CN108743568A - 用于降低气道高反应性的抗ngf抗体缓释微球及制备方法 - Google Patents

用于降低气道高反应性的抗ngf抗体缓释微球及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于降低气道高反应性的抗NGF抗体缓释微球及制备方法，所述抗NGF抗体药物制备成缓释微球，采用雾化吸入的方式用于治疗哮喘降低气道高反应性。本申请首次采用雾化吸入抗NGF抗体微球调控来减轻气道炎症和气道高反应性等，延缓甚至逆转哮喘疾病进程；雾化吸入抗NGF抗体缓释微球既可达到减轻气道损伤，又不影响甚至促进气道修复的作用；与全身系统性的抗NGF抑制策略不同，通过雾化微球方式将抗NGF缓释微球引导至哮喘气道粘膜及内皮下暴露的神经末梢受损的局部病灶，具有靶向性强、高效、安全和不影响宿主全身免疫功能等优点，采用雾化吸入与抗NGF微球联合治疗更具优势。

Description

用于降低气道高反应性的抗NGF抗体缓释微球及制备方法
技术领域
本发明涉及药品制备领域，特别是涉及一种用于降低气道高反应性的抗NGF抗体缓释微球及制备方法。
背景技术
神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是一种对神经细胞生长、分化起营养作用的神经肽类。它由α、β、γ3种肽链，按α2βγ2的比例构成的以共价键结合的多聚体及2个锌酯结构构成。哮喘是一种慢性支气管气道炎症性疾病，目前还没有抗NGF抗体药物在抑制支气管气道高反应性的制备方法方向的相关报道。
以上背景技术内容的公开仅用于辅助理解本发明的发明构思及技术方案，其并不必然属于本申请的现有技术，在没有明确的证据表明上述内容在本专利申请的申请日已经公开的情况下，上述背景技术不应当用于评价本申请的新颖性和创造性。
发明内容
本发明目的在于提出一种用于降低气道高反应性的抗NGF抗体缓释微球及制备方法，以填补抗NGF抗体缓释微球药物用于哮喘降低气道高反应性的技术空白。
为此，本发明提出一种用于降低气道高反应性的抗NGF抗体缓释微球及制备方法，具体的技术方案如下：
一种用于降低气道高反应性的抗NGF抗体缓释微球，所述抗NGF抗体药物制备成缓释微球，采用雾化吸入的方式用于治疗哮喘降低气道高反应性。
优选地，所述的用于降低气道高反应性的抗NGF抗体缓释微球，所述抗NGF抗体药物缓释微球采用微米级聚乳酸、羟基乙酸的微球作为药物的载体。
一种所述的用于降低气道高反应性的抗NGF抗体缓释微球的制备方法，包括将抗NGF抗体微粉化、抗NGF抗体微囊化；所述抗NGF抗体微粉化，将抗NGF抗体溶液溶于牛血清蛋白溶液，并按照质量比0.4-1:1的比例混合，混合液经冻干制得抗NGF粉；所述抗NGF抗体微囊化，采用乳化-溶剂挥发法，依次利用聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙烯醇、二氯甲烷、去离子水10％氯化钠溶液处理，制得抗NGF抗体缓释微球。
优选地，所述的用于降低气道高反应性的抗NGF抗体缓释微球的制备方法，所述牛血清蛋白溶液的浓度为0.5mg/mL～1.0mg/mL，所述抗NGF抗体溶液的浓度为2mL/kg～8mL/kg，制备NGF抗体微粉；所述的冻干条件为-20℃～-30℃冷冻3小时；20℃干燥12h处理。
更优选地，所述的用于降低气道高反应性的抗NGF抗体缓释微球的制备方法，所述抗NGF抗体微囊化的制备步骤包括：
S1：将聚乳酸、羟基乙酸按照重量比为1:2～5的比例进行混合，制备成聚乳酸；
S2：将10mg～20mg NGF抗体微粉与300mg聚乳酸混合，溶解在1～3mL的二氯甲烷中形成油相；
S3：配置2％的聚乙烯醇溶液8～15mL，加入到油相中，高速搅拌20～60s，形成S/O/W型复乳液；
