CN102866141A

CN102866141A - 4-甲氧基邻苯二甲醛在海水中铵氮检测中的应用及测定方法

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Publication number: CN102866141A
Application number: CN2012103706008A
Authority: CN
Inventors: 梁英
Original assignee: Guilin University of Electronic Technology
Current assignee: Guilin University of Electronic Technology
Priority date: 2012-09-28
Filing date: 2012-09-28
Publication date: 2013-01-09
Anticipated expiration: 2032-09-28
Also published as: CN102866141B

Abstract

本发明公开了4-甲氧基邻苯二甲醛在海水中铵氮检测中的应用及测定方法。具体的测定方法包括：1)在铵氮工作液中依次加入柠檬酸钠溶液、4-甲氧基邻苯二甲醛溶液、亚硫酸钠溶液，然后用氢氧化钠溶液调节体系的pH值，反应一定时间后，在λ_ex=370nm，测定390～550nm范围内的荧光曲线，记录最大发射波长处的荧光强度，作出铵氮浓度与最大发射波长处的荧光强度的工作曲线；2)将样品溶液在最大发射波长处的荧光强度根据工作曲线定量样品溶液中的铵氮含量。与现有技术相比，采用4-甲氧基邻苯二甲醛作为荧光试剂，可避免超纯水背景荧光峰的干扰；采用本发明所述方法检测海水中超痕量铵氮时反应速度更快、灵敏度更高。

Description

4-甲氧基邻苯二甲醛在海水中铵氮检测中的应用及测定方法

技术领域

本发明涉及海水中铵氮含量的检测领域，具体涉及4-甲氧基邻苯二甲醛在海水中铵氮检测中的应用，以及以4-甲氧基邻苯二甲醛作为荧光试剂测定海水中超痕量铵氮含量的方法。

背景技术

铵氮是水体中浮游植物可直接利用的最重要的无机氮形态，其它形态的氮首先需转化为铵氮才可被浮游植物所利用。在内陆水体和近岸海域，由于受人类活动的影响，水体中铵氮含量较高，甚至达到毒害水生生物和破坏水体生态平衡的程度。然而，在一些大洋表层海水中，铵氮含量通常低于1μmol/L；一些寡营养盐海域表层海水中的铵氮浓度可低至nmol/L量级，甚至更低。大洋表层海水中超痕量（低至nmol/L量级）铵氮的准确检测是研究氮的海洋生物地区循环的关键基础之一。

邻苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，简称OPA）是目前唯一报道的可用于海水中铵氮检测的荧光试剂，其与铵氮在亚硫酸钠的存在下，生成的荧光产物最大激发波长为361～365nm，最大发射波长为422～425nm(Genfa,Z.,Dasgupta,P.,1989.Fluorometric measurement of aqueous ammonium ionin a flow injection system.Analytical Chemistry 61,408-412；Amornthammarong,N.,Zhang,J.Z.,Ortner,P.B.,2011.An autonomousbatch analyzer for the determination of trace ammonium in naturalwaters using fluorometric detection.Analytical Methods 3,1501-1506；余翔翔,郭卫东,2007.海水中低含量铵氮的高灵敏度荧光法测定.海洋科学31(4),37-41；陈曦等，海水中氨的荧光检测.厦门大学学报(自然科学版).2001,40(1):59-61)。邻苯二甲醛与铵氮的荧光反应速率缓慢，需180min方可达到平衡(余翔翔,郭卫东,2007.海水中低含量铵氮的高灵敏度荧光法测定.海洋科学31(4),37-41)，基于该反应建立的方法（简称OPA法）灵敏度尚无法准确检测含量低至nmol/L量级海水中的铵氮；此外，我们在实验过程中发现，OPA法检测铵氮时，即使是Millipore机制备的新鲜超纯水（电阻率大于18.2MΩ.cm^-1），在425nm处亦有不可忽略的背景荧光峰(这可能是因为水中所含的极微量有机物的自身荧光导致)，这一背景峰对于较高浓度铵氮检测影响不大，但对超痕量铵氮检测将是不可忽视的干扰因素。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供4-甲氧基邻苯二甲醛在海水中铵氮检测中的应用，以及以4-甲氧基邻苯二甲醛作为荧光试剂测定海水中超痕量铵氮的方法。采用4-甲氧基邻苯二甲醛作为海水中铵氮检测中的荧光试剂，可避免超纯水背景荧光峰的干扰；采用本发明所述方法检测海水中超痕量铵氮时反应速度更快、灵敏度更高。

