CN108752393B - 一种烟用天然多酚和类黄酮的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种烟用天然多酚和类黄酮的提取方法。所述提取方法是将干燥植物样品通过研磨机粉碎后，按照料液比1:15～1:25的比例加入无水乙醇浓度为65～75％，乙酸浓度为1～5％的混合提采用超声提取20～40min，并将上清液保存，沉淀重复提取后将两次上清液混合浓缩，并将浓缩液注入C18固相萃取硅胶柱中，先采用45℃热乙醇进行洗脱，得到多酚提取物，再用乙酸乙酯进行洗脱，得到类黄酮提取物，然后分别将两种物质浓缩或干燥至体积不在发生变化。本发明中的方法易操作、成本低、提取率高，实验过程相对安全，并能很好的应用到卷烟中，为天然多酚和类黄酮在烟用香料领域的应用提供了途径。
Description
技术领域
本发明属于天然香料提取领域，具体地说是一种烟用天然多酚和类黄酮的提取方法。
背景技术
多酚和类黄酮是天然植物次生代谢物，在自然界中广泛存在。多酚和类黄酮不仅对人类健康起到抗氧化、抗衰老，及预防心脑血管疾病等重要作用，而且在烟用香料领域可作为香气前体物质，一方面可以在高温下热解产生挥发性较强的物质，增加烟香，另一方面在燃吸时可以产生酸性反应，能中和部分碱性，使吃味醇和，能有效改善低次烟草的品质，补偿低焦油卷烟香气，提高卷烟抽吸品质。
文献报道中，天然多酚和类黄酮的提取方法常用的有浸泡提取法、震荡提取法、超临界流体萃取法等，存在处理时间长、效率低下、有机溶剂用量大，或操作复杂、成本高等问题；而超声波辅助溶剂萃取法利用超声波辐射压强产生的强烈空化应效应、机械振动、扰动效应、高的加速度、乳化、扩散、击碎和搅拌作用等多级效应，增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，从而加速目标成分进入溶剂，促进提取的进行。和常规的萃取技术相比，超声波辅助溶剂萃取法不仅更加快速、廉价和高效，而且安全性好，操作简单，具有广谱性，绝大多数天然植物成分均可借助超声萃取。但超声萃取时间不宜过长，否则会造成目标产物的降解，使提取物得率降低。
传统的天然植物中多酚和类黄酮的提取，大多所采用有机试剂如甲醇、乙醇、丙酮等，混以微量无机酸如盐酸、硝酸和磷酸来调节体系的PH。存在以下缺点：1、挥发性大、毒性高、操作危险性大；2、提取效率低，产物得率不高，不能充分利用天然植物香料资源；3、蒸发获得提取物的残留溶剂不在《烟草制品许可使用的添加剂名单》之内，故无法应用于烟用香料领域。
发明内容
本发明克服现有技术的不足，在溶剂的选择上符合《烟草制品许可使用的添加剂名单》的规定，提供了一种低毒性、易操作、成本低、效率高，并可应用于烟用香料领域的天然多酚和类黄酮提取方法。
本发明提供的技术方案：所述一种烟用天然多酚和类黄酮的提取方法，其特征在于具体包括如下步骤：
(1)取无水乙醇置于容器中，并加入冰醋酸，然后加入水稀释致使无水乙醇的浓度为65～75％，乙酸的浓度为1～5％，配制成提取溶液；
(2)取干燥植物样品，用研磨机粉碎，过10～40目筛；
(3)取步骤(2)中的植物样品粉末，并按照料液比1:15～1:25的比例加入步骤(1)中配制的提取溶液，并将其混合均匀后采用超声提取，其提取条件为：超声功率为360～420W，温度为40～60℃，提取时间为20～40min；
(4)将提取完成后的混合溶液以10000～14000rcf离心8-12min，并用移液枪吸取上清液保存备用；