S4：用去离子水配置10％氯化钠溶液，将复乳液转移到400～500mL 10％氯化钠溶液中，进行磁搅拌，挥发残余有机溶剂，收集微球，用50～100mL去离子水洗涤三次，真空度为-0.05～-0.09MPa，温度为-20～-5℃真空冷冻干燥12h，得到抗NGF抗体微球。
更优选地，所述的用于降低气道高反应性的抗NGF抗体缓释微球的制备方法，所述抗NGF抗体微囊化的制备步骤包括：
S1：将聚乳酸、羟基乙酸按照重量比为1:3～4的比例进行混合，制备成聚乳酸；
S2：将12mg～17mg NGF抗体微粉与300mg聚乳酸混合，溶解在2mL的二氯甲烷中形成油相；
S3：配置2％的聚乙烯醇溶液10～13mL，加入到油相中，高速搅拌30～40S，形成S/O/W型复乳液；
S4：用去离子水配置10％氯化钠溶液，将复乳液转移到420～480mL 10％氯化钠溶液中，进行磁搅拌，挥发残余有机溶剂，收集微球，用60～80mL去离子水洗涤三次，真空度为-0.07～-0.08MPa，温度为-15～-10℃真空冷冻干燥12h，得到抗NGF抗体微球。
进一步优选地，所述的用于降低气道高反应性的抗NGF抗体缓释微球的制备方法，所述磁搅拌为先1700r/min搅拌2h，-20～-5℃冰浴0.5h，然后800r/min磁力搅拌2h。
进一步优选地，所述的用于降低气道高反应性的抗NGF抗体缓释微球的制备方法，所述的缓释微球的的粒径4.8±0.5μm。
所述的用于降低气道高反应性的抗NGF抗体缓释微球的应用，所述缓释微球用于治疗哮喘降低气道高反应性。
药物作用基本原理：雾化吸入抗NGF抗体微球干预后，该微球沉着在受损的支气管粘膜表面上，缓慢释放抗NGF抗体从而抑制支气管粘膜下的神经末梢的生长、减少神经反射的发生及表面的炎性细胞所产生的NGF及NGF mRNA的生物活性，抑制肺内NGF的表达，从而达到有效抑制肺内炎症因子TGF-β1的合成和分泌，显著抑制哮喘气道高反应性及气道炎症，减轻支气管哮喘的气道高反应、敏感性和减少气道炎症介质释放，达到平喘效果。
本发明在抗NGF抗体的基础上，经深入研究作出了的重大创新，与现有技术相比，主要体现在以下几方面：
(1)本发明首次采用雾化吸入抗NGF抗体微球调控来减轻气道炎症和气道高反应性等，延缓甚至逆转哮喘疾病进程；
(2)本发明制备的抗NGF抗体缓释微球的粒径为4.8±0.5μm，包封率达到86％，可实现最长释放时间达80余天；
(3)雾化吸入抗NGF抗体缓释微球既可达到减轻气道损伤，又不影响甚至促进气道修复的作用；
(4)与全身系统性的抗NGF抑制策略不同，通过雾化微球方式将抗NGF缓释微球引导至哮喘气道粘膜及内皮下暴露的神经末梢受损的局部病灶，具有靶向性强、高效、安全和不影响宿主全身免疫功能等优点，采用雾化吸入与抗NGF微球联合治疗更具优势。
附图说明
图1：实施例1抗NGF抗体微球体外累积释放曲线图；图2：实施例1抗NGF微球电镜扫描图；图3：实施例1单个微球电镜放大图；图4：实施例1雾化吸入抗NGF微球气道内荧光显微共聚焦图；图5：实施例1雾化吸入微球48小时后气道内所见的抗NGF微球电镜扫描图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式并对照附图对本发明作进一步详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。
一、制作抗NGF抗体微球及雾化吸入干预
通过以下改进的聚合物合金法来制作抗NGF抗体微球：
实施例1
1、抗NGF抗体微粉化
配置牛血清蛋白溶液的浓度为0.5mg/mL，所述抗NGF抗体溶液的浓度为2mL/kg，将抗NGF抗体溶液300μg与0.5毫升的牛血清白蛋白溶液混合后进行冻干处置，冻干条件为-20℃冷冻3小时；20℃干燥12h处理。混合物冻干后取得均匀地分散在牛血清白蛋白基质中形成抗NGF抗体粉。