具体地，本发明将提供4-甲氧基邻苯二甲醛在海水中铵氮检测中作为荧光试剂的应用。更具体地说，是4-甲氧基邻苯二甲醛在海水中超痕量铵氮检测中作为荧光试剂的应用。

本发明中所述的4-甲氧基邻苯二甲醛(4-methoxyphthalaldehyde，简称MOPA)可参照现有文献(Meziane,M A,Royer,S.,Bazureau J P.,2001.A practical‘one-pot’synthesis of ethyl isoquinoline-3-carboxylateby domino reactions:a potential entry to constrained nonproteogenicamino acid derivatives.Tetrahedron Letters 42,1017–1020)中报道的方法进行制备，也可自行制备。

本发明还提供以4-甲氧基邻苯二甲醛作为荧光试剂测定海水中超痕量铵氮的方法，它包括以下步骤：

1)在铵氮工作液中依次加入柠檬酸钠溶液、4-甲氧基邻苯二甲醛溶液、亚硫酸钠溶液，然后用氢氧化钠溶液调节体系的pH值，反应一定时间后，在λ_ex=370nm，测定390～550nm范围内的荧光曲线，记录最大发射波长处的荧光强度，作出铵氮浓度与最大发射波长处的荧光强度的工作曲线；

2)在样品溶液中依次加入柠檬酸钠溶液、4-甲氧基邻苯二甲醛溶液和亚硫酸钠溶液，然后用氢氧化钠溶液调节体系的pH值，反应一定时间后，在λ_ex=370nm，测定390～550nm范围内的荧光曲线，记录最大发射波长处的荧光强度，以该最大发射波长处的荧光强度根据工作曲线定量样品溶液中的铵氮含量。

更为具体的测定海水中超痕量铵氮的方法包括以下步骤：

1)在铵氮工作液中依次加入柠檬酸钠溶液、4-甲氧基邻苯二甲醛溶液、亚硫酸钠溶液，控制反应液中4-甲氧基邻苯二甲醛的浓度为0.060～0.500g/L，控制反应液中亚硫酸钠的浓度为0.040～0.080g/L；然后用氢氧化钠溶液调节体系的pH值为11.2～12.0，反应一定时间后，在λ_ex=370nm，测定390～550nm范围内的荧光曲线，记录最大发射波长处的荧光强度，作出铵氮浓度与最大发射波长处的荧光强度的工作曲线；

2)在样品溶液中依次加入柠檬酸钠溶液、4-甲氧基邻苯二甲醛溶液和亚硫酸钠溶液，控制反应液中4-甲氧基邻苯二甲醛的浓度为0.060～0.500g/L，控制反应液中亚硫酸钠的浓度为0.040～0.080g/L；然后用氢氧化钠溶液调节体系的pH值为11.2～12.0，反应一定时间后，在λ_ex=370nm，测定390～550nm范围内的荧光曲线，记录最大发射波长处的荧光强度，以该最大发射波长处的荧光强度根据工作曲线定量样品溶液中的铵氮含量。

上述方法中，

步骤1)中，如果是测定淡水中的铵氮则不需要加入柠檬酸钠溶液，只有在测定海水样品时才加入。加入柠檬酸钠溶液的作用是用于络合海水样品中的重金属离子，防止沉淀生成，其用量通常不作限制，当样品溶液中柠檬酸钠浓度超过19g/L时，可用氢氧化钠溶液将海水样品溶液的pH值调节至11.4以上直至不产生沉淀，但最终pH值需控制在12.0以下。

