CN104111245A

CN104111245A - 降低邻苯二甲醛荧光法测铵氮的试剂空白的方法

Info

Publication number: CN104111245A
Application number: CN201410365089.1A
Authority: CN
Inventors: 梁英; 秦月香; 严春梅
Original assignee: Guilin University of Electronic Technology
Current assignee: Guilin University of Electronic Technology
Priority date: 2014-07-29
Filing date: 2014-07-29
Publication date: 2014-10-22

Abstract

本发明的降低邻苯二甲醛荧光法测铵氮的试剂空白的方法，包括：1）采用煮沸法去除碱性介质溶液和络合剂-碱性介质缓冲溶液中的铵氮；2）采用HLB小柱固相萃取法去除邻苯二甲醛或其衍生物和Na₂SO₃的混合溶液中的铵氮。本发明为降低方法的空白，提出降低邻苯二甲醛荧光法测铵氮的试剂空白，通过这样的方法来降低该法检测限。当邻苯二甲醛荧光法测铵氮的各种试剂均采用相应方法去除铵氮时，对应空白的荧光值相对于未处理的降低了87.65%，去除效果非常显著，且不影响各试剂与铵氮的反应性能。

Description

降低邻苯二甲醛荧光法测铵氮的试剂空白的方法

技术领域

本发明涉及铵氮测定，具体是邻苯二甲醛荧光法测铵氮，更具体是降低邻苯二甲醛荧光法测铵氮的试剂空白的方法。

背景技术

铵氮是水体中浮游植物可直接利用的无机氮形态 [Harrison, W.G., Harris, L.R., Irwin, B.D., 1996. The kinetics of nitrogen utilization in the oceanic mixed layer: Nitrate and ammonium interactions at nanomolar concentrations. Limnology and Oceanography41, 16-32.]。水体中铵氮以游离氨（NH₃）或铵根离子（NH₄ ⁺）的形式存在。铵氮是指游离氨和铵根离子的总称。在内陆水体和近岸海域，水体中铵氮含量较高，甚至可导致水体富营养化[Painting, S.J., Devlin, M.J., Malcolm, S.J., et al, 2007. Assessing the impact of nutrient enrichment in estuaries: Susceptibility to eutrophication. Marine Pollution Bulletin 5, 74-90]。然而，在一些大洋表层海水中，铵氮含量通常低于1 μmol/L，甚至低至nmol/L级别[Johnson, M.T., Liss, P.S., Bell, T.G., et al, 2008. Field observations of the ocean-atmosphere exchange of ammonia: Fundamental importance of temperature as revealed by a comparison of high and low latitudes. Global Biogeochemical Cycles 22, 1-15]。测定海水中低浓度的铵氮浓度，目前广泛采用的方法为邻苯二甲醛(o-phthaldialdehyde，简称OPA)荧光法，该法基于的原理为：在碱性介质中，亚硫酸钠存在下，OPA与铵氮发生荧光反应，生成具有荧光强度的异吲哚化合物。采用该法测定实际水样时，有时会加入EDTA络合剂掩蔽金属离子。该法具有选择性好、灵敏度高等优点，但由于受方法空白的影响，检测限仍然无法满足nmol/L级别海水的测定要求。

发明内容

为了克服邻苯二甲醛荧光法受方法空白的影响，降低检测限，本发明提供一种降低邻苯二甲醛荧光法测铵氮的试剂空白的方法。

方法空白的可能来源有仪器、试剂、实验室空气环境等，其中，试剂是方法空白的最主要来源。因此，本发明为降低方法的空白，提出降低邻苯二甲醛荧光法测铵氮的试剂空白，通过这样的方法来降低该法检测限。

本发明的降低邻苯二甲醛荧光法测铵氮的试剂空白的方法，包括：

1）采用煮沸法去除碱性介质溶液和络合剂-碱性介质缓冲溶液中的铵氮；

2）采用HLB小柱固相萃取法去除邻苯二甲醛或其衍生物和Na₂SO₃的混合溶液中的铵氮。

进一步，所述1）的具体过程为：取待处理液加至事先放有沸石的三角烧瓶中，然后加入70%量待处理液的超纯水，加热煮沸，至溶液最终体积为待处理液原体积时，停止加热，用冰浴冷却溶液至常温，倒入洁净的试剂瓶中，盖紧、密封保存。