(5)向步骤(4)中离心分离后的沉淀中重复加入步骤(1)中的提取液，其加入量与步骤(3)中加入比例相同，并混合均匀后在室温下静置2小时，收集上清液；
(6)将步骤(5)中收集的上清液与步骤(4)中收集的上清液混合后浓缩至原体积的1/20～1/10，并将浓缩液注入C18固相萃取硅胶柱中，先采用45℃热乙醇进行洗脱，得到多酚提取物，再用乙酸乙酯进行洗脱，得到类黄酮提取物；
(7)分别将两种提取物再通过旋转蒸发浓缩或氮气吹干的方式浓缩至体积不发生变化(一般在十五分钟内体积不发生变化便可停止浓缩)为止，得到多酚和类黄酮最终产物。
本发明较优的技术方案：所述步骤(1)中的提取溶液中乙醇的质量比为70％，乙酸的质量比为2％；其原料与提取溶液的料液比为1:20；超声提取的时间为30min、温度为40℃，超声功率为360W。
本发明较优的技术方案：所述步骤(3)中将植物粉末和提取溶液添加到离心管中，并使用涡旋仪将其混合均匀。
本发明较优的技术方案：所述步骤(5)中沉淀与提取的混合也是采用涡旋仪混匀。
本发明较优的技术方案：所述步骤(6)中的上清液浓缩具体是将上清液置于旋转蒸发仪中浓缩，设置压力为0.02MPa，温度从50℃根据溶剂蒸发情况逐渐升高至55℃，调整转速为30～60转/分钟，以溶剂蒸出来的速度约2～3滴/秒为易，浓缩至原体积的1/20～1/10。
本发明的有益效果：
(1)本发明避免了提取实验中常用的甲醇、丙酮、石油醚等强毒性有机溶剂，采用无水乙醇和冰醋酸作为提取溶剂，该溶剂具有安全性，符合《烟草制品许可使用的添加剂名单》，从而从根本上避免了天然提取物的毒性溶剂残留问题，确保提取物的安全性，能够很好的应用到卷烟，作为烟用提取物；
(2)本发明的提取溶剂中无水乙醇和冰醋酸的浓度是经过实验得出的最佳浓度，可以充分利用植物资源，确保了天然类黄酮和多酚的良好得率，降低了残留物；
(3)本发明采用超声提取，并采用特殊的超声条件，经过实验证明该超声条件下的黄酮和多酚提取率最高，时间短，效率高，操作简单，且不会对有效成分带来破坏，能够有效从最大程度上提取获得植物中的天然多酚和类黄酮。
(4)本发明全程采用低毒性有机溶剂，从提取过程采用的乙醇和冰醋酸，到浓缩后萃取用的乙酸乙酯，相比其他常用的毒性溶剂，可大大降低实验人员操作过程中微量吸入的危险性；
(5)本发明中的天然类黄酮和多酚提取物能够应用于卷烟中，在高温下热解产生挥发性较强的物质，增加烟香，并可以在燃吸时可以产生酸性反应，中和部分碱性，使吃味醇和，能有效改善低次烟草的品质，补偿低焦油卷烟香气，提高卷烟抽吸品质。
本发明中的方法易操作、成本低、提取率高，实验过程相对安全，且提取物溶剂残留符合《烟草制品许可使用的添加剂名单》，并能很好的应用到卷烟中，为天然多酚和类黄酮在烟用香料领域的应用提供了途径。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1.一种烟用多酚和类黄酮的提取方法，是以神农香菊为原料进行提取，其具体提取步骤如下：
(1)取干燥的神农香菊，并用研磨机粉碎，过20目筛，称取1g至于离心管中；
(2)采用乙醇、冰醋酸和水混合配制成乙醇浓度为70％、冰醋酸浓度为2％的混合提取液，并向离心管中加入30mL提取液，用涡旋仪使干料和溶液体系充分混匀；
(3)将步骤(2)中的混合液进行超声提取，并设置超声功率为360W，温度为54℃，提取20min后，将离心管以12000rcf的速度离心10min，并用移液枪吸取上清液保存备用，并收集沉淀；
(4)向沉淀中重复加入30mL的步骤(2)中配制的提取溶液，用涡旋仪充分混匀，室温下静置2小时，收集上清液；