步骤1)和步骤2)中，优选是控制反应液中4-甲氧基邻苯二甲醛的浓度为0.060～0.120g/L。

步骤1)和步骤2)中，所述的最大发射波长为454nm。

在上述检测条件下，本方法检测海水中超痕量铵氮的检测限为0.00029μmol/L。

上述方法中对反应一定时间后的溶液进行检测的仪器为荧光分光光度计。

采用4-甲氧基邻苯二甲醛为荧光试剂，以上述方法对海水中超痕量铵氮进行测定，4-甲氧基邻苯二甲醛与铵氮的荧光反应在100min即可达到平衡。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、采用4-甲氧基邻苯二甲醛为荧光试剂，4-甲氧基邻苯二甲醛与铵氮能在室温下快速反应，反应液的最大激发波长λex=370nm，最大发射波长λem=454nm；而且以4-甲氧基邻苯二甲醛为荧光试剂测定超痕量铵氮，可避免超纯水背景荧光峰的干扰；

2、以4-甲氧基邻苯二甲醛为荧光试剂测定超痕量铵氮的方法的灵敏度明显高于OPA法；

3、本发明所述方法的检测限为0.00029μmol/L，优于OPA法；

4、以4-甲氧基邻苯二甲醛为荧光试剂测定铵氮的基底加标回收率介于90%～110%之间，海水基底对铵氮测定无干扰，说明本发明所述方法可用于海水中超痕量铵氮的测定。

以下是申请人以4-甲氧基邻苯二甲醛为荧光试剂，考察4-甲氧基邻苯二甲醛(MOPA)与铵氮的荧光反应特性的实验部分，并根据这些实验最终确定了本发明所述方法的最佳反应条件。

1实验部分

1.1实验仪器与主要试剂

（1）RF-5301 PC型荧光分光光度计（日本岛津公司）：配有1cm石英测定池，在无特别说明情况下，测定时激发和发射狭缝宽度均设置为5nm。

（2）7.8g/L 4-甲氧基邻苯二甲醛（4-methoxyphthalaldehyde，简称MOPA）：称取自合成的MOPA（含量大于99%）1.94g溶于150mL甲醇（色谱纯，阿拉丁）中，待完全溶解后，然后用2:1（v/v）甲醇水稀释至250mL。

（3）1.26g/L Na₂SO₃溶液：称取0.63g无水Na₂SO₃（A.R.,阿拉丁），溶于500mL水中；

（4）0.05mol/L NaOH溶液：称取2.0g NaOH(G.R.,阿拉丁)溶于500mL水中；

（5）1mol/L NaOH溶液：称取20.0g NaOH(G.R.,阿拉丁)溶于500mL水中；

（6）200g/L柠檬酸钠溶液：称取20g柠檬酸钠(用于分子生物学，≥99.0%，阿拉丁)溶解于少量水中，用水稀释至100mL。

（7）20mmol/L氨氮标准贮备液：准确称取0.3304g经110℃恒重2h的(NH₄)₂SO₄（A.R.,广东西陇），少量水溶解并定容至150mL，4℃冷藏保存。

（8）0.1mmol/L氨氮标准使用液：准确吸取0.5mL 20mmol/L氨氮标准贮备液，用水稀释至100mL。当天配制。氨氮工作液由此溶液稀释获得。

（9）3.4g/L邻苯二甲醛(OPA)溶液：称取0.34g OPA（C.P.,广东西陇）溶于20mL甲醇中，然后用水稀释至100mL。

（10）15g/L四硼酸钠缓冲溶液：3.75g十水合四硼酸钠（上海光华化学试剂厂）溶于250mL水中。

（12）实验用水：配制试剂用水为millipore纯水机所制新鲜超纯水（电阻率＞18.2MΩ.cm）。

（13）所用试剂瓶和反应容器为聚丙烯材料塑料瓶。

1.2容器清洗

容器经1:10盐酸浸泡24h后，依次用自来水、RO水清洗，然后置于1mol/LNaOH溶液中浸泡1h以上。使用前，用国产超纯水机所制超纯水（电阻率＞18.2MΩ.cm）清洗、millipore纯水机所制新鲜超纯水（电阻率＞18.2MΩ.cm）润洗容器。

