CN108840869A - 一种从吴茱萸中分离纯化去氢吴茱萸碱的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从芸香科植物吴茱萸中分离纯化去氢吴茱萸碱的方法，将吴茱萸果实用石油醚浸泡脱脂，然后以2％HCl为溶剂用回流提取法进行提取，收集提取液后减压浓缩或冷冻干燥得到浸膏A，将浸膏A用甲醇溶解，过滤，滤液减压浓缩或冷冻干燥得到浸膏B，浸膏B以聚酰胺树脂为填料，水‑乙醇进行洗脱，分段收集半成品，减压浓缩或冷冻干燥得固体半成品，将其以乙醇‑丙酮为溶剂进行重结晶得到纯度为98.5％以上去氢吴茱萸碱粉末结晶。该方法制备的去氢吴茱萸碱得率高，成本低，操作简单，对环境友好，适用于大规模的工业化生产。

Description

一种从吴茱萸中分离纯化去氢吴茱萸碱的方法
技术领域
本发明涉及一种中药活性成分的制备方法，具体是一种从芸香科植物吴茱萸(Euodia rutaecarpa)中分离纯化去氢吴茱萸碱的方法。
背景技术
去氢吴茱萸碱(Dehydroevodiamine)是一种生物碱类化合物，主要存在于芸香科(Rutaceae)植物吴茱萸的果实中，为该植物的特征性成分。去氢吴茱萸碱极性中等，易溶于水和有机溶剂，熔点216-218℃，分子式C19H15N3O，分子量301.34。
去氢吴茱萸碱是从芸香科植物吴茱萸中分离出的一种有较高药理活性的生物碱类化合物，具有抗炎、止呕、扩张血管、减慢心率、降血压、神经保护等多种药理活性(吴茱萸药理作用及其物质基础研究概况[J].中华中医药学刊,2011,29(11):2415-2417；Investigation into the stability and reactivity of the pentacyclic alkaloiddehydroevodiamine and the benz-analog thereof[J].Tetrahedron,2016,72:2535-2543.)。去氢吴茱萸碱的分离纯化主要采用硅胶柱层析法和大孔树脂分离纯化法(吴茱萸化学成分的研究[J].中国中药杂志,2009,34(06):792-794；吴茱萸水提取物化学成分研究[J].中国实验方剂学杂志,2016,22(08):58-64；去氢吴茱萸碱的制备方法及其抗农业病原菌的用途，中国专利，CN 106892919A.)，由于去氢吴茱萸碱同时易溶于水和有机溶剂，导致此前的提取方法具有损失大、得率低、操作繁琐费时、所用溶剂对环境不友好，不适合大规模制备等缺点。因此很有必要找到一种简单、高效、经济、环保的分离纯化方法，为去氢吴茱萸碱的进一步研究开发提供合格的化合物纯品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从芸香科植物吴茱萸中分离纯化去氢吴茱萸碱的方法。本方法简单、快速、环保、经济，具有良好的市场开发前景。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：从吴茱萸中分离纯化去氢吴茱萸碱的方法，具体步骤为：
(1)原料：干燥近成熟的吴茱萸果实为原料；
(2)酸水提：将吴茱萸果实按液料比5-10倍量加入石油醚溶剂，放置5-15小时，沥干石油醚，以5-10倍量2％HCl为溶剂用回流提取法进行提取，收集提取液后减压浓缩或冷冻干燥得到浸膏A。
(3)醇溶去杂：浸膏A加入甲醇溶解，滤过，滤液减压浓缩或冷冻干燥得到浸膏B。
(4)色谱柱层析：将浸膏B以5-35％乙醇溶解(与洗脱剂相匹配)，湿法上样后进行常压色谱柱层析，其中柱层析填料为聚酰胺树脂，粒度为30-60目；色谱柱规格根据分离量而定，直径为5-15cm；以5-35％乙醇为洗脱剂，分段收集半成品，将半成品减压浓缩或冷冻干燥，得固体半成品。
(5)聚酰胺树脂的再生：使用过的聚酰胺树脂，分别用100％乙醇、2％NaOH和2％醋酸冲洗3-5个柱体积，以便重复利用。
(6)重结晶：将步骤(3)所得的固体半成品，以乙醇：丙酮比例为1:1作为溶剂进行重结晶。
(7)化合物定性和纯度检测：采用去氢吴茱萸碱对照品(购自上海源叶生物科技有限公司，批号B21028)进行定性，在不同的HPLC色谱条件下，二者的保留时间和UV光谱图均一致(如图1所示)，因此确认该化合物为去氢吴茱萸碱；使用HPLC归一化法进行纯度检测，纯度结果大于98.5％(如表1所示)。
作为本发明进一步的方案：步骤(1)中直接以吴茱萸果实为原料。
作为本发明进一步的方案：步骤(2)中以10倍量石油醚，静置10h为优选。
作为本发明进一步的方案：步骤(3)中湿法上样优选5％乙醇为溶解剂。
