CN103018219A

CN103018219A - 4，5-二甲氧基邻苯二甲醛在水中铵氮检测中的应用及测定方法

Info

Publication number: CN103018219A
Application number: CN2012105199243A
Authority: CN
Inventors: 梁英; 潘英明; 黄国保; 曹毅成
Original assignee: Guilin University of Electronic Technology
Current assignee: Guilin University of Electronic Technology
Priority date: 2012-12-07
Filing date: 2012-12-07
Publication date: 2013-04-03

Abstract

本发明公开了4，5-二甲氧基邻苯二甲醛在水中铵氮检测中的应用及测定方法。具体的测定方法包括：1)在铵氮工作液中依次加入EDTA-4Na溶液、4，5-二甲氧基邻苯二甲醛溶液、亚硫酸钠溶液，然后用氢氧化钠溶液调节体系的pH值，反应平衡后，在λ_ex=379 nm下，测定400～600 nm的荧光曲线，记录最大发射波长处的荧光强度，作出工作曲线；2)将样品溶液在最大发射波长处的荧光强度根据工作曲线定量样品溶液中的铵氮含量。本发明所述方法中，4,5-二甲氧基邻苯二甲醛与铵氮的反应平衡时间缩短至50 min，且反应产物的最大激发波长红移至接近可见光区，为便携式铵氮在线荧光检测仪的研制奠定基础。

Description

4,5-二甲氧基邻苯二甲醛在水中铵氮检测中的应用及测定方法

技术领域

本发明涉及水中铵氮含量的检测领域，具体涉及4，5-二甲氧基邻苯二甲醛在水中铵氮检测中的应用，以及以4，5-二甲氧基邻苯二甲醛作为荧光试剂测定海水中痕量铵氮的方法。

背景技术

邻苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，简称OPA）是目前报道的广泛用于水中铵氮检测的荧光试剂，其与铵氮在亚硫酸钠的存在下，生成的荧光产物最大激发波长为361～365 nm，最大发射波长为422～425 nm(Genfa, Z., Dasgupta, P., 1989. Fluorometric measurement of aqueous ammonium ion in a flow injection system. Analytical Chemistry 61, 408-412；Amornthammarong,N., Zhang, J.Z., Ortner, P.B., 2011. An autonomous batch analyzer for the determination of trace ammoniumin natural waters using fluorometric detection. Analytical Methods 3, 1501-1506；余翔翔, 郭卫东, 2007. 海水中低含量铵氮的高灵敏度荧光法测定. 海洋科学 31(4), 37-41；陈曦等，海水中氨的荧光检测. 厦门大学学报(自然科学版).2001,40(1):59-61)。但邻苯二甲醛与铵氮的荧光反应速率较缓慢，需180min方可达到平衡(余翔翔, 郭卫东, 2007. 海水中低含量铵氮的高灵敏度荧光法测定. 海洋科学 31(4), 37-41)；另外，现有的便携式光学仪器多用LED作为光源，常见的LED灯波长多为370 nm以上，因此，难以基于OPA法开发出低成本便携式铵氮荧光检测仪。可见，开发出大于370 nm铵氮荧光检测试剂，可为便携式铵氮荧光检测仪开发研制的奠定基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供4，5-二甲氧基邻苯二甲醛在水中铵氮检测中作为荧光试剂的应用，以及以采用4，5-二甲氧基邻苯二甲醛作为荧光试剂检测海水中痕量铵氮的方法。采用4，5-二甲氧基邻苯二甲醛作为海水中铵氮检测中的荧光试剂，可大大缩短荧光试剂与铵氮反应达到平衡的时间，有效提高反应速度。

本发明的技术方案是：4，5-二甲氧基邻苯二甲醛在水中铵氮检测中作为荧光试剂的应用。具体地，是4，5-二甲氧基邻苯二甲醛在海水中铵氮检测中作为荧光试剂的应用。更具体地说，是4，5-二甲氧基邻苯二甲醛在海水中痕量铵氮检测中作为荧光试剂的应用。

本发明中所述的4，5-二甲氧基邻苯二甲醛(4，5-dimethoxyphthalaldehyde，简称M₂OPA)可参照现有文献(Meziane, M A, Royer ,S., Bazureau J P. , 2001. A practical ‘one-pot’ synthesis of ethyl isoquinoline-3-carboxylate by dominoreactions: a potential entry to constrained nonproteogenic amino acid derivatives. Tetrahedron Letters 42,1017-1020)中报道的方法进行制备，也可自行设计其它方法制备。