较佳地，密封保存采用双层聚乙烯塑料袋密封保存。

上述方法中，为了方便计量，溶液最终体积采取称量的方法确定，其中，溶液密度视为1.0 g/mL。

所述2）的具体过程为：混合溶液室温放置8小时以上，使混合溶液以每分钟不超过60滴的速度通过HLB小柱固相萃取装置中的HLB小柱流至棕色玻璃瓶中，于棕色玻璃瓶中密封冷藏。

HLB小柱固相萃取装置中的小柱选自：Oasis HLB小柱或C18填料小柱。

本发明涉及的碱性介质为：NaOH；络合剂包括：EDTA及其盐、柠檬酸及其盐；邻苯二甲醛衍生物包括：4，5-二甲氧基邻苯二甲醛、4-甲氧基邻苯二甲醛。

实验证明，本发明的方法当氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠-氢氧化钠缓冲溶液以及邻苯二甲醛和Na₂SO₃的混合溶液均采用相应方法去除铵氮时，对应空白的荧光值相对于未处理的降低了87.65%，去除效果非常显著，且不影响各试剂与铵氮的反应性能。

基于同样的原理，本发明的方法也适应发展了的测定方法中的试剂中铵氮的去除，如CN201210370600和CN201210519924所述的乙二胺四乙酸四钠溶液、柠檬酸溶液、4，5-二甲氧基邻苯二甲醛和4-甲氧基邻苯二甲醛溶液。

具体实施方式

下面结合如下的实验对本发明进行更加详细的说明。

主要仪器与试剂：

（1）RF-5301 PC型荧光分光光度计（日本岛津公司）：配有1 cm石英测定池。

（2）10.6g/L邻苯二甲醛(OPA)溶液：称取2.65 g邻苯二甲醛（A.R., 阿拉丁）固体，溶于50mL甲醇溶液中，震荡溶解，待其溶解完全后再加入200 mL超纯水，即配得10.6 g/L OPA溶液。使用前冷藏保存，可稳定1个月。

（3）2.50g/L亚硫酸钠（ Na₂SO₃）溶液：称取1.25 g Na₂SO₃固体（A.R., 阿拉丁），溶于500mL超纯水中，待其溶解后再加入0.2mL甲醛溶液（A.R., 阿拉丁），即配得2.50g/L Na₂SO₃溶液。使用前冷藏保存，可稳定1个月。

（4）0.1 mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液：称取0.8 g 氢氧化钠固体（A.R., 阿拉丁），溶于200 mL超纯水中。

（5）乙二胺四乙酸二钠-氢氧化钠缓冲溶液（EDTA-NaOH缓冲溶液，其中EDTA的浓度为186.5 g/L）：称取37.3 g乙二胺四乙酸二钠及7.0 g氢氧化钠，溶于200 mL超纯水中，该溶液的pH为12.8。

（6）1000 mg/L铵氮标准储备液：购于阿拉丁试剂网

（7）20 mmol/L铵氮中间标准储备液：由1000 mg/L铵氮标准储备液稀释而得

（8）0.1 mmol/L铵氮标准使用液：由20mmol/L铵氮中间标准储备液稀释而得。铵氮标准使用液需要当天使用当天配制。

试剂空白去除方法：

试剂空白通常因试剂中含有极少量的目标物（即铵氮）而产生，因此，要降低邻苯二甲醛(o-phthaldialdehyde，简称OPA)荧光法测定铵氮的试剂空白，需采取办法去除该法所用试剂溶液中的铵氮。OPA荧光法测定铵氮的所需试剂包括：NaOH溶液、OPA溶液、亚硫酸钠溶液、EDTA-NaOH缓冲溶液。以下分别叙述去除每种试剂溶液中铵氮的方法

1）采用煮沸法去除NaOH溶液、EDTA-NaOH缓冲溶液中的铵氮:

当溶液pH值大于9时，铵氮主要以氨态氮形式存在，在煮沸过程中，铵氮以氨气的形式随水蒸气蒸出，从而去除试剂溶液中的铵氮。NaOH溶液、EDTA-NaOH缓冲溶液的pH均大于9，因此，这两种溶液均以煮沸的方法去除试剂中的铵氮。

NaOH溶液中铵氮的去除方法：取200 mL 0.1 mol/L NaOH溶液加至事先放有沸石的500 mL三角烧瓶中，然后加入约150 mL超纯水，将三角烧瓶置于电热板上加热煮沸，至溶液最终体积为200 mL时，停止加热，迅速用冰浴冷却溶液至常温，立即将溶液倒入洁净的试剂瓶中，盖紧瓶盖，双层聚乙烯塑料袋密封保存。