作为本发明进一步的方案：步骤(3)中优选5％乙醇为洗脱剂进行洗脱。
作为本发明进一步的方案：步骤(5)以乙醇-丙酮(1:1)为重结晶溶剂。
本发明的优点在于：
1.工艺流程简单，操作简便，耗时短，得率高，成本低，易于大规模制备。聚酰胺树脂虽然粒度小(30-60目)，但流动相流速快，分离时间短。在层析柱中，去氢吴茱萸碱呈浅黄色带，方便跟踪收集。
2.具有较高的学术价值。在提取环节，文献方式均为醇提、水提或酸碱提取，效率低，杂质多。在分离纯化环节，文献基本采用硅胶柱层析法和大孔树脂分离纯化法，柱压大，耗时长。本发明根据去氢吴茱萸碱的化学特性，在提取、分离和纯化各步骤采用了不同于文献的溶剂、填料和工艺参数，体现了较好的学术探索价值。
3.经济、环保。整个分离纯化过程基本不涉及有毒有害溶剂，且石油醚、甲醇、乙醇的用量很少。聚酰胺树脂便宜易得，且可再生。
4.得率高。去氢吴茱萸碱极性中等，既溶于甲醇等有机溶剂，又易溶于水，所以文献方法中的提取、萃取、过滤等环节损失很大，得率很低。本发明采用酸水一步提取到位，减少了其他环节的损失，获得了比文献高很多的得率。
5.纯度高。从吴茱萸中提取分离去氢吴茱萸碱的杂质主要包括弱极性的其他生物碱和极性中等的黄酮苷类化合物。本发明在脱脂(石油醚浸泡)环节已去除大多数弱极性化合物。聚酰胺树脂对去氢吴茱萸碱的色谱保留适中，对黄酮类化合物有较强保留，因此得以分离。
附图说明
图1为去氢吴茱萸碱对照品(A)与本发明制备得到的产品(B)的HPLC典型色谱图和UV光谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
一种从吴茱萸果实中分离纯化去氢吴茱萸碱的方法，具体步骤为：
(1)原料：取干燥近成熟的吴茱萸果实5g；
(2)酸水提：将5g吴茱萸果实按加入10倍量石油醚，放置10小时，沥干石油醚，然后加入10倍量2％HCl用回流提取法进行提取，收集提取液后减压浓缩得到2.3g浸膏A，浸膏A加入甲醇溶解，过滤杂质，滤液减压浓缩得到0.7g浸膏B；
(3)色谱柱层析：将浸膏B以5％乙醇溶解湿法上样后进行常压色谱柱层析，其中柱层析填料为聚酰胺树脂，粒度为30-60目；色谱柱直径为5cm；以5％乙醇为洗脱剂，分段收集半成品，减压浓缩得固体半成品。
(4)重结晶：将固体半成品，以乙醇-丙酮为溶剂进行重结晶，得到13mg纯度大于98.5％的去氢吴茱萸碱晶体，得率为0.26％。
实施例2
一种从吴茱萸果实中分离纯化去氢吴茱萸碱的方法，具体步骤为：
(1)原料：取干燥近成熟的吴茱萸果实100g；
(2)酸水提：将100g吴茱萸果实加入5倍量石油醚，放置5小时，沥干石油醚，然后加入10倍量2％HCl用回流提取法进行提取，收集提取液后冷冻干燥得到40g浸膏A，浸膏A加入甲醇溶解，过滤杂质，滤液冷冻干燥得到16g浸膏B；
(3)色谱柱层析：将浸膏B以10％乙醇溶解，湿法上样后进行常压色谱柱层析，其中柱层析填料为聚酰胺树脂，粒度为30-60目；色谱柱直径为10cm；以10％乙醇为洗脱剂，分段收集半成品，冷冻干燥得固体半成品。
(4)重结晶：将固体半成品，以乙醇-丙酮为溶剂进行重结晶。得到240mg纯度大于98.5％的去氢吴茱萸碱晶体，得率为0.24％。
实施例3
一种从吴茱萸果实中分离纯化去氢吴茱萸碱的方法，具体步骤为：
(1)原料：取干燥近成熟的吴茱萸果实250g；
(2)酸水提：将250g吴茱萸果实加入8倍量石油醚，放置15小时，沥干石油醚，然后加入5倍量2％HCl用回流提取法进行提取，收集提取液后冷冻干燥得到98g浸膏A，浸膏A加入甲醇溶解，过滤杂质，滤液冷冻干燥得到37g浸膏B；
(3)色谱柱层析：将浸膏B以35％乙醇溶解，湿法上样后进行常压色谱柱层析，其中柱层析填料为聚酰胺树脂，粒度为30-60目；色谱柱直径为15cm；以35％乙醇为洗脱剂，分段收集半成品，冷冻干燥得固体半成品。
(4)重结晶：将固体半成品，以乙醇-丙酮为溶剂进行重结晶。得到551mg纯度大于98.5％的去氢吴茱萸碱晶体，得率为0.22％。
本发明化合物定性和纯度检测时，采用去氢吴茱萸碱对照品(购自上海源叶生物科技有限公司，批号B21028)进行定性，在不同的HPLC色谱条件下，二者的保留时间和UV光谱图均一致(如图1所示)，因此确认该化合物为去氢吴茱萸碱；使用HPLC归一化法进行纯度检测，纯度结果大于98.5％(如表1所示)
表1本发明所得去氢吴茱萸碱的峰面积归一化纯度测试(HPLC)结果示例
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下做出各种调整。