本发明所述的技术方案还包括以4，5-二甲氧基邻苯二甲醛作为荧光试剂测定海水中痕量铵氮的方法，包括以下步骤：

1)在铵氮工作液中依次加入乙二胺四乙酸四钠（简称EDTA-4Na）溶液、4，5-二甲氧基邻苯二甲醛溶液、亚硫酸钠溶液，然后用氢氧化钠溶液调节体系的pH值，反应平衡后，在最大激发波长λ_ex=379 nm下，测定400～600 nm范围内的荧光曲线，记录最大发射波长处的荧光强度IF（亦可直接测定最大发射波长处的荧光强度IF），作出铵氮浓度与最大发射波长处的荧光强度的工作曲线；

2)在样品溶液中依次加入EDTA-4Na溶液、4，5-二甲氧基邻苯二甲醛溶液、亚硫酸钠溶液，然后用氢氧化钠溶液调节体系的pH值，反应平衡后，在最大激发波长λ_ex=379 nm下，测定400～600 nm范围内的荧光曲线，记录最大发射波长处的荧光强度IF（亦可直接测定最大发射波长处的荧光强度IF），以该荧光强度根据工作曲线定量样品溶液中的铵氮含量。

更为具体的测定海水中痕量铵氮的方法，包括以下步骤：

1)在铵氮工作液中依次加入EDTA-4Na溶液、4，5-二甲氧基邻苯二甲醛溶液、亚硫酸钠溶液，控制反应液中4，5-二甲氧基邻苯二甲醛的浓度为0.0225～0.0675 g/L，控制反应液中亚硫酸钠的浓度为0.032～0.189 g/L；然后用氢氧化钠溶液调节体系的pH值为11.7～12.4，反应平衡后，在激发波长λ_ex=379 nm下，测定400～600 nm范围内的荧光曲线，记录最大发射波长处的荧光强度IF（亦可直接测定最大发射波长处的荧光强度IF），作出铵氮浓度与最大发射波长处的荧光强度的工作曲线；

2)在样品溶液中依次加入EDTA-4Na溶液、4，5-二甲氧基邻苯二甲醛溶液、亚硫酸钠溶液，控制反应液中4，5-二甲氧基邻苯二甲醛的浓度为0.0225～0.0675 g/L，控制反应液中亚硫酸钠的浓度为0.032～0.189 g/L；然后用氢氧化钠溶液调节体系的pH值为11.7～12.4，反应平衡后，在激发波长λ_ex=379 nm下，测定400～600 nm范围内的荧光曲线，记录最大发射波长处的荧光强度IF（亦可直接测定最大发射波长处的荧光强度IF），以该最大发射波长处的荧光强度根据工作曲线定量样品溶液中的铵氮含量。

上述方法中，为了减少误差，测定样品溶液时各试剂用量和反应条件应尽可能与制作工作曲线时相同。

上述方法中：

步骤2)中，加入EDTA-4Na溶液的作用是用于络合海水样品中的重金属离子，防止高pH条件时金属离子产生沉淀，其用量通常不作限制，当反应液中EDTA-4Na的浓度超过0.1 mol/L时，可用氢氧化钠溶液将海水反应液的pH值调节至11.7以上即没有沉淀产生，但最终pH值需控制在12.4以下。

步骤1)和步骤2)中，优选是控制反应液中4，5-二甲氧基邻苯二甲醛的浓度为0.040～0.050 g/L，更优选是控制反应液中4，5-二甲氧基邻苯二甲醛的浓度为0.045 g/L。

步骤1)和步骤2)中，所述的最大发射波长为482 nm。

在上述反应条件下，本方法中荧光试剂与铵氮反应至平衡需要的时间缩短至50 min，申请人在实验中发现，当反应时间在50～100 min，反应液的荧光强度都是较为稳定的。

上述方法中对反应一定时间后的溶液进行检测的仪器为荧光分光光度计。

上述方法同样适用于淡水中痕量铵氮的测定。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、首次将4,5-二甲氧基邻苯二甲醛作为铵氮检测中的荧光试剂，并建立其在水或海水中铵氮的荧光测定方法同时应用于实际海水样的测定；

