CN103472194A - 一种环境污染物生态毒性效应阈值浓度测算方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种环境污染物生态毒性效应阈值浓度测算方法，该方法基于生物单物种的毒性效应实验结果，分析反应终点的敏感性、可靠性和稳定性，利用种群间的生态关系构建生态系统模型，将处于不同营养级的、种群水平上的、多个反应终点结合起来，进而构建生态系统-毒性效应耦合模型，以一定污染物浓度下生态系统渐近正平衡点(x*,y*,z*)是否偏离原平衡点（即是否具有显著性差异）作为阈值浓度的判据，计算污染物生态毒性效应阈值浓度。本发明测算方法考虑了生态系统种群间的生态相关性，在种群水平上进行毒性效应测算，结果更加真实、可靠。

Description

一种环境污染物生态毒性效应阈值浓度测算方法

技术领域

    本发明涉及一种环境污染物生态毒性效应阈值浓度测算方法，具体涉及一种基于单物种种群水平、具有较强生态相关性的污染物生态毒性效应阈值浓度测算方法。

背景技术

最近三十年来我国经济迅猛发展，污染物排放导致自然水体污染日益严重，水域生态系统退化，水环境生态保护亟需加强。科学制定水质标准是水生态系统保护和环境管理的基础，水质基准的制定又是水质标准制定的科学依据。自上世纪70年代末水环境污染物生态毒理学研究在我国逐渐受到重视，并已积累了相当丰富的研究成果，然而我国水质基准研究相对滞后，尚未建立起适合我国水环境生态系统保护的水质基准体系，历年来颁布的水质标准主要是参考美国、日本等国家的水质标准和美国的部分水生态基准数据制定的。

水质基准制定的科学基础，一方面是具有较完备的土著水生生物的污染物生态毒理学数据，其中关键是基于生态学意义显著的反应终点所确定的浓度—效应关系；另一方面是具有科学的水质基准推导方法，其基础环节是污染物生态毒性效应阈值浓度的确定方法。污染物生态毒性效应不仅与水环境中污染物的含量及化学形态有关，受各种环境因素直接或间接的影响，而且与生态毒性效应研究对象有关，随生态区系的变化而变化，因此，水环境因素及生态区系的差异使得美、日等国家的生态毒理学数据并不适合推导我国水质基准。尽管在推导方法上可以借鉴、利用国外的研究成果，但国外有影响的机构组织如美国环保局（USEPA）、欧盟联合研究中心（EUC）及世界经济与合作组织（OECD）等，对于污染物生态毒性效应阈值浓度所提出的各种计算方法都有其缺陷，还有待进一步完善，事实上，国际众多科研机构也在研究更为完善的污染物阈值浓度测算方法。USEPA、EUC 及OECD 等机构组织发布的“技术指南”在计算水质基准时，主要采用了个体水平反应终点的毒性数据。尽管反应终点水平越微观，实验结果的因果关系越强，但生态学意义越不显著，个体水平及以下的反应终点难以满足推导水质基准的需要。既使同一生态受体的多个反应终点，对污染物不利效应的表征能力往往不同。目前通常的做法都是选择最敏感的反应终点做为确定阈值浓度的反应终点。然而一个个体水平上最敏感的反应终点所确定的毒性效应并不必然反映种群毒性效应，这是因为种群效应并不必然由最敏感的生命周期特征决定。同样，一个种群水平上最敏感的反应终点所确定的毒性效应并不必然反映群落或生态系统毒性效应，这是因为生态系统中竞争、摄食等生态关系影响污染物的毒性效应。尽管生态受体所处的生命组建层次越高，相应的反应终点综合反映生态系统毒性效应的能力越强，然而由于技术条件限制，目前只有种群水平上的反应终点可以定量测量。因此目前污染物生态毒性效应阈值浓度研究多限于单物种毒性实验，缺乏考虑生态系种群间的生态相关性，致使研究结果的真实性、可靠性降低。