1.3实验方法

1.3.1MOPA合成方法

在实验中，申请人通过给电子基团——甲氧基对OPA分子中的苯环进行基团修饰，制备出4-甲氧基邻苯二甲醛。具体合成路线如下：

（1）化合物1的合成

在室温下，将3-甲氧基苯甲酸0.1mol（15.2g）溶于50mL 1,4-二氧六环中，搅拌下逐滴加入50mL甲醛溶液（质量分数为37%）和50mL浓盐酸的混合溶液。加完后控制温度在60℃，反应3天后，将其用二氯甲烷（2×100mL）萃取有机相，旋干溶剂，得白色固体物质；用95%乙醇重结晶三次，得白色针状结晶11.42g，产率约为70.1%，熔点：119～120℃。

（2）化合物2的合成

在室温下，将化合物10.07mol（11.4g）溶于80mL重蒸过的四氢呋喃中，搅拌令其完全溶解后，在冰盐浴下将其缓慢滴加至溶有LiAlH₄0.08mol（3.4g）的50mL重蒸过的四氢呋喃中，搅拌30min后升温至50℃，反应8h后，向其中分别滴加4mL水，12mL 15% NaOH溶液，8mL水，继续反应30min。过滤并用二氯甲烷洗涤滤渣，将所得滤液用无水MgSO₄干燥，旋干溶剂，得淡黄色油状物8.46g，产率约为72.2%。

（3）化合物3的合成

在干燥的250mL圆底烧瓶中加入60mL二氯甲烷和草酰氯（6mL，66mmol），搅拌下低温至-78℃后，将二甲基亚砜（13.6mL，0.176mol）溶于25mL二氯甲烷并逐滴加至烧瓶中，搅拌3-5min；化合物2（0.06mol，10.0g）溶于20mL二氯甲烷-二甲基亚砜的混合溶液后缓慢加入，反应30min；向其中加入80mL三乙胺，保持温度在-78℃，搅拌10min，然后缓慢升至室温。

向反应瓶中加入200mL冰水混合物，并用二氯甲烷（2×100mL）萃取有机相，并用无水MgSO₄干燥，旋干溶剂，所得粗产物经柱层析分离纯化(硅胶柱，洗脱液为二氯甲烷)，得深黄色晶体5.9g(化合物3)。

1.3.2MOPA荧光法测定海水中铵氮的实验方法

量取10mL含一定浓度铵氮的标准工作溶液或样品溶液，依次加入0.70mL300g/L的柠檬酸钠溶液(用于络合样品中的重金属离子，防止沉淀生成，测定海水样时加入)、0.2mL的7.76g/L MOPA溶液（反应液中MOPA浓度为0.12g/L）、0.5mL 1.26g/L Na₂SO₃溶液(反应液中亚硫酸钠浓度为0.051g/L)、一定浓度的NaOH溶液调节体系的pH约为11.4；室温条件下反应一定时间后，在λ_ex=370nm，测定390～550nm范围内的荧光曲线，以最大发射波长（454nm）处荧光强度（I_F）定量溶液中铵氮含量。

2结果与讨论

2.1MOPA合成产率和表征

化合物3：产率约为60.1%，深黄色晶体,mp76～78℃。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ10.61(s,1H),10.29(s,1H),7.90(d,J=8.5Hz,1H),7.41(d,J=2.6Hz,1H),7.19(dd,J=8.5,2.6Hz,1H),3.92(s,3H)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ192.0,191.0,163.9,138.6,134.7,129.5,118.8,114.8,56.0.MS(ESI),m/z:165([M+H]⁺)。