2、4,5-二甲氧基邻苯二甲醛与铵氮能在室温条件下快速反应，反应平衡时间缩短至50 min，明显快于邻苯二甲醛与铵氮的荧光反应平衡时间(为180 min)；另外，4,5-二甲氧基邻苯二甲醛与铵氮荧光反应产物的最大激发波长λex=379 nm，最大荧光发射波长λem=482 nm，即激发波长红移至接近可见光区，基于此，为便携式铵氮在线荧光检测仪的研制奠定基础；

3、以本发明所述方法测定海水中铵氮的基底加标平均回收率为98.0%，海水基底对铵氮测定无干扰，说明本发明所述方法可用于海水中痕量铵氮的测定；

4、经过t统计学分析，证明以4,5-二甲氧基邻苯二甲醛为荧光试剂测定海水中铵氮浓度与OPA法无显著差异。

以下是申请人以4,5-二甲氧基邻苯二甲醛为荧光试剂，考察4,5-二甲氧基邻苯二甲醛(M₂OPA)与铵氮的荧光反应特性的实验部分，并根据这些实验最终确定了本发明所述方法的最佳反应条件。

1 实验部分

1.1 实验仪器与主要试剂

（1）RF-5301 PC型荧光分光光度计（日本岛津公司）：配有1 cm石英测定池，测定时激发和发射狭缝宽度均设置为5 nm。

（2）1.8 g/L 4,5-二甲氧基邻苯二甲醛（4，5-dimethoxyphthalaldehyde，简称M₂OPA）：称取自合成的M₂OPA（含量大于99%）0.18g溶于80 mL甲醇（色谱纯，阿拉丁）中，待完全溶解后，然后用水稀释至100 mL。

（3）1.26 g/L Na₂SO₃溶液：称取0.63 g 无水Na₂SO₃（A.R.,阿拉丁），溶于500 mL水中；

（4）1 mol/L NaOH溶液：称取10.0 g NaOH (G.R., 阿拉丁)溶于500 mL水中，加热煮沸至250 mL（除试剂溶液中的氨），冷却后，密封保存；；

（5）1 mol/L乙二胺四乙酸四钠(EDTA-4Na)溶液：称取74.4 g EDTA-4Na (A.R，阿拉丁) 和16 g NaOH (G.R., 阿拉丁)溶于400mL水中，加热煮沸至200 mL（除试剂溶液中的氨），冷却后，密封保存。

（6）20 mmol/L氨氮标准贮备液：准确称取0.3304 g经110℃恒重2h的(NH₄)₂SO₄（A.R., 广东西陇），少量水溶解并定容至150 mL，4℃冷藏保存。

（7）0.1 mmol/L氨氮标准使用液：准确吸取0.5 mL 20 mmol/L氨氮标准贮备液，用水稀释至100 mL。当天配制。氨氮工作液由此溶液稀释获得。

（8）3.4 g/L邻苯二甲醛(OPA)溶液：称取0.34g OPA（C.P., 广东西陇）溶于20 mL甲醇中，然后用水稀释至100 mL。

（9）15 g/L四硼酸钠缓冲溶液：3.75 g十水合四硼酸钠（上海光华化学试剂厂）溶于250 mL水中。

（10）实验用水：电阻率＞18.2 MΩ.cm的超纯水。

（11）所用试剂瓶和反应容器为聚丙烯材料塑料瓶。

1.2 容器清洗

容器经1:10盐酸浸泡24 h后，用RO水冲洗后，再置于1 mol/LNaOH溶液中浸泡24 h以上。使用前，用超纯水（电阻率＞18.2 MΩ.cm）冲洗干净，即洗即用。

1.3 实验方法

1.3.1 M₂OPA合成方法、产率及表征

参照文献（Meziane, M A, Royer , S., Bazureau J P. ,2001. A practical ‘one-pot’ synthesis of ethyl isoquinoline-3-carboxylate by domino reactions: a potential entry to constrained nonproteogenic amino acid derivatives. Tetrahedron Letters 42,1017-1020）中4,5-二甲氧基邻苯二甲醛合成方法，申请人通过给电子基团——甲氧基对OPA分子中的苯环进行基团修饰，制备出4,5-二甲氧基邻苯二甲醛。具体合成路线如下：

（1）化合物1的合成

在室温下，将3,4-甲氧基苯甲酸0.1 mol（18.2 g）溶于50 mL 1,4-二氧六环中，搅拌下逐滴加入50 mL甲醛溶液（质量分数为37%）和50 mL浓盐酸的混合溶液。加完后控制温度在60℃，反应3天后，将其用二氯甲烷（2×100 mL）萃取有机相，旋干溶剂，得白色固体物质；用95%乙醇重结晶三次，得白色针状结晶14.6 g，产率约为75%。