(5)将步骤(3)和步骤(4)中两次收集的上清液混合后置于50℃旋转蒸发仪中，设置压力为0.02MPa，温度从50℃根据溶剂蒸发情况逐渐升高至55℃，调整转速为50转/分钟，以溶剂蒸出来的速度约2～3滴/秒为易，浓缩至原体积的1/20；
(6)取步骤(5)中的浓缩液注入C18固相萃取硅胶柱中，先用45℃热乙醇进行洗脱，得到多酚提取物，经检测再用乙酸乙酯进行洗脱，得到类黄酮提取物；
(7)分别将两种提取物通过旋转蒸发浓缩蒸干，在浓缩过程中观察样品体积在15分钟内不再减少，便终止浓缩，经检测，得到多酚产品12.74mg，类黄酮产品4.24mg。
实施例2.一种烟用多酚和类黄酮的提取方法，是以款冬花为原料进行提取，其具体提取步骤如下：
(1)取干燥的款冬花，并用研磨机粉碎，过40目筛，称取1.5g至于离心管中；
(2)采用乙醇、冰醋酸和水混合配制成乙醇浓度为70％、冰醋酸浓度为2％的混合提取液，并向离心管中加入45mL提取液，用涡旋仪使干料和溶液体系充分混匀；
(3)将步骤(2)中的混合液进行超声提取，并设置超声功率为400W，温度为60℃，提取30min后，将离心管以14000rcf的速度离心12min，并用移液枪吸取上清液保存备用，并收集沉淀；
(4)向沉淀中重复加入45mL的步骤(2)中配制的提取溶液，用涡旋仪充分混匀，室温下静置2小时，收集上清液；
(5)将步骤(3)和步骤(4)中两次收集的上清液混合后置于50℃旋转蒸发仪中，设置压力为0.02MPa，温度从50℃根据溶剂蒸发情况逐渐升高至55℃，调整转速为50转/分钟，以溶剂蒸出来的速度约2～3滴/秒为易，浓缩至原体积的1/10；
(6)取步骤(5)中的浓缩液注入C18固相萃取硅胶柱中，先用45℃热乙醇进行洗脱，得到多酚提取物，经检测再用乙酸乙酯进行洗脱，得到类黄酮提取物；
(7)分别将两种提取物通过旋转蒸发浓缩蒸干，在浓缩过程中观察样品体积在15分钟内不再减少，便终止浓缩，经检测，得到多酚产品35.85mg，类黄酮产品3.66mg。
实施例3，一种烟用多酚和类黄酮的提取方法，是以万寿菊为原料进行提取，其具体提取步骤如下：
(1)取干燥的万寿菊花瓣，并用研磨机粉碎，过30目筛，称取2g至于离心管中；
(2)向采用乙醇、冰醋酸和水混合配制成乙醇浓度为70％、冰醋酸浓度为2％的混合提取液，并向离心管中加入47.2mL提取液，用涡旋仪使干料和溶液体系充分混匀；
(3)将步骤(2)中的混合液后进行超声提取，并设置超声功率为410W，温度为60℃，提取40min后，将离心管以10000rcf的速度离心10min，并用移液枪吸取上清液保存备用，并收集沉淀；
(4)向沉淀中重复加入47.2mL的步骤(2)中配制的提取溶液，用涡旋仪充分混匀，室温下静置2小时，收集上清液；
(5)将步骤(3)和步骤(4)中两次收集的上清液混合后置于50℃旋转蒸发仪中，设置压力为0.02MPa，温度从50℃根据溶剂蒸发情况逐渐升高至55℃，调整转速为50转/分钟，以溶剂蒸出来的速度约2～3滴/秒为易，浓缩至原体积的1/15；
(6)取步骤(5)中的浓缩液注入C18固相萃取硅胶柱中，先用45℃热乙醇进行洗脱，得到多酚提取物，经检测再用乙酸乙酯进行洗脱，得到类黄酮提取物；
(7)分别将两种提取物通过旋转蒸发浓缩蒸干，在浓缩过程中观察样品体积在15分钟内不再减少，便终止浓缩,经检测，得到多酚产品54.41mg，类黄酮产品41.34mg。