目前还没有应用单物种种群水平上的毒性效应数据科学测算反映生态关系的水环境污染物毒性效应阈值浓度的相关报道。然而这样的测算方法能够进一步提高生态毒性效益阈值浓度的生态相关性，有助于完善污染物水质基准的推导方法，有助于夯实水质标准制定的科学基础，避免水质标准制定导致的环境“欠保护”或“过保护”，使经济和生态环境和谐发展。因此，在水环境综合治理体系中，有必要引入新的和更科学的反映生态关系的水环境污染物生态毒性效应阈值浓度分析技术，建立一套更为科学的污染物生态毒性效应阈值浓度测算方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种更科学的反映生态关系的环境污染物生态毒性效应阈值浓度测算方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种环境污染物生态毒性效应阈值浓度测算方法，包括以下步骤：

（1）测定污染物对生态系统内若干生物种群的毒性效应；

（2）基于步骤（1）得到的毒性效应测定结果，确定可以作为种群水平上的反应终点的参数，构建生态毒性效应模型；

（3）根据生物种群间的生态关系构建生态系统模型；

（4）将步骤（2）得到的生态毒性效应模型嵌入到步骤（3）得到的生态系统模型中，构建生态系统——毒性效应耦合模型；

（5）根据步骤（4）得到的生态系统——毒性效应耦合模型，计算污染物生态毒性效应阈值浓度。

上述测算方法尤其适用于生态系统为水域生态系统时。当选取浮游生态系统时，步骤（1）中毒性效应测定选取的生物种群可为浮游生物种群。为了获得更强生态相关性，选取的生物种群处于不同营养级，如微藻种群、浮游动物种群。

其中，步骤（2）中通过对分析不同反应终点下生态毒性效应的敏感性、可靠性和稳定性，确定可以作为种群水平上的反应终点的参数，如微藻种群的内禀增长率、环境容纳量等参数，浮游动物种群的存活率、内禀增长率、滤水率和摄食率等参数，构建生态毒性效应模型。

步骤（3）中生态系统模型为具有简单竞争—摄食效应的简化生态系统模型。

步骤（4）生态系统——毒性效应耦合模型中污染物浓度对生态系统模型系数的影响通过若干不同反应终点的生态毒性效应函数进行构造。

步骤（5）污染物生态毒性效应阈值浓度的计算以所述生态系统模型渐近正平衡点是否偏移为判断依据；污染物生态毒性效应阈值浓度为未使所述渐近正平衡点偏移的最大污染物浓度。

以水环境污染生态毒性效应阈值浓度测算为例，本发明测算方法的具体步骤如下：

① 浮游生物种群毒性效应的测定及分析

根据单藻培养体系毒性效应实验及浮游动物种群毒性效应实验测定结果，计算不同污染物浓度下微藻种群的内禀增长率、环境容纳量等参数，计算不同污染物浓度下浮游动物种群的存活率，繁殖速率、内禀增长率、世代时间、雌体抱卵率和种群增殖率等参数，分别以这些参数为反应终点分析污染物对浮游生物种群的毒性效应。

单藻培养体系毒性效应实验：以实验室繁育的微藻为对象，过滤海水添加适量营养盐作为培养液，置于1000mL 锥形瓶中，在光照培养箱中培养。培养温度15-25℃，分别与后面实验中两种浮游动物的适宜培养温度相配合，盐度32，pH 8.0，光照强度           60μmol m^-2s^-1，初始密度均为1×10⁴cells mL^-1，光周期12L:12D。污染物浓度间隔通过预实验设定（6 个浓度梯度，包括对照样）。每组设置3 个平行样。每隔24h 取5mL 培养液，加入固定液，在显微镜下进行种类鉴定和计数。实验对象种群出现衰亡时结束实验。根据实验结果利用Logistic 生长模型拟合可获得微藻内禀增长率、环境容纳量等参数，分析污染物对微藻种群的毒性效应。