（2）化合物2的合成

在室温下，将化合物10.08 mol（14.6 g）溶于80 mL重蒸过的四氢呋喃中，搅拌令其完全溶解后，在冰盐浴下将其缓慢滴加至溶有LiAlH₄0.08mol（3.4 g）的50 mL重蒸过的四氢呋喃中，搅拌30 min后升温至50 ℃，反应8 h后，向其中分别滴加4 mL水，12 mL 15%NaOH溶液，8 mL水，继续反应30 min。过滤并用二氯甲烷洗涤滤渣，将所得滤液用无水MgSO₄干燥，旋干溶剂，得淡黄色油状物11.0g，产率约为74%。

（3）化合物3的合成

在干燥的250 mL圆底烧瓶中加入60 mL二氯甲烷和草酰氯（6mL，66mmol），搅拌下低温至 -78 ℃后，将二甲基亚砜（13.6 mL，0.176 mol）溶于25 mL二氯甲烷并逐滴加至烧瓶中，搅拌3～5 min；化合物2 （0.06 mol，11.0 g）溶于20 mL二氯甲烷-二甲基亚砜的混合溶液后缓慢加入，反应30 min；向其中加入80 mL三乙胺，保持温度在-78 ℃，搅拌10 min，然后缓慢升至室温。

向反应瓶中加入200 mL冰水混合物，并用二氯甲烷（2×100 mL）萃取有机相，并用无水MgSO₄干燥，旋干溶剂，所得粗产物经柱层析分离纯化(硅胶柱，洗脱液为二氯甲烷)，得深黄色晶体7.2 g(化合物3)，产率约为62%。

对化合物3进行分析，其结构表征如下：

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ10.60 (s, 2H), 7.48 (s,2H), 4.03 (s, 6H)；¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ190.1,153.2, 131.1, 111.6, 56.5. MS(ESI), m/z:195 ([M+H]⁺)。

因此，可确定化合物3为4,5-二甲氧基邻苯二甲醛，其结构式如下式所示：

1.3.2 M₂OPA荧光法测定海水中铵氮的实验方法

量取20 mL含一定浓度铵氮的标准工作溶液或样品溶液，依次加入2.5 mLEDTA-4Na溶液(用于络合海水中的金属离子作用)、0.625 mL的1.8 g/L M₂OPA溶液（反应液中M₂OPA浓度为0.045 g/L）、1.88mL 1.26 g/L Na₂SO₃溶液(反应液中Na₂SO₃浓度为0.095 g/L)、1mol/LNaOH溶液调节体系的pH约为11.7；室温条件下反应60 min后，在激发波长λ_ex=379 nm下，测定最大发射波长482 nm处的荧光强度IF。以IF值定量溶液中的铵氮浓度。

2 结果与讨论

2.1 激发光谱和荧光光谱

配制含铵氮浓度为0.5 μmol/L的标准溶液，按1.3.2节所述方法加入试剂，反应60 min, 测定溶液的激发光谱和荧光光谱，如图1所示。

图1表明，M₂OPA与铵反应生成的荧光物质最大激发波长λ_ex=379 nm,最大发射波长为λ_em=482 nm。

2.2 不同溶液的荧光光谱

为了进一步确定，铵氮与M₂OPA反应生成了荧光产物，分别配制a、b、c、d、e、f、g、h八种溶液，放置60 min后，在激发波长为379 nm下，测定溶液的荧光曲线，结果见图2。

所述的a、b、c、d、e、f、g、h八种溶液的具体配方如下：

a: 超纯水；

b: 20 mL超纯水+0.625 mL M₂OPA溶液；

c: 20 mL超纯水+2.5 mLEDTA-4Na溶液；

d: 20 mL超纯水+2.5 mL 1 mol/LEDTA-4Na溶液+1.88 mL 1.26 g/L Na₂SO₃溶液+0.22 mL 1 mol/L NaOH溶液；

e: 20 mL 0.500 μmol/L铵氮标液+2.5 mL 1 mol/LEDTA-4Na溶液+1.88 mL 1.26 g/L Na₂SO₃溶液+0.22 mL 1 mol/L NaOH溶液；