因此，可确定化合物3为4-甲氧基邻苯二甲醛，其结构式如下式所示：

2.2MOPA与铵氮的反应体系确定

分别考察了MOPA与铵在不同体系中的荧光反应情况。考察的反应体系包括亚硫酸钠-硼砂缓冲液体系、亚硫酸钠-盐酸体系、亚硫酸钠-氢氧化钠体系。发现在亚硫酸钠-硼砂缓冲液体系、亚硫酸钠-盐酸体系中，反应溶液无荧光；在亚硫酸钠-氢氧化钠体系中，溶液有强荧光产生。因此，选择亚硫酸钠-氢氧化钠为MOPA与铵氮的反应体系。

2.3激发光谱和荧光光谱

2.3.1激发光谱和荧光光谱

配制0.2μmol/L铵工作液，按1.3.2所述方法加入试剂，反应30min,测定溶液的激发光谱和荧光光谱，如图1所示。

图1表明，MOPA与铵生成的荧光物质最大激发波长λ_ex=370nm,最大发射荧光波长λ_em=454nm。

2.3.2不同溶液的荧光光谱

为了进一步确定，在亚硫酸钠-氢氧化钠体系中，铵氮与MOPA反应生成了荧光产物，分别配制a，b，c，d，e，f六种溶液，放置30min后，在激发波长为370nm下，测定溶液的荧光曲线，结果见图2。

所述的a，b，c，d，e，f六种溶液的具体配方如下：

a:超纯水；

b:10mL 0.2μmol/L铵氮+0.65mL 0.034M NaOH+0.65mL 300g/L柠檬酸钠溶液+0.5mL 1.26g/L Na₂SO₃溶液；

c:0.2mL 7.8g/L MOPA；

d:10mL 0.2μmol/L铵氮+0.2mL 7.8g/L MOPA+0.5mL 1.26g/L Na₂SO₃溶液；

e:10mL 0.2μmol/L铵氮+0.2mL 7.8g/L MOPA+0.65mL 0.034MNaOH++0.5mL 1.26g/L Na₂SO₃溶液（pH=11.4）；

f:10mL 0.2μmol/L铵氮+0.2mL 7.8g/L MOPA+0.70mL 0.034MNaOH+0.70mL 300g/L柠檬酸钠溶液+0.5mL 1.26g/L Na₂SO₃溶液（pH=11.4）。

由图2可见，曲线b和超纯水的荧光曲线a几乎重叠，说明在本实验测定条件下，铵氮、NaOH、Na₂SO₃和柠檬酸钠无荧光产生；

曲线c为MOPA溶液的荧光曲线，显示MOPA有微弱荧光信号产生；

曲线d是铵氮、MOPA、Na₂SO₃混合液的荧光曲线，相对曲线c，荧光强度有较大增加，说明铵氮、MOPA、Na₂SO₃三者发生反应并生成荧光强度较大的物质；

曲线e为铵氮、MOPA、Na₂SO₃在NaOH存在下的荧光曲线（pH=11.4），相对于曲线d，最大发射波长无变化，但荧光强度明显增强，说明反应体系pH明显影响铵氮与MOPA、Na₂SO₃的反应速率；

曲线f和曲线e几乎重叠，说明柠檬酸钠的加入对荧光反应无影响（有关柠檬酸钠的影响将在之后的2.4.4详细说明）。

曲线e或f的最大吸收峰位于454nm处，,与超纯水425nm处的背景荧光峰相差近30nm，可见超纯水的背景荧光峰不再干扰测定。

2.4试剂用量优化

以空白和0.2μmol/L铵氮工作液为考察对象，采用单因素法优化了MOPA、亚硫酸钠加入量、反应溶液pH以及柠檬酸钠溶液对反应液的荧光强度影响。为了保证结果的可比性，严格控制同一曲线上各点反应时间和反应温度的一致性，此部分实验为室温反应15min。

2.4.1MOPA用量的确定

固定其它试剂加入量和反应条件如1.3.2所述方法所述，改变MOPA加入量，考察MOPA用量对荧光强度的影响，结果见图3；扣除相应空白获得的DI_F与MOPA用量的关系见图4。