2、抗NGF微囊化
S1：将聚乳酸、羟基乙酸按照重量比为1:2的比例进行混合，制备成聚乳酸；
S2：将10mg NGF抗体微粉与300mg聚乳酸混合，溶解在1mL的二氯甲烷中形成油相；
S3：配置2％的聚乙烯醇溶液8mL，加入到油相中，高速搅拌20s，形成S/O/W型复乳液；
S4：用去离子水配置10％氯化钠溶液，将复乳液转移到400mL 10％氯化钠溶液中，进行磁搅拌，先1700r/min搅拌2h，-20℃冰浴0.5h，然后800r/min磁力搅拌2h，挥发残余有机溶剂，收集微球，用50mL去离子水洗涤三次，真空度为-0.05MPa，温度为-20℃真空冷冻干燥12h，得到抗NGF抗体微球，于4℃保存，用于后续实验。
检测抗NGF微球的形态和粒径。然后进行抗NGF微球包封率的测定，建立抗NGF微球的标准曲线，用萃取方法提取抗NGF微球中的抗NGF，抗NGF微球萃取率的测定，微球的体外释放试验，微球中的抗NGF抗体活性的检测。抗NGF抗体微球体外累积释放曲线见图1。
实施例2
1、抗NGF抗体微粉化
配置牛血清蛋白溶液的浓度为0.6mg/mL，所述抗NGF抗体溶液的浓度为4mL/kg，将抗NGF抗体溶液300μg与0.5毫升的牛血清白蛋白溶液混合后进行冻干处置，冻干条件为-30℃冷冻3小时；20℃干燥12h处理。混合物冻干后取得均匀地分散在牛血清白蛋白基质中形成抗NGF抗体粉。
2、抗NGF微囊化
S1：将聚乳酸、羟基乙酸按照重量比为1:5的比例进行混合，制备成聚乳酸；
S2：将20mg NGF抗体微粉与300mg聚乳酸混合，溶解在3mL的二氯甲烷中形成油相；
S3：配置2％的聚乙烯醇溶液15mL，加入到油相中，高速搅拌60s，形成S/O/W型复乳液；
S4：用去离子水配置10％氯化钠溶液，将复乳液转移到500mL 10％氯化钠溶液中，进行磁搅拌，先1700r/min搅拌2h，-5℃冰浴0.5h，然后800r/min磁力搅拌2h，挥发残余有机溶剂，收集微球，用100mL去离子水洗涤三次，真空度为-0.09MPa，温度为-5℃真空冷冻干燥12h，得到抗NGF抗体微球，于4℃保存，用于后续实验。
实施例3
1、抗NGF抗体微粉化
配置牛血清蛋白溶液的浓度为0.8mg/mL，所述抗NGF抗体溶液的浓度为6mL/kg，将抗NGF抗体溶液300μg与0.5毫升的牛血清白蛋白溶液混合后进行冻干处置，冻干条件为-20℃冷冻3小时；20℃干燥12h处理。混合物冻干后取得均匀地分散在牛血清白蛋白基质中形成抗NGF抗体粉。
2、抗NGF微囊化
S1：将聚乳酸、羟基乙酸按照重量比为1:3的比例进行混合，制备成聚乳酸；
S2：将12mgNGF抗体微粉与300mg聚乳酸混合，溶解在2mL的二氯甲烷中形成油相；
S3：配置2％的聚乙烯醇溶液10mL，加入到油相中，高速搅拌30S，形成S/O/W型复乳液；
S4：用去离子水配置10％氯化钠溶液，将复乳液转移到420mL 10％氯化钠溶液中，进行磁搅拌，先1700r/min搅拌2h，-20℃冰浴0.5h，然后800r/min磁力搅拌2h，挥发残余有机溶剂，收集微球，用60mL去离子水洗涤三次，真空度为-0.07MPa，温度为-15℃真空冷冻干燥12h，得到抗NGF抗体微球，于4℃保存，用于后续实验。
实施例4
1、抗NGF抗体微粉化
配置牛血清蛋白溶液的浓度为1.0mg/mL，所述抗NGF抗体溶液的浓度为8mL/kg，将抗NGF抗体溶液300μg与0.5毫升的牛血清白蛋白溶液混合后进行冻干处置，冻干条件为-30℃冷冻3小时；20℃干燥12h处理。混合物冻干后取得均匀地分散在牛血清白蛋白基质中形成抗NGF抗体粉。
2、抗NGF微囊化
S1：将聚乳酸、羟基乙酸按照重量比为1:4的比例进行混合，制备成聚乳酸；
S2：将17mg NGF抗体微粉与300mg聚乳酸混合，溶解在2mL的二氯甲烷中形成油相；