f: 20 mL超纯水+0.625 mL M₂OPA溶液+2.5 mL 1 mol/LEDTA-4Na溶液+1.88 mL 1.26 g/L Na₂SO₃溶液+0.22 mL 1 mol/LNaOH溶液（方法试剂空白)；

g: 20 mL 0.500 μmol/L铵氮标液+0.625 mL M₂OPA溶液+2.5mL 1 mol/LEDTA-4Na溶液+1.88 mL 1.26 g/L Na₂SO₃溶液+0.22 mL 1 mol/L NaOH溶液；

h: 20 mL 1.000 μmol/L铵氮标液+0.625 mL M₂OPA溶液+2.5mL 1mol/LEDTA-4Na溶液+1.88 mL 1.26 g/L Na₂SO₃溶液+0.22 mL1 mol/L NaOH溶液。

由图2可见，曲线a为超纯水的荧光峰，在425 nm处有一弱荧光峰；曲线b与a几乎重叠，说明在本实验测定条件下，荧光试剂M₂OPA溶液本身无明显荧光产生；

c,d,e完全重叠，与a类似，只在425 nm处有一弱荧光峰，说明在本实验测定条件下，EDTA-4Na溶液、Na₂SO₃、NaOH、铵氮在482 nm处无荧光产生；

曲线f、g、h分别是方法的试剂空白、0.500 μmol/L铵氮标液、1.000 μmol/L铵氮标液的荧光曲线，三条曲线的最大荧光峰所处位置均为482 nm,最大荧光峰的峰高随着反应溶液中铵氮浓度增加成比例增加；

综合比较曲线b、e、f、h可知，铵氮在本申请所述实验体系中与M₂OPA生成了荧光物质，其最大荧光峰位置位于482 nm处，与超纯水的荧光峰相差57 nm，因此，使用本申请所述的荧光试剂可避免超纯水荧光峰对测定的干扰。

2.3 试剂用量优化

以空白和0.2 μmol/L铵氮工作液为考察对象，采用单因素法优化了M₂OPA、亚硫酸钠加入量、反应溶液pH以及EDTA-4Na溶液对反应液的荧光强度影响。

2.3.1 M₂OPA用量

固定其它试剂加入量和反应条件如1.3.2节方法所述，改变M₂OPA加入量，考察M₂OPA用量对荧光强度的影响，结果见图3；扣除相应空白获得的荧光强度净增加值（DIF）与M₂OPA用量的关系见图4。

由图3和图4可知，对于0.5 μmol/L铵氮标液，随着反应液中M₂OPA浓度增加，IF强度呈现先快速增加后缓慢降低的趋势，当M₂OPA浓度在0.045 g/L时，荧光强度最大，当M₂OPA浓度超过0.045 g/L时，IF强度呈现缓慢下降趋势，这应归因于溶液中荧光物质的浓度增加，导致分子自吸作用而降低荧光强度；因此可将M₂OPA浓度控制在0.0225～0.0675 g/L范围内，优选控制在0.040～0.050 g/L。

对于空白，随着反应液中M₂OPA浓度增加，IF强度呈现缓慢增加趋势。

当M₂OPA浓度为0.045 g/L时，DIF最大，信噪比最高，因此，以下实验控制反应液中M₂OPA浓度为0.045 g/L。

2.3.2 pH的影响

按1.3.2节所述方法，固定其它试剂用量，通过改变NaOH加入量, 调节体系pH，考察pH对荧光强度的影响，结果见图5所示；扣除相应空白获得的DIF与pH关系见图6。

由图5和图6可知，当反应液pH位于11.7～12.4之间时，0.5 μmol/L铵氮工作液与试剂空白的荧光强度之差DIF最大，且相对恒定。可见，以M₂OPA为荧光试剂测定铵氮，测定的适宜pH范围为11.7～12.4，本实验控制体系的pH为11.7。

2.3.3 亚硫酸钠溶液用量的优化

按1.3.2节所述方法，固定M₂OPA用量和pH，通过改变亚硫酸钠溶液的加入量, 以空白和0.500 μmol/L铵氮工作液为对象，考察亚硫酸钠用量对荧光强度的影响，结果见图7所示。扣除相应空白获得的DIF与亚硫酸钠的关系见图8。

由图7和图8可见，当反应液中亚硫酸钠浓度处于0.032～0.189 g/L时，DIF趋于恒定。以下实验选择Na₂SO₃溶液加入量为1.88 mL，即反应液中Na₂SO₃浓度为0.095 g/L。