由图3和图4可知，反应液中，MOPA浓度在0.060～0.500g/L范围内，DI_F基本保持不变，但随着MOPA浓度的增加会缓慢增加空白值，为了获得较低的空白值，优选选择反应液中MOPA浓度控制在0.060～0.12g/L范围内。

2.4.2pH的影响

按1.3.2所述方法，固定MOPA和亚硫酸钠的用量，通过改变NaOH加入量,调节体系pH，考察pH对荧光强度的影响，结果见图5所示。扣除相应空白获得的DI_F与pH关系见图6。

由图5和图6可知，当反应液pH位于11.2～12.0之间时，0.2μmol/L铵氮工作液和空白的荧光强度I_F，以及两者之差DI_F最大，且相对恒定。可见，以MOPA为荧光试剂测定铵氮，测定的最佳pH范围为11.2～12.0，本实验控制体系的pH为11.4。

2.4.3亚硫酸钠用量的影响

按1.3.2所述方法，固定MOPA用量和pH，通过改变亚硫酸钠溶液的加入量,以空白和0.2μmol/L铵氮工作液为对象，考察亚硫酸钠用量对荧光强度的影响，结果见图7所示。扣除相应空白获得的DI_F与NaOH用量的关系见图8。

可见，当亚硫酸钠用量在0.4～0.8mL范围内，即反应液中亚硫酸钠浓度处于0.040～0.080g/L时，DI_F趋于恒定。

2.4.4柠檬酸钠的用量及影响

如将方法用于海水样测定，为了防止高pH条件下海水中碱金属离子产生沉淀，在测定海水样品中的铵氮时，需加入络合剂。通过反复实验，在10mL海水中，当加入络合剂300g/L柠檬酸钠溶液0.70mL时,即样品中柠檬酸钠浓度超过19g/L时，可用NaOH溶液将海水样的pH调节至11.4以上，且不产生沉淀。10mL海水样在络合剂存在下，加入0.5mL 1mol/L NaOH溶液，pH约为11.4。

为了考察了柠檬酸钠对铵氮与MOPA荧光反应的影响，配制不同浓度的铵标准溶液，按1.3.2所述方法，固定MOPA、亚硫酸钠、pH以及反应液总体积，考察柠檬酸钠加入与否对荧光反应的影响，结果如下述表1所示。

表1柠檬酸钠存在与否的情况下不同铵氮标液的响应信号(IF)

表1中数据表明，柠檬酸钠存在与否的情况下，空白信号值相当，工作曲线的斜率比为0.9652，说明柠檬酸钠的加入对测定无影响。

2.5反应动力学

按1.3.2所述方法，加入试剂，考察了0.2umol/L铵氮与MOPA反应液的荧光强度随反应时间的变化，结果如图9所示。

图9表明，反应时间在100min内，反应液荧光强度随反应时间的增加呈线性增加，随后，趋于稳定，说明铵氮与MOPA在本实验条件下，平衡反应时间为100min，明显快于OPA与铵氮反应所需的180min平衡时间。为了将荧光信号控制在仪器量程内，反应动力学曲线中各点荧光信号测定时，仪器的激发光入射狭缝宽度设置5nm,荧光发射狭缝宽度设置为3nm。

2.6工作曲线、检测限、重复性及灵敏度

2.6.1工作曲线、检测限和重复性

配制在0.025～0.300μmol/L范围内的氨氮工作液，按1.3.2所述，加入试剂。反应15min，设置激发波长为370nm，在380～550nm范围内测荧光曲线，结果如图10所示。

以454nm处对应的荧光值(I_F)为纵坐标，溶液中铵氮浓度为横坐标画工作曲线，工作曲线的回归方程为I_F=833.4C_NH4+-N+109.2，其相关参数列于表2，其线性相关系数R＞0.99，线性范围为0.025μmol/L～0.300μmol/L。

4次空白平行的测定信号为99.581±0.081（反应15min）.以三倍空白标准偏差除以工作曲线斜率，得到检测限为0.00029μmol/L。对0.100μmol/L的铵氮标准溶液平行测定4次，结果为190.442±4.472（反应15min），RSD为2.35%。