浮游动物种群毒性效应实验测：

单体培养 选择健康活泼的浮游动物成熟雌体，分别放进产卵瓶里，每个瓶放（中型浮游动物）1 只，瓶里盛有250mL培养液（小型浮游动物采用15mL 的6 孔培养板）。污染物的浓度间隔通过预实验设定（6 个浓度梯度，包括对照样），每组设置10个平行样。实验在15-25℃（根据不同生物的适宜温度设定）下恒温培养，每天检查计数产卵个数、孵化出的幼体数和母体存活情况，移去幼体，同时按约1/2 的比例换培养液水，并添加饵料藻，实验到雌体死亡为止。根据实验结果可计算浮游动物存活率，繁殖速率、内禀增长率、世代时间等，分析污染物对浮游动物种群的毒性效应。

群体累计培养 定量移取活泼健壮、相同条件下预培养的浮游动物（中型浮游动物）10 只（小型浮游动物10ind/mL）置于盛有300mL 培养液的烧杯中。污染物的浓度间隔通过预实验设定（6 个浓度梯度，包括对照样），每组设3 个平行样。实验在15-25℃下培养。培养时间到种群增长达到高峰并开始下降为止。在实验期间每隔24h 投喂饵料一次。每天计数浮游动物总个体数、抱卵个体数、脱落的夏卵数量(计数后再放回原培养物中)，连续重复三次，求出平均数。根据实验结果可计算浮游动物雌体抱卵率和种群增殖率等，分析污染物对浮游动物种群的毒性效应。

② 种群水平上反应终点的差异性分析

基于浮游生物种群毒性效应的实验结果，确定不同反应终点下的NOEC，计算不同反应终点下的EC05、EC10、EC50 及其95%置信区间，分析不同反应终点下生态毒性效应的敏感性、可靠性和稳定性，确定测算生态毒性效应阈值浓度的反应终点，构建生态毒性效应模型。

③ 简化浮游生态系统模型参数的获取及模型的构建

根据双藻竞争实验和浮游动物摄食、选食行为实验结果，计算微藻的竞争抑制参数，计算浮游动物对于微藻的滤水率、摄食率和摄食选择性系数等参数，构建具有简单竞争-摄食效应的简化浮游生态系统模型。

双藻竞争实验：将实验微藻两两混合，根据培养液中藻细胞密度和单个藻细胞生物体积的大小设定微藻的初始接种生物量，使共培养微藻生物量比为1:1，其他培养条件及检测指标与单藻毒性效应实验相同。根据实验结果利用Lotka-Volterra 竞争模型拟合可获得竞争抑制参数。

浮游动物摄食、选食行为实验：

分别将微藻单独喂养选取的浮游动物。浮游动物由实验室繁育获得，实验前先将预培养的浮游动物分别在相应要摄食的微藻中驯化培养3-5d，再饥饿24h。实验在150mL 烧杯中进行，实验藻液体积为50mL，微藻密度根据预实验设置为最适投喂密度， 温度为15-25℃，每个烧杯加入一定数量浮游动物，每实验组设3 个平行样，另设不加浮游动物的对照组。用黑布将实验烧杯罩住在黑暗条件下培养24h。采用饵料浓度差法，24h 后计数，鲁哥氏液固定藻液，在显微镜下血球计数板计数并计算藻细胞密度，根据实验结果可计算浮游动物对于微藻的滤水率和摄食率。

将微藻两两混合，投喂选取的浮游动物，根据单个藻细胞生物体积的大小确定混合比例，使两种微藻生物量比为1:1，其他实验条件步骤同上。采用饵料浓度差法，计算浮游动物对于微藻的摄食率，根据浮游动物对不同微藻的摄食程度可确定其摄食选择性系数。

④ 浮游生态系统—毒性效应耦合模型的构建及阈值浓度的测算

基于反应终点的分析结果，以生态学意义显著的反应终点及生态毒性效应阈值浓度为模型参数，将生态毒性效应模型嵌入到浮游生态系统模型当中，构建浮游生态系统—毒性效应耦合模型，综合运用耦合模型参数估计及Bootstrap 抽样等数理统计方法，测算污染物生态毒性效应阈值浓度，并进行不确定性分析。