2.3.4络合剂EDTA-4Na的影响

将方法用于海水样测定时，为了防止高pH条件下海水中金属离子产生沉淀，在测定海水样品中的铵氮时，需加入络合剂。通过反复实验，在20 mL海水中，当加入1 mol/LEDTA-4Na络合剂使反应液中EDTA-4Na浓度超过0.1 mol/L时，可用NaOH溶液将海水样的pH调节至11.7以上，即不产生沉淀。

为了考察了EDTA-4Na对铵氮与M₂OPA荧光反应的影响，配制不同浓度的铵标准溶液，按1.3.2所述方法，固定M₂OPA、亚硫酸钠、pH以及反应液总体积，考察EDTA-4Na加入与否对荧光反应的影响，结果如下述表1所示。

表1 EDTA-4Na对存在与否的情况下不同铵氮标液的响应信号(IF)

表1表明，EDTA-4Na的加入将使各铵氮标液的响应信号略有下降，加入EDTA-4Na的IF～c曲线斜率约为不加的70%，可见EDTA-4Na加入对荧光信号略有影响。所以，为了消除EDTA-4Na的加入带来试剂空白及基底变化的影响，在样品测定时，工作曲线反应液中亦应加入EDTA-4Na溶液。

2.4 反应平衡时间的确定

以0.500 μmol/L铵氮工作液为对象，按1.3.2节方法配制反应液，立即倒入比色池，采用仪器的自动扫描模式，考察荧光强度随反应时间的变化趋势，结果见图9所示。

由图9可见，反应时间在50 min内，反应液荧光强度随反应时间的增加呈线性增加，在 50 min～100 min里，随着反应时间的延长，反应液的荧光强度趋于稳定，超过100 min后，荧光强度逐渐变弱。说明铵氮与M₂OPA在本实验条件下，反应平衡时间仅需50 min，反应平衡后，荧光产物可稳定约50 min时间。本实验控制反应时间为60 min。

2.5 工作曲线和检测限

配制在0～1.000 μmol/L范围内(0 μmol/L、0.125 μmol/L、0.250 μmol/L、0.500 μmol/L、0.750 μmol/L、1.000 μmol/L)的铵氮工作液，按1.3.2所述，加入试剂，反应60 min，设置激发波长为379 nm，发射波长为482 nm，测定荧光强度IF。

以482 nm处的荧光强度 (IF)为纵坐标，溶液中铵氮浓度为横坐标作工作曲线，所得工作曲线如图10所示，工作曲线回归方程为

（R²=0.9972，n=6），线性范围为0 μmol/L～1.000 μmol/L。为了减少测定误差，测定样品时，工作曲线需当天测定。

4次试剂空白平行的测定信号为96.023±0.905. 以三倍空白标准偏差除以工作曲线斜率，得到检测限为0.0078 μmol/L。

2.6 基底加标回收率

移取2012年8月取自南海SEATS站的表层海水（厦门大学提供）20 mL，分别加入25、50、100、150、200 μL的0.1 mmol/L铵氮标液，即海水中铵氮的加标浓度为0.125、0.250、0.500、0.750、1.000 μmol/L，按照1.3.2方法加入其它试剂，室温反应60 min后，测定荧光强度（IF）。以IF为纵坐标，基底中铵氮加标浓度为横坐标作海水基底加标曲线，如图11所示。由图11可见，海水基底加标曲线为

（R²=0.9986，n=6）。

基底加标曲线斜率与工作曲线斜率之比即为方法的基底加标回收率（Ying Liang, Dongxing Yuan, Quanlong Li, Qinmei Lin.Flow injection analysis of nanomolar level orthophosphate in seawater with solid phase enrichment and colorimetric detection. Marine Chemistry. 2007, 103: 122-130.），则本方法测定海水的基底加标回收率为：

可见，本方法用于海水样中铵氮的测定时，基底无干扰，即本方法可用于海水样中痕量铵氮的测定。

3小结

(1)参考文献在实验室成功合成出4,5-二甲氧基邻苯二甲醛，首次利用这一试剂建立海水中铵氮的荧光测定方法并应用于实际海水样的测定。

(2)M₂OPA与铵氮能在室温条件下快速反应，反应平衡时间为50 min，明显快于OPA与铵氮的荧光反应平衡时间（为180 min）；M₂OPA与铵氮荧光反应产物的最大激发波长λex=379 nm，最大荧光发射波长λem=482 nm，即激发波长红移至可见光区，基于此，有利于便携式铵氮在线荧光检测仪的研制。