2.6.2与OPA试剂的灵敏度

为了比较以MOPA为荧光试剂的MOPA法与以OPA为荧光试剂所建立方法（OPA法）的灵敏度差异，在相同的仪器测定条件下，0～1.2μmol/L范围内配制不同铵氮浓度的工作液，按文献最优条件(余翔翔,郭卫东,2007.海水中低含量铵氮的高灵敏度荧光法测定.海洋科学31(4),37-41)，反应15min，在λ_ex=361nm，λ_em=425nm，测OPA法的工作曲线，结果见表2。

表2MOPA法和OPA法工作曲线及其斜率比（反应15min）

表2中数据表明，相同的反应条件下，MOPA法和OPA法工作曲线斜率比为6.5，说明MOPA法的灵敏度明显高于OPA法。用MOPA作为超痕量铵氮测定的新荧光试剂，相比OPA有明显优势。

2.7方法的基底加标回收率

以采自南海的海水为基底，考察基底加标回收率，结果见表3。

表3MOPA法测海水中铵氮的基底加标回收率

结果表明，基底加标回收介于90～110%之间，说明以MOPA法测定海水中铵氮，基底无干扰。本方法可用于海水中超痕量铵氮的测定。

3小结

（1）MOPA与铵氮能在室温条件下快速反应，反应液的最大激发波长λex=370nm，最大发射波长λem=454nm，以MOPA为荧光试剂测定超痕量铵氮，可避免超纯水中背景荧光峰的干扰。

（2）相同反应条件下，以MOPA为荧光试剂时，工作曲线斜率是以OPA为荧光试剂的6.5倍，即MOPA法测海水超痕量铵氮灵敏度明显高于OPA法。本发明所建立的方法检测限为0.00029μmol/L，优于OPA法。

（3）以MOPA为荧光试剂测定海水中铵氮的基底加标回收率介于90%～110%之间，海水基底对铵氮测定无干扰。

附图说明

图1为MOPA与铵氮

荧光反应产物的激发光谱和荧光光谱曲线(室温反应，约20℃)，其中1为激发光谱曲线，2为荧光光谱曲线。

图2为a，b，c，d，e，f六种溶液的荧光光谱曲线，其中a，b，c，d，e，f六种溶液的具体配方如下：

a:超纯水；

c:0.2mL 7.8g/L MOPA；

d:10mL 0.2μmol/L铵氮+0.2mL 7.8g/L MOPA+0.5mL 1.26g/L Na₂SO₃溶液；

f:10mL 0.2μmol/L铵氮+0.2mL 7.8g/L MOPA+0.70mL 0.034MNaOH+0.70mL 300g/L柠檬酸钠溶液+0.5mL 1.26g/L Na₂SO₃溶液（pH=11.4）；

图3为固定柠檬酸钠、亚硫酸钠和氢氧化钠的用量时，MOPA用量对荧光强度的影响的关系曲线图(

0.2μmol/L铵氮溶液，

空白溶液)；

图4为图3中扣除相应空白获得的DI_F与MOPA用量的关系曲线图；

图5为固定柠檬酸钠、MOPA和亚硫酸钠的用量时，pH对反应液荧光强度的影响的关系曲线图(

0.2μmol/L铵氮溶液，空白溶液)；

图6为图5中扣除相应空白获得的DI_F与pH的关系曲线图；

图7为固定柠檬酸钠、MOPA和氢氧化钠的用量时，亚硫酸钠用量对空白和0.200μmol/L铵氮工作液荧光强度的影响的关系曲线图(

0.2μmol/L铵氮溶液，

空白溶液)；

图8为图7中扣除相应空白获得的亚硫酸钠用量对DI_F的影响的关系曲线图；

图9为反应液的荧光强度与反应时间的关系曲线图；

图10为不同浓度铵氮工作液的荧光曲线图(反应15min)，其中，h：空白；i：0.025μmol/L铵氮工作液；j：0.050μmol/L铵氮工作液；k：0.100μmol/L铵氮工作液；l：0.200μmol/L铵氮工作液；m：0.300μmol/L铵氮工作液。