S3：配置2％的聚乙烯醇溶液13mL，加入到油相中，高速搅拌40S，形成S/O/W型复乳液；
S4：用去离子水配置10％氯化钠溶液，将复乳液转移到480mL 10％氯化钠溶液中，进行磁搅拌，先1700r/min搅拌2h，-5℃冰浴0.5h，然后800r/min磁力搅拌2h，挥发残余有机溶剂，收集微球，用80mL去离子水洗涤三次，真空度为-0.08MPa，温度为-10℃真空冷冻干燥12h，得到抗NGF抗体微球，于4℃保存，用于后续实验。
二、抗NGF抗体缓释微球的测定
1、检测抗NGF微球的形态和粒径
选取部分抗NGF微球将其平放在贴有双面胶的金属性平板上面，用喷金的方法制作成可用于电镜扫描的标本，用扫描电镜进行观察抗NGF微球的外形。将部分微球溶解在去离子水中，用测微尺在光学显微镜下面测定每个抗NGF微球的粒径，每隔5μm粒径为一单元，分别计数每一单元的微球数。以微球个数的百分数为纵坐标、粒径大小为横坐标，绘制微球粒径分布的直方图，测定微球的平均直径及粒径分布。
2、抗NGF微球包封率的测定
建立抗NGF微球的标准曲线：将这些标准品都稀释成为10、20、40、80、160、320pg/mL的抗NGF溶液，并且以空白的微球组的降解液做为空白对照，将吸光度调成零，并且绘制了标准曲线。
用萃取方法提取抗NGF微球中的抗NGF：选取10mg的抗NGF微球将其溶于0.5mL的乙酸乙酯中，然后在其中加入2mL的去离子水，再在振荡器里进行混匀，我们萃取了乙酸乙酯其中的抗NGF，将这重复做3次。
3、抗NGF微球萃取率的测定
选10mg不含的抗NGF的微球和标准品为抗NGF 1μg将两者溶于的0.5mL的乙酸乙酯中，其后在其中加入去离子水，用振荡器进行充分的混匀，静置，选取其下清液，并萃取乙酸乙酯中的抗NGF，这些重复做3次。采取ELISSA法在波长450nm下检测所得溶液的吸光度值，计算出抗NGF的含量，再算出其萃取率。
4、微球包封率的测定
首先将以上的萃取液进行稀释，采用ELISSA方法在波长450nm所测得的抗NGF的吸光度。并以空白微球降解液做为空白对照组，将以上数值代入其标准曲线后再乘以所稀释的倍数，然后除以萃取率，计算抗NGF微球中的含量，微球包封率均按照公式进行计算：
微球的包封率＝(微球所测定的抗NGF量/微球理论抗NGF量)×100％
5、微球的体外释放试验
称取3份50mg抗NGF微球分别均溶在磷酸盐缓冲液中，在37℃的温度下进行震荡温浴，我们分别于6h、12h、1d、4d、7d、14d、21d、30d、40d、50d、60d、70d、80d、90d的时候抽取出其中的稀释液，并相应补充的缓冲液，每个样品均按1:100和1:1000进行稀释，将每个浓度的稀释样品均做双复孔，采用ELISSA方法测定其抗NGF浓度，然后计算出每次释药量和累积释药率，最后绘制出体外释放曲线。
6、微球中的抗NGF抗体活性的检测
用体外释放实验收集的含有的抗NGF释放液进行体外抗NGF活性的检测。将已经长出突起的数个细胞在抗NGF因子作用的刺激下可抑制细胞长出突起，在随机选取的视野测量突触的数量和长度，阳性细胞为突触长度被抑制的细胞。结果显示微球中释放的抗NGF能够抑制细胞长出突起。培养基中未加入抗NGF或者加入抗NGF释放液又加入中和抗原的对照组中，细胞未见有突出抑制。
三、动物实验
采用雾化吸入抗NGF抗体缓释微球方式进行药物应用，以下为实施例1-5制备的缓释微球进行的动物实验：
实施例1：小鼠于第15天开始在一个密闭的自制雾化箱内进行雾化吸入抗NGF抗体微球(4mg/kg)，方式为超声雾化器进行雾化吸入治疗，雾化时间每次为30min，每隔一天执行1次，直至持续到第72天为止。
实施例2：小鼠于第7天开始在一个密闭的自制雾化箱内进行雾化吸入抗NGF抗体微球(4mg/kg)，方式为超声雾化器进行雾化吸入治疗，雾化时间每次为40min，每隔一天执行1次，直至持续到第68天为止。