本发明的优点及效果：本发明通过生物种群间的生态关系，构建生态系统-毒性效应耦合模型，考虑了污染物毒性效应的生态相关性，从而提高了测算的准确性；同时应用单物种种群毒性效应数据测算污染物生态毒性效应阈值浓度，可以充分利用现有的大量单物种毒性效应实验数据，节约费用。本发明方法涉及的生物毒性实验都是常规实验，针对监测生物设计的监测生态系统模型可应用于不同污染物，便于在广大水质环境监测部门推广使用。

附图说明

图1为本发明测算方法的技术路线示意图；

图2为本发明简化生态系统示意图。

图中，                                                

    表示摄食关系，   

  表示竞争关系，   

 表示存在密度制约，

 表示种群有系统之外的食物来源，x为青岛大扁藻，y为球等鞭金藻，z为褶皱臂尾轮虫。

具体实施方式

    下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

如图1所示，本发明基于浮游生物单物种的毒性效应实验结果，分析反应终点的敏感性、可靠性和稳定性，利用种群间的生态关系构建简化浮游生态系统模型，将处于不同营养级的、种群水平上的、多个反应终点结合起来，进而构建浮游生态系统-毒性效应耦合模型，以一定污染物浓度下简化浮游生态系统渐近正平衡点(x*,y*,z*)是否偏离原平衡点（即是否具有显著性差异）作为阈值浓度的判据，计算污染物生态毒性效应阈值浓度。本发明测算方法的科学性可以通过简化浮游生态系实验结果分析耦合模型的拟合优度并验证阈值浓度计算结果来评估。

1、生态毒性效应实验及参数获取： 

（1）单藻培养体系毒性效应实验

采用实验室繁育获得青岛大扁藻(Platymonas helgolandica)和球等鞭金藻(Isochrysis galbana)，过滤海水添加适量营养盐作为培养液，置于1000mL锥形瓶中，在光照培养箱中培养。培养温度15℃（或23℃，分别与后面实验中两种浮游动物的适宜培养温度相配合），盐度32，pH 8.0，光照强度60μmol m^-2s^-1，初始密度均为1×10⁴cells mL^-1，光周期12L:12D。重金属铜污染物设6个浓度梯度，包括对照样。每组设置3个平行样。每隔24h取5mL培养液，加入固定液，在显微镜下进行种类鉴定和计数。实验对象种群出现衰亡时结束实验。根据实验结果利用Logistic生长模型拟合获得微藻内禀增长率、环境容纳量等参数。

（2）双藻竞争实验

将青岛大扁藻、球等鞭金藻混合，根据培养液中藻细胞密度和单个藻细胞生物体积的大小设定微藻的初始接种生物量，使共培养微藻生物量比为1:1，其他培养条件及检测指标也与单藻毒性效应实验相同。根据实验结果利用Lotka-Volterra竞争模型拟合获得竞争抑制参数。

（3）浮游动物种群毒性效应实验

单体培养：选择健康活泼的褶皱臂尾轮虫成熟雌体，分别放进15mL的6孔培养板。污染物的浓度设6个浓度梯度，包括对照样，每组设置10个平行样。实验在23℃下恒温培养，每天检查计数产卵个数、孵化出的幼体数和母体存活情况，移去幼体，同时按约1/2的比例换海水，并添加饵料藻，实验到雌体死亡为止。根据实验结果可计算浮游动物存活率，繁殖速率、内禀增长率、世代时间等。