EDTA-NaOH缓冲溶液中的铵氮的去除方法：取200 mL EDTA-NaOH缓冲溶液加至事先放有沸石的500 mL三角烧瓶中，然后加入约150 mL超纯水，将三角烧瓶置于电热板上加热煮沸，溶液中铵氮以氨气的形式随水蒸气蒸出。当溶液最终体积为200 mL时，停止加热，迅速用冰浴冷却溶液至常温，立即将溶液倒入洁净的试剂瓶中，盖紧瓶盖，双层聚乙烯塑料袋密封保存。

溶液最终体积采取称量的方法确定，溶液密度视为1.0 g/mL，首先，准确称量沸石和三角烧瓶的质量，记为m₁，停止加热后准确称量三角烧瓶+沸石+溶液的总质量，记为m₂，当m₂- m₁=200 g时，溶液最终体积即为200 mL。

2）采用HLB小柱固相萃取法去除OPA和Na₂SO₃溶液中的铵氮：

OPA、Na₂SO₃与铵氮可生成荧光异吲哚化合物，异吲哚化合物可被HLB小柱固相萃取，基于此原理。将配置好的10.6 g/L OPA溶液与2.50 g/L Na₂SO₃溶液按1：1的体积比混合，室温放置8小时，使试剂溶液中的铵氮与OPA、Na₂SO₃充分反应生成异吲哚化合物，然后将OPA-Na₂SO₃混合溶液加入到HLB小柱固相萃取装置的瓶口分液器，使OPA-Na₂SO₃混合溶液以每分钟60滴的速度通过HLB小柱至棕色玻璃瓶中。HLB小柱为Oasis HLB小柱。OPA-Na₂SO₃混合溶液中的铵氮因生成了异吲哚化合物而被HLB小柱萃取截留，流出HLB小柱的溶液为去除了铵氮的OPA-Na₂SO₃混合溶液，用棕色玻璃瓶密封冷藏保存，可稳定3天。

试剂空白测定方法：

移取20.00 mL 超纯水至50 mL聚丙烯塑料试样瓶中，依次加入3.0 mL OPA-Na₂SO₃混合溶液、1.0 mL EDTA-NaOH溶液，用0.1 mol/LNaOH溶液调节溶液pH为11.3-11.5范围内，摇匀；反应1小时后，设置荧光分光光度计激发波长为361 nm，荧光波长为423 nm，激发和发射狭缝宽度分别为5 nm和3 nm（以下无特别说明情况下采用此狭缝设置），测定溶液的荧光值IF，即为试剂空白。

去除试剂空白的效果考察：

按表1所示，设置4组实验，按上述测定方法测定相应的试剂空白，采用单因素方法考察各试剂中铵氮的去除效果，即当考察煮沸方法去除NaOH溶液中铵氮的效果时，除使用的NaOH溶液不同外，需控制对照实验和考察实验的实验条件相同，其它试剂相同。

表1：考察去除试剂空白效果的实验设计

见表2。未经煮沸处理的NaOH溶液对应的试剂空白值为294.472 19.677（n=3），煮沸处理的NaOH溶液对应的空白为238.6501.484（n=3），后者明显小于前者，相对前者，其荧光值降低了约18.96%。运用统计检验法对两组平均值进行检验，计算值为4.90，明显大于临界值_0.05,4=2.78，说明两组平均值有非常显著性的差异，说明采用煮沸的方法去除NaOH溶液中铵氮有明显效果。

表2：煮沸与未煮沸NaOH 溶液对应的试剂空白荧光值(IF)

见表3。未经煮沸处理的EDTA-NaOH缓冲溶液对应的试剂空白值为326.96912.433（n=3），煮沸处理的NaOH溶液对应的空白为227.3834.835（n=3），后者明显小于前者，其荧光值降低了约30.46%。运用统计检验法对两组平均值进行检验，计算值为12.93，远大于临界值_0.05,4=2.78，两组平均值有非常显著性的差异，说明采用煮沸的方法去除EDTA-NaOH缓冲溶液中铵氮效果明显。

表3：煮沸与未煮沸EDTA-NaOH缓冲溶液对应的试剂空白荧光值(IF)