具体实施方式

下面以具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。

实施例1

1)制作工作曲线：(如前2.6.1所述)

分别取10mL铵氮浓度为0μmol/L、0.0625μmol/L、0.100μmol/L、0.200μmol/L、0.250μmol/L、0.300μmol/L的铵氮工作液，每份铵氮工作液分别依次加入0.70mL 300g/L的柠檬酸钠溶液、0.2mL的7.76g/L MOPA溶液（反应液中MOPA浓度为0.12g/L）、0.5mL 1.26g/L Na₂SO₃溶液(反应液中亚硫酸钠浓度为0.051g/L)、一定浓度的NaOH溶液调节体系的pH约为11.4；室温条件下反应15min后，用RF-5301PC型荧光分光光度计(测定时激发和发射狭缝宽度均设置为5nm)在λ_ex=370nm，测定390～550nm范围内的荧光曲线，记录每份铵氮工作液最大发射波长（454nm）处的荧光强度（I_F），作出铵氮浓度与最大发射波长处的荧光强度的工作曲线：I_F=915.7C_NH4+-N+112.1(R=0.9946)；

2)将2个取自南海北部的样品各10mL，分别编号为1#、2#，每个样品分别依次加入0.70mL 300g/L的柠檬酸钠溶液、0.2mL的7.76g/L MOPA溶液（反应液中MOPA浓度为0.12g/L）、0.5mL 1.26g/L Na₂SO₃溶液(反应液中亚硫酸钠浓度为0.051g/L)、一定浓度的NaOH溶液调节体系的pH约为11.4；室温条件下反应15min后，用RF-5301PC型荧光分光光度计(测定时激发和发射狭缝宽度均设置为5nm)在λ_ex=370nm，测定390～550nm范围内的荧光曲线，记录每份样品的最大发射波长（454nm）处的荧光强度（I_F），1#号样品平行3次测定荧光峰值分别为：222.366，235.127，227.689，平均值为228.394±6.41，根据工作曲线求得1#样品中的铵氮含量为0.127±0.007μmoL/L（n=3）；2#号样品平行3次测定荧光峰值分别为：222.366，235.127，227.689，平均值为346.519±10.735，2#样品中的铵氮含量为0.256±0.012μmol/L（n=3）。

为说明本发明所述方法的准确性，申请人在步骤2）样品测定的同一天，采用OPA法测定2#样品，测定步骤同文献所述(余翔翔,郭卫东,2007.海水中低含量铵氮的高灵敏度荧光法测定.海洋科学31(4),37-41)，测定结果为0.242±0.20μmol/L（n=3）。采用t统计学检验方法，检验OPA法测定结果和本专利提出的方法MOPA法测定结果的差异，统计检验结果P＜0.05，说明两者无显著性差异。可见，本发明所述方法测定海水中超痕量铵氮是准确可靠的。而1#样品由于浓度较低，OPA法难以准确测定。

Claims

1.4-甲氧基邻苯二甲醛在海水中铵氮检测中作为荧光试剂的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：4-甲氧基邻苯二甲醛在海水中超痕量铵氮检测中作为荧光试剂的应用。

3.一种测定海水中超痕量铵氮的方法，其特征在于包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的测定海水中超痕量铵氮的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

5.根据权利要求3或4所述的测定海水中超痕量铵氮的方法，其特征在于：步骤1)和步骤2)中，控制反应液中4-甲氧基邻苯二甲醛的浓度为0.060～0.120g/L。

6.根据权利要求3或4所述的测定海水中超痕量铵氮的方法，其特征在于：步骤1)和步骤2)中，所述的最大发射波长为454nm。

7.根据权利要求3或4所述的测定海水中超痕量铵氮的方法，其特征在于：海水中超痕量铵氮的检测限为0.00029μmol/L。