群体累计培养：定量移取活泼健壮、相同条件下预培养的褶皱臂尾轮虫（初始密度为10ind/mL）置于盛有300mL培养液的烧杯中。污染物的浓度设6个浓度梯度，包括对照样，每组设3个平行样。实验在23℃下培养。培养时间到种群增长达到高峰并开始下降为止。在实验期间每隔24h投喂饵料一次。每天计数浮游动物总个体数、抱卵个体数、脱落的夏卵数量(计数后再放回原培养物中)，连续重复三次，求出平均数。根据实验结果可计算浮游动物雌体抱卵率和种群增殖率等。

（4）浮游动物摄食、选食行为实验

分别将青岛大扁藻、球等鞭金藻单独喂养褶皱臂尾轮虫。浮游动物由实验室繁育获得，实验前先将预培养的浮游动物分别在相应要摄食的微藻中驯化培养3-5d，再饥饿24h。实验在150mL烧杯中进行，实验藻液体积为50mL，微藻密度根据预实验设置为最适投喂密度， 温度为23℃，每个烧杯加入10ind/mL褶皱臂尾轮虫，每实验组设3 个平行样，另设不加浮游动物的对照组。用黑布将实验烧杯罩住在黑暗条件下培养24h。采用饵料浓度差法，24h 后计数，鲁哥氏液固定藻液，在显微镜下血球计数板计数并计算藻细胞密度，根据实验结果可计算中华哲水蚤（或褶皱臂尾轮虫）对于微藻的滤水率和摄食率。

将青岛大扁藻、球等鞭金藻混合，投喂褶皱臂尾轮虫，根据单个藻细胞生物体积的大小确定混合比例，使两种微藻生物量比为1:1，其他实验条件步骤同上。采用饵料浓度差法，计算褶皱臂尾轮虫对于微藻的摄食率，根据褶皱臂尾轮虫对不同微藻的摄食程度计算其摄食选择性系数。

（5）（具有竞争-摄食效应的）简化实验生态系毒性效应实验

将青岛大扁藻、球等鞭金藻混合，使共培养微藻生物量比为1:1，取褶皱臂尾轮虫接种到微藻混合液中，并添加污染物。初始接种的微藻生物量、浮游动物生物量及添加的污染物浓度间隔同上。浮游动物选取活泼健壮、相同条件下预培养的个体，实验前先分别在相应的微藻混合液中驯化培养3-5d，再饥饿24h，使之排空肠道。实验在10L玻璃容器中进行，23℃下培养。每实验组设3 个平行样，另设不加污染物的对照组。其他培养条件与单藻毒性效应实验相同。每天观察计数浮游生物种类和数量变化，计数方法同上述相应实验。根据实验系统中浮游生物种群数量稳定持续时间情况决定实验结束时间。

2、反应终点分析及生态毒性效应模型构建：

根据实验测定结果，应用Dunnett—t检验确定不同反应终点（微藻种群的内禀增长率、环境容纳量等参数，浮游动物种群的存活率、繁殖速率、内禀增长率、世代时间、雌体抱卵率、种群增殖率、滤水率和摄食率等参数）下的NOEC，应用Log-logistic模型计算不同反应终点下EC05、EC10、EC50及其95%置信区间，分析不同反应终点下生态毒性效应的敏感性、可靠性和稳定性。

结论：通过反应终点分析，发现微藻种群的内禀增长率、环境容纳量等参数，浮游动物种群的存活率、内禀增长率、滤水率和摄食率等参数具有较高的敏感性、可靠性和稳定性，可以作为种群水平上的反应终点，用以构建测算生态毒性效应阈值浓度的生态毒性效应模型。

3、生态系统-毒性效应耦合模型构建：

根据双藻竞争实验和浮游动物摄食、选食行为实验测定的参数，基于Logistic生长模型和Lotka-Voterra捕食模型建立简化浮游生态系统模型（如图2所示），其中微藻生长考虑密度制约，浮游动物生长不考虑密度制约。污染物浓度对简化浮游生态系统模型系数的影响通过若干不同反应终点的生态毒性效应函数来构造，这样便将生态毒性效应模型嵌入到浮游生态系统模型当中，构建成浮游生态系统—毒性效应耦合模型。