对比实验1：本申请发明人针对不同提取溶剂对实施例1中的实验样品进行提取，其具体实验如下，分别用浓度70％的乙醇、乙酸、乙醇和乙酸的混合物，70％乙醇+10％乙酸、70％乙醇+5％乙酸，以及文献中较为常用的70％甲醇和70％丙酮对神农香菊进行提取，其具体提取条件为：料液比1:20,超声时间30mmin,温度40℃,超声功率360W，并将各种不同溶剂的提取产物得率进行对比，其对比结果如表1所示：
表1不同提取溶液下多酚和类黄酮得率对比
如表1所示，乙醇与乙酸的混合溶液提取效果明显优于乙醇和乙酸的单一溶剂，且该溶液组合对多酚和类黄酮的提取效果高于文献中常用的70％甲醇，70％丙酮虽然可获得与70％乙醇+2％乙酸近似的提取物得率，但从溶剂的安全性和烟用香料的限制方面考虑，乙醇与乙酸比丙酮更加安全。
对比实验2：本申请发明人针对乙醇和乙酸的浓度对类黄酮和多酚提取物得率影响进行实验研究，采用不同浓度的乙醇和乙酸混合溶剂，在料液比和超声条件相同的情况下采用本发明中的方法对神农香菊进行提取，其具体条件为料液比1:20,超声条件为：时间30mmin,温度40℃,功率360W；并针对不同浓度提取溶剂的提取产物得率进行对比，其对比结果如表2所示：
表2不同浓度的乙醇和乙酸混合提取液多酚和类黄酮得率对比
| 溶剂 | 多酚得率平均值(mg/g DW) | 类黄酮得率平均值(mg/g DW) |
| 30％乙醇+2％乙酸 | 6.98 | 1.32 |
| 30％乙醇+5％乙酸 | 6.90 | 1.21 |
| 30％乙醇+10％乙酸 | 8.04 | 0.85 |
| 50％乙醇+2％乙酸 | 7.30 | 2.89 |
| 50％乙醇+5％乙酸 | 9.15 | 2.13 |
| 50％乙醇+10％乙酸 | 10.60 | 2.06 |
| 60％乙醇+2％乙酸 | 8.73 | 2.92 |
| 60％乙醇+5％乙酸 | 8.89 | 2.87 |
| 60％乙醇+10％乙酸 | 9.32 | 2.10 |
| 65％乙醇+2％乙酸 | 10.56 | 3.32 |
| 65％乙醇+5％乙酸 | 10.12 | 3.03 |
| 65％乙醇+10％乙酸 | 9.29 | 2.76 |
| 70％乙醇+2％乙酸 | 10.83 | 3.51 |
| 70％乙醇+5％乙酸 | 8.52 | 3.39 |
| 70％乙醇+10％乙酸 | 8.52 | 2.94 |
| 75％乙醇+2％乙酸 | 10.05 | 3.19 |
| 75％乙醇+5％乙酸 | 9.21 | 2.89 |
| 75％乙醇+10％乙酸 | 8.87 | 2.70 |
如表2所示，当乙醇浓度大于65％，乙酸浓度小于5％时，类黄酮和多酚的得率都比较高，其乙醇浓度太低、以及乙酸浓度太高其提取效果均不好，其最佳配比为70％乙醇+2％乙酸。
对比实验3：本申请发明人针对提取液与提取原料的料液比对类黄酮和多酚提取物得率影响进行了实验研究，在提取溶剂相同和提取条件相同的情况下，采用本发明中方法在不同料液比的情况下针对神农香菊进行提取，提取溶剂：70％乙醇+2％乙酸，提取条件：时间30min,温度40℃,超声功率360W，其对比结果如表3所示：
表3不同料液比下类黄酮和多酚提取物得率
从表3可以看出料液比为1：10-1:20的情况下多酚的提取率较高，料液比在1：20-1:30的条件下类黄酮提取率较高，在料液比为1:20时，两者的提取率均为最佳。
对比实验4：本申请发明人针对提取时间对类黄酮和多酚提取物得率影响进行了实验研究，在提取溶剂相同、料液比相同、提取温度和超声功率相同的情况下，采用本发明中方法在不同料液比的情况下针对神农香菊进行提取，提取溶剂：70％乙醇+2％乙酸，提取条件：料液比1:20,温度40℃,超声功率360W，其对比结果如表3所示：