见表4。未经HLB小柱固相萃取方法除铵氮的OPA-Na₂SO₃溶液对应试剂空白为235.0252.081（n=3），经过HLB小柱萃取除铵氮的OPA-Na₂SO₃溶液的试剂空白为160.4897.617（n=3），后者明显小于前者，其荧光值降低了31.71%。运用统计检验法对两组平均值进行检验，计算值为16.351，远大于临界值_0.05,4=2.78，说明两组平均值有非常显著性的差异，说明采用HLB小柱萃取方法除OPA-Na₂SO₃溶液中铵氮的效果明显。

表4：未经和经过HLB小柱除铵氮的OPA-Na₂SO₃溶液对应的试剂空白荧光值(IF)

所有试剂未经任何除铵氮处理和所有试剂均采用本发明所述相应方法除铵氮的试剂空白结果见表5所示，需特别说明的是，如果设置荧光仪激发和发射狭缝分别为5 nm和3 nm时，所有试剂未经任何除铵氮处理对应的空白超过仪器量程，因此，这里的数据是在设置荧光仪的激发和发射狭缝均为3 nm下测得。表5表明，所有试剂未经任何除铵氮处理的试剂空白为406.0145.036（n=4），所有试剂均采用本发明所述相应方法除铵氮的试剂空白为49.5451.816（n=4），后者远远小于前者，两者存在数量级的差异，其荧光值降低了87.65%。运用统计检验法对两组平均值进行检验，计算值为163.094，远大于临界值_0.05,4=2.45，说明两组平均值有非常显著性的差异。说明本发明所述的试剂空白去除方法除铵氮效果显著。

此外，使用未经任何除铵氮处理的试剂以及采用本发明所述相应方法除铵氮的试剂分别测定工作曲线，结果见表6所示，两工作曲线斜率比为0.945，说明采用本发明所述试剂空白去除方法除铵氮的试剂与铵氮的荧光反应性能不变。如用空白标准偏差三倍除以工作曲线斜率计算检测限，那么，采用未经除铵氮处理的试剂时，对应的方法检测限=3*5.036/725.84=0.021 μmol/L；采用本发明所述方法除铵氮时，对应的方法检测限=3*1.816/686.16=0.008 μmol/L。可见通过降低试剂空白，可明显降低方法检测限。

表5：所有试剂未经任何处理和全部除铵氮分别对应的试剂空白荧光值(IF)

注：荧光仪的激发和发射狭缝均设置为3nm

表6 所有试剂未经任何处理和全部除铵氮处理分别对应的工作曲线

注：荧光仪的激发和发射狭缝均设置为3nm。

由上可知：

（1）采用本发明的煮沸法去除NaOH中的铵氮以及EDTA-NaOH缓冲中的铵氮效果明显，对应的空白荧光值分别降低了18.96%和30.46%；

（2）采用本发明HLB小柱萃取法去除OPA-Na₂SO₃溶液中铵氮有明显效果，对应空白荧光值降低了31.71%；

（3）当NaOH、EDTA-NaOH缓冲溶液以及OPA-Na₂SO₃混合溶液均采用本发明的相应方法除铵氮时，对应空白的荧光值相对于未处理的降低了87.65%，去除效果非常显著，且不影响各试剂与铵氮的反应性能。

Claims

1.降低邻苯二甲醛荧光法测铵氮的试剂空白的方法，包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述1）的具体过程为：取待处理液加至事先放有沸石的三角烧瓶中，然后加入70%量待处理液的超纯水，加热煮沸，至溶液最终体积为待处理液原体积时，停止加热，用冰浴冷却溶液至常温，倒入洁净的试剂瓶中，盖紧、密封保存。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：溶液最终体积采取称量的方法确定，其中，溶液密度视为1.0 g/mL。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：用双层聚乙烯塑料袋密封保存。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述2）的具体过程为：混合溶液室温放置8小时以上，使混合溶液以每分钟不超过60滴的速度通过HLB小柱固相萃取装置中的HLB小柱流至棕色玻璃瓶中，于棕色玻璃瓶中密封冷藏。

6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于：固相萃取装置中的小柱选自：C18填料小柱或Oasis HLB 小柱。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

碱性介质为：NaOH

络合剂包括：EDTA及其盐、柠檬酸及其盐；

邻苯二甲醛衍生物包括：4，5-二甲氧基邻苯二甲醛、4-甲氧基邻苯二甲醛。