结果分析：利用竞争-摄食等生态关系建立起来的简化浮游生态系统模型，通过嵌入生态毒性效应模型，能够反映污染物对浮游生态系统的毒性效应。

4、阈值浓度测算：

在上述实验条件下，简化浮游生态系统模型存在唯一渐近正平衡点E* (x*,y*,z*)。在一定的污染物浓度条件下，简化浮游生态系统渐近正平衡点(x,y,z)发生变化，偏离原来生态系统平衡点，这里我们将未使渐近平衡点偏离原平衡点（即不具有显著性差异）的最大污染物浓度作为生态毒性效应阈值浓度，并应用贝叶斯转换和蒙特-卡罗方法进行阈值浓度的不确定性分析。

结论：尽管每一个反应终点都对应一个非效应浓度，嵌入到简化生态系模型以后，由于耦合模型对参数变化的敏感性不一样，某反应终点确定的最小非效应浓度不一定就是简化生态系模型平衡点偏移的阈值，平衡点是否偏移通过检验其与对照实验是否有显著性差异来判断。重金属铜的生态毒性效应阈值测算结果为4.0±0.4μg/L。

5、阈值浓度测算结果验证：

将简化实验生态系毒性效应实验中各污染物浓度下浮游生物种群生物量测定结果 (x_t, y_t, z_t) 与模型计算的相应结果 (x _t , y _t , z _t ) 进行比对，计算得到模型拟合优度R ² >0.9，检验模型计算的平衡点E* (x*,y*,z*)与实验测定的平衡点E* (x*,y*,z*)没有显著性差异，从而验证了模型计算结果的可靠性。

应用本发明的模型，基于青岛大扁藻、球等鞭金、褶皱臂尾轮虫等单物种种群毒性效应实验数据，以简化浮游生态系统渐近平衡点的偏离为判据测算的污染物生态毒性效应阈值浓度，与由青岛大扁藻、球等鞭金藻、褶皱臂尾轮虫构成的简化实验生态系统的测定结果基本一致。这一结果进一步验证了由单物种毒性效应数据通过生态系统—毒性效应耦合模型测算污染物生态毒性效应阈值浓度的可操作性及可靠性，同时也表明了本发明方法在水环境污染物毒性效应阈值浓度测算中具有一定的应用价值。

Claims (6)

1.一种环境污染物生态毒性效应阈值浓度测算方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）测定污染物对生态系统内若干生物种群的毒性效应；

（2）基于步骤（1）得到的毒性效应测定结果，确定可以作为种群水平上的反应终点的参数，构建生态毒性效应模型；

（3）根据生物种群间的生态关系构建生态系统模型；

（4）将步骤（2）得到的生态毒性效应模型嵌入到步骤（3）得到的生态系统模型中，构建生态系统——毒性效应耦合模型；

（5）根据步骤（4）得到的生态系统——毒性效应耦合模型，计算污染物生态毒性效应阈值浓度。

2.根据权利要求1所述的测算方法，其特征在于：所述步骤（1）中的生态系统为浮游生态系统；所述生物种群为浮游生物种群。

3.根据权利要求1所述的测算方法，其特征在于：所述步骤（1）中选取的生物种群不处于同一营养级。

4.根据权利要求1至3任一所述的测算方法，其特征在于：所述步骤（3）中生态系统模型的构建根据种群间的竞争、摄食效应进行简化构建。

5.根据权利要求1至3任一所述的测算方法，其特征在于：所述步骤（4）生态系统——毒性效应耦合模型中污染物浓度对生态系统模型系数的影响通过若干不同反应终点的生态毒性效应函数进行构造。

6.根据权利要求1至3任一所述的测算方法，其特征在于：所述步骤（5）污染物生态毒性效应阈值浓度的计算以所述生态系统模型渐近正平衡点是否偏移为判断依据；所述污染物生态毒性效应阈值浓度为未使所述渐近正平衡点偏移的最大污染物浓度。

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