(3)以本方法测定海水中铵氮的基底加标平均回收率为98.0%之间，海水基底对铵氮测定无干扰。

附图说明

图1为M₂OPA与铵氮（浓度为0.2 μmol/L）荧光反应产物的激发光谱和荧光光谱曲线(室温反应，约20℃)，其中1为激发光谱曲线，2为荧光光谱曲线。

图2为a、b、c、d、e、f、g、h八种溶液的荧光光谱曲线，由下往上，曲线标记为a、b、c、d、e、f、g、h，其中c、d、e重叠在一起， a、b、c、d、e、f、g、h八种溶液的具体配方如下：

a: 超纯水；

b: 20 mL超纯水+0.625 mL M₂OPA溶液；

c: 20 mL超纯水+2.5 mLEDTA-4Na溶液；

h: 20 mL 1.000 μmol/L铵氮标液+0.625 mL M₂OPA溶液+2.5mL 1 mol/LEDTA-4Na溶液+1.88 mL 1.26 g/L Na₂SO₃溶液+0.22 mL 1 mol/L NaOH溶液；

图3为固定EDTA-4Na、亚硫酸钠和氢氧化钠的用量时，M₂OPA用量对荧光强度的影响的关系曲线图(

0.5 μmol/L铵氮溶液，

空白溶液)；

图4 为图3中扣除相应空白获得的DIF与M₂OPA用量的关系曲线图；

图5为固定EDTA-4Na、M₂OPA和亚硫酸钠的用量时，pH对反应液荧光强度的影响的关系曲线图(

0.5 μmol/L铵氮溶液，

空白溶液)；

图6为图5中扣除相应空白获得的DIF与pH的关系曲线图；

图7为固定EDTA-4Na、M₂OPA和氢氧化钠的用量时，亚硫酸钠用量对空白和0.500 μmol/L铵氮工作液荧光强度的影响的关系曲线图(

0.5μmol/L铵氮溶液，

空白溶液)；

图8为图7中扣除相应空白获得的亚硫酸钠用量对DIF的影响的关系曲线图；

图9为反应液的荧光强度与反应时间的关系曲线图；

图10为浓度0～1.000 μmol/L范围内的铵氮工作曲线；

图11为海水基底加标曲线。

具体实施方式

下面以具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。

实施例1

1)制作工作曲线：

按1.3.2所述，取20 mL铵氮浓度为0 μmol/L、0.250 μmol/L、0.500 μmol/L、0.750 μmol/L、1.000 μmol/L的铵氮工作液，每份铵氮工作液中依次加入2.5 mL的1 mol/L EDTA-4Na溶液、0.625mL的1.8 g/L M₂OPA溶液（反应液中MO₂PA浓度为0.045 g/L）、1.88 mL 1.26 g/L Na₂SO₃溶液(反应液中亚硫酸钠浓度为0.095g/L)、1 mol/LNaOH溶液调节体系的pH约为11.7 (加入的NaOH溶液体积约为0.2 mL)；室温条件下反应60 min后，用RF-5301 PC型荧光分光光度计(测定时激发和发射狭缝宽度均设置为5 nm)，设置激发波长为379 nm，发射波长为482 nm，测定荧光强度IF，以IF为纵坐标，反应液中铵氮浓度为横坐标，作出铵氮浓度与482 nm处的荧光强度的工作曲线：IF=244.33c+88.407 (n=5, R²=0.9979)；

2)海水样品的测定

将2个取自南海SEATS站附近的表层海水样（厦门大学提供）各20 mL，编号为1#、2#，每个分别依次加入2.5 mL的1 mol/L EDTA-4Na溶液、0.625 mL的1.8 g/L M₂OPA溶液（反应液中MO₂PA浓度为0.045g/L）、1.88 mL 1.26 g/L Na₂SO₃溶液(反应液中亚硫酸钠浓度为0.095 g/L)、1 mol/LNaOH溶液调节体系的pH约为11.7 (加入的NaOH溶液体积约为0.3 mL)；室温条件下反应60 min后，用RF-5301PC型荧光分光光度计(测定时激发和发射狭缝宽度均设置为5 nm)，设置激发波长为379 nm，发射波长为482nm，测定荧光强度IF。