表4不同提取时间下多酚和类黄酮提取物得率
| 提取时间 | 多酚得率平均值(g/100g DW) | 类黄酮得率平均值(g/100g DW) |
| 20min | 10.14 | 2.52 |
| 30min | 10.83 | 3.51 |
| 40min | 10.40 | 2.74 |
| 50min | 10.27 | 2.72 |
| 60min | 9.79 | 3.04 |
从表4可以当提取时间超过三十分钟后，其多酚和类黄酮含量开始降低，其最佳提取时间为30分钟。
对比实验5：本申请发明人针对提取温度对类黄酮和多酚提取物得率影响进行了实验研究，在提取溶剂相同、料液比相同、提取时间和超声功率相同的情况下，采用本发明中方法在不同料液比的情况下针对神农香菊进行提取，提取溶剂：70％乙醇+2％乙酸，提取条件：料液比1:20,时间30min,超声功率360W，其对比结果如表3所示：
表5不同提取温度下类黄酮和多酚提取物得率
| 提取温度 | 多酚得率平均值(g/100g DW) | 类黄酮得率平均值(g/100g DW) |
| 30℃ | 5.97 | 3.18 |
| 40℃ | 10.83 | 3.51 |
| 50℃ | 10.58 | 4.01 |
| 60℃ | 9.36 | 4.07 |
| 70℃ | 9.38 | 4.38 |
从表5可以当提取时间到40℃时，两者的提取率都开始大幅度上升，其随着温度的上升，多酚的得率反而小幅度下降，由于温度太高会对成分进行破坏，所以最佳温度为40℃。
Claims (3)
1.一种烟用天然多酚和类黄酮的提取方法，其特征在于具体包括如下步骤：
（1）取无水乙醇置于容器中，并加入冰醋酸，然后加入水稀释致使无水乙醇的浓度为70%，乙酸的浓度为2%，配制成提取溶液；
（2）取神农香菊干燥样品，用研磨机粉碎，过20目筛；
（3）取步骤（2）中的神农香菊干燥样品粉末，并按照料液比1:20的比例加入步骤（1）中配制的提取溶液，并将其混合均匀后采用超声提取，其提取条件为：超声功率为360W，温度为40℃，提取时间为30min；
（4）将提取完成后的混合溶液以10000～14000rcf离心8-12min，并用移液枪吸取上清液保存备用；
（5）向步骤（4）中离心分离后的沉淀中重复加入步骤（1）中的提取液，其加入量与步骤（3）中加入比例相同，并混合均匀后在室温下静置2小时，收集上清液；
（6）将步骤（5）中收集的上清液与步骤（4）中收集的上清液混合后置于旋转蒸发仪中浓缩，设置压力为0.02MPa，温度从50℃根据溶剂沸腾情况逐渐升高至55℃，调整转速为50转/分钟，以溶剂蒸出来的速度约2～3滴/秒为宜 ，浓缩至原体积的1/20，并将浓缩液注入C18固相萃取硅胶柱中，先采用45℃热乙醇进行洗脱，得到多酚提取物，再用乙酸乙酯进行洗脱，得到类黄酮提取物；
（7）分别将两种提取物再通过旋转蒸发浓缩或氮气吹干的方式浓缩至体积在15分钟内不再减少，得到多酚和类黄酮最终产物。
2.根据权利要求1所述的一种烟用天然多酚和类黄酮的提取方法，其特征在于：所述步骤（3）中将植物粉末和提取溶液添加到离心管中，并使用涡旋仪将其混合均匀。
3.根据权利要求1所述的一种烟用天然多酚和类黄酮的提取方法，其特征在于：所述步骤（5）中沉淀与提取的混合也是采用涡旋仪混匀。
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