及24h恢复程度来确定碱度耐受性级别；
其中血氨稳定时间12h-24h、24h恢复程度大于50%，为高耐碱性级别；
血氨稳定时间大于24h，24h恢复程度30-50%为中耐碱级别；
血氨稳定时间大于24h，24h恢复程度小于30%为低耐碱级别。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤（2）中鱼具体为：供试鱼试验开始前在室内暂养1个月以上，暂养期间每天饱食投喂两次，投喂量为体重的5%，每天换水，不间断充气，暂养用水要求，pH7.6-8.2，温度17.0±0.5℃，溶氧9.14±0.03mg/L，氨氮0.01±0.01mmol/L，试验选取大小一致健康个体，评价前48 h停止投喂。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述对照组水为淡水或碱度为0-3mM的水。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤（2）中血浆氨氮浓度为利用Berthelot反应得到。
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