1#号样品平行3次测定荧光峰值分别为：161.154、152.171、151.945，平均值为155.090±5.253，根据工作曲线求得1#样品中的铵氮含量为0.276±0.022 μmoL/L（n=3）；2#号样品平行3次测定荧光峰值分别为：176.013，180.540，182.452，平均值为179.668±3.306，根据工作曲线求得2#样品中的铵氮含量为0.378±0.014 μmol/L（n=3）。

为说明本发明所述方法的准确性，申请人在测定上述样品的同一天，采用OPA法测定1#、2#样品，测定步骤同文献所述(余翔翔, 郭卫东,2007. 海水中低含量铵氮的高灵敏度荧光法测定. 海洋科学 31(4),37-41)，测定结果分别为0.265±0.013 μmol/L（n=3）和0.364±0.014 μmol/L（n=3）。

采用t统计学检验方法，检验OPA法测定结果和本发明方法M₂OPA法测定结果的差异，统计检验结果P＜0.05，说明两者无显著性差异。可见，本发明所述方法测定海水中痕量铵氮是准确可靠的。

Claims

1.4，5-二甲氧基邻苯二甲醛在水中铵氮检测中作为荧光试剂的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：4，5-二甲氧基邻苯二甲醛在海水中铵氮检测中作为荧光试剂的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：4，5-二甲氧基邻苯二甲醛在海水中痕量铵氮检测中作为荧光试剂的应用。

4.一种测定海水中痕量铵氮的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)在铵氮工作液中依次加入乙二胺四乙酸四钠溶液、4，5-二甲氧基邻苯二甲醛溶液、亚硫酸钠溶液，然后用氢氧化钠溶液调节体系的pH值，反应平衡后，在激发波长λ_ex=379 nm下，测定400～600 nm的荧光曲线，记录最大发射波长处的荧光强度，作出铵氮浓度与最大发射波长处的荧光强度的工作曲线；

2)在样品溶液中依次加入乙二胺四乙酸四钠溶液、4，5-二甲氧基邻苯二甲醛溶液、亚硫酸钠溶液，然后用氢氧化钠溶液调节体系的pH值，反应平衡后，在激发波长λ_ex=379 nm下，测定400～600 nm范围内的荧光曲线，记录最大发射波长处的荧光强度，以该最大发射波长处的荧光强度根据工作曲线定量样品溶液中的铵氮含量。

5.根据权利要求4所述的测定海水中痕量铵氮的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

1)在铵氮工作液中依次加入乙二胺四乙酸四钠溶液、4，5-二甲氧基邻苯二甲醛溶液、亚硫酸钠溶液，控制反应液中4，5-二甲氧基邻苯二甲醛的浓度为0.0225～0.0675 g/L，控制反应液中亚硫酸钠的浓度为0.032～0.189 g/L；然后用氢氧化钠溶液调节体系的pH值为11.7～12.4，反应平衡后，在激发波长λ_ex=379 nm下，测定400～600 nm范围内的荧光曲线，记录最大发射波长处的荧光强度，作出铵氮浓度与最大发射波长处的荧光强度的工作曲线；

2)在样品溶液中依次加入乙二胺四乙酸四钠溶液、4，5-二甲氧基邻苯二甲醛溶液、亚硫酸钠溶液，控制反应液中4，5-二甲氧基邻苯二甲醛的浓度为0.0225～0.0675 g/L，控制反应液中亚硫酸钠的浓度为0.032～0.189 g/L；然后用氢氧化钠溶液调节体系的pH值为11.7～12.4，反应平衡后，在激发波长λ_ex=379 nm下，测定400～600 nm范围内的荧光曲线，记录最大发射波长处的荧光强度，以该最大发射波长处的荧光强度根据工作曲线定量样品溶液中的铵氮含量。

6.根据权利要求4或5所述的测定海水中痕量铵氮的方法，其特征在于：步骤1)和步骤2)中，控制反应液中4，5-二甲氧基邻苯二甲醛的浓度为0.040～0.050 g/L。

7.根据权利要求4或5所述的测定海水中痕量铵氮的方法，其特征在于：步骤1)和步骤2)中，所述的最大发射波长为482 nm。

8.根据权利要求4或5所述的测定海水中痕量铵氮的方法，其特征在于：步骤1)和步骤2)中，反应至平衡的时间为50 min，在反应平衡后的50 min内，反应液的荧光强度均是较为稳定的。