Claims (6)

1.一种从吴茱萸中分离纯化去氢吴茱萸碱的方法，其特征在于按如下工艺步骤进行：
(1)原料：以干燥近成熟的吴茱萸果实为原料；
(2)酸水提：将吴茱萸果实按液料比5-10倍量加入石油醚溶剂，放置5-15小时，沥干石油醚，以5-10倍量2％Hcl为溶剂用回流提取法进行提取，收集提取液后减压浓缩或冷冻干燥得到浸膏A；
(3)醇溶去杂：浸膏A加入甲醇溶解，滤过，滤液减压浓缩或冷冻干燥得到浸膏B；
(4)色谱柱层析：将浸膏B以5-35％乙醇溶解，湿法上样后进行常压色谱柱层析，其中柱层析填料为聚酰胺树脂，粒度为30-60目；色谱柱规格根据分离量而定，直径为5-15cm；以5-35％乙醇为洗脱剂，分段收集半成品，将半成品减压浓缩或冷冻干燥，得固体半成品；
(5)聚酰胺树脂的再生：使用过的聚酰胺树脂，分别用100％乙醇、2％NaOH和2％醋酸冲洗3-5个柱体积，以便重复利用；
(6)重结晶：将固体半成品，以乙醇-丙酮1:1为溶剂进行重结晶；
(7)纯度检测：使用HPLC归一化法进行纯度检测。
2.根据权利要求1所述的从吴茱萸中分离纯化去氢吴茱萸碱的方法，其特征在于，步骤(2)中直接用果实进行提取。
3.根据权利要求1所述的从吴茱萸中分离纯化去氢吴茱萸碱的方法，其特征在于，步骤(2)中将吴茱萸果实按液料比10倍量加入石油醚溶剂，放置10小时。
4.根据权利要求1所述的从吴茱萸中分离纯化去氢吴茱萸碱的方法，其特征在于，步骤(2)中采用酸水提取得到总提取物，继以步骤(3)醇溶去杂。
5.根据权利要求1所述的从吴茱萸中分离纯化去氢吴茱萸碱的方法，其特征在于，步骤(4)中以聚酰胺树脂为填料，以5-35％乙醇为洗脱剂。
6.根据权利要求1所述的从吴茱萸中分离纯化去氢吴茱萸碱的方法，其特征在于，步骤(6)中以乙醇-丙酮1:1作为重结晶溶剂。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN109232560A (zh) * 2018-10-11 2019-01-18 江苏省中国科学院植物研究所 瑞特西宁的制备方法及其抗农业病原菌的用途
CN115105510A (zh) * 2021-03-23 2022-09-27 李文洁 去氢吴茱萸碱的抗肿瘤新用途及其有效组分的制备方法

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