实施例3：小鼠于第8天开始在一个密闭的自制雾化箱内进行雾化吸入抗NGF抗体微球(5mg/kg)，方式为超声雾化器进行雾化吸入治疗，雾化时间每次为40min，每隔一天执行1次，直至持续到第70天为止。
实施例4：小鼠于第9天开始在一个密闭的自制雾化箱内进行雾化吸入抗NGF抗体微球(6mg/kg)，方式为超声雾化器进行雾化吸入治疗，雾化时间每次为40min，每隔一天执行1次，直至持续到第69天为止。
以下为实施例1制备的缓释微球的详细实验结果：
1、哮喘小鼠雾化吸入抗NGF微球对气道高反应性及气道炎症的抑制作用
实验方法：BALB/c雌性小鼠被随机分成五组动物/组：对照组、NGF组、OVA致敏激发组(哮喘组)、雾化抗-NGF组、雾化抗-NGF微球组；每组8只。卵蛋白诱导建立哮喘小鼠的哮喘模型。用聚合物合金法制抗NGF抗体缓释微球，采用腹腔注射NGF、雾化吸入抗NGF抗体及雾化吸入抗NGF抗体微球的方式对哮喘小鼠进行干预，用逆转录-聚合酶(RT-PCR)法检测肺组织下呼吸道NGF-mRNA表达水平和TGF-β1的表达水平，采用放射免疫分析方法检测抗NGF干预对两者表达的影响。ELISA法检测肺组织中TGF-β1和NGF的蛋白含量，予体描法检测平均气道阻力等。
2、哮喘模型制备与处理
建立哮喘小鼠模型。利用OVA+氢氧化铝凝胶混合液(含OVA 10mg和200mg氢氧化铝凝胶在第1与第7天经腹腔注射)致敏，小鼠对照组使用同量的无菌磷酸盐(PBS)。把小鼠放置在一个自制的并且密闭雾化箱内中，反复进行的OVA溶液的雾化吸入干预(利用浓度为5％的OVA溶液持续雾化30min，频率为每周三次)直到在30天处死小鼠，激发诱导建立并评估哮喘小鼠模型。雾化抗NGF抗体组和雾化吸入抗NGF抗体微球组行在体干预同步实验，经超声雾化器雾化吸入抗NGF抗体微球或雾化吸入抗NGF抗体，每天1次，隔天一次，每次持续约40min，持续从第7到第30天，分别在雾化激发前3h进行干预。哮喘组在激发前3h采用4mL/kg PBS的进行处理。对照组按相同的步骤使用无菌PBS进行。
3、实验数据结果
(1)抗NGF微球检测及分析
成功制备出抗NGF聚合物微球。抗NGF微球有光滑的表面且大小相似，形态规整，接近圆形。经CHISS软件行正态性检验分析提示微球粒径分布符合正态分布，微球粒径在4.8±0.5μm范围内，适合于雾化吸入的粒径。包封率达(82.80±3.2)％。体外释药性试验结果研究显示：24小时释效率的结果为(8.6±0.8)％，突释作用不明显大约为1.4％，生物活性保存率接近达85.2％，最长释放时间长达80余天。
(2)雾化吸入抗NGF微球对气道高反应性作用明显
由表1结果显示：在平均气道阻力方面：抗NGF组和哮喘组、雾化吸入抗NGF组和抗NGF抗体微球组间的NGF蛋白和mRNA水平相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。雾化吸入抗NGF抗体微球组相对于雾化吸入抗NGF抗体组能有效降低哮喘的严重程度及临床发作次数，降低气道高反应性指标(以平均气道阻力表示)，改善肺功能的目的。
表1各组小鼠雾化吸入抗NGF微球前后平均气道阻力对比分析(cmH2O)
*P<0.05与基线对比；#P<0.05与抗NGF组对比；▲P<0.05，与哮喘组对比(3)雾化吸入抗NGF微球抑制哮喘小鼠神经源性气道炎症中NGF mRNA和炎性介质TGF-β1作用明显。
结果显示：雾化吸入抗NGF微球较雾化吸入抗NGF对哮喘小鼠的气道炎症NGF-mRNA表达的抑制作用更有效，可以减少肺部嗜酸粒细胞等炎性细胞浸润、减少哮喘的发作次数，减少NGF mRNA蛋白的表达，并可以抑制气道炎症。
1)对于NGF蛋白以及NGF mRNA的肺内表达情况进行分析
成功建立哮喘小鼠气道模型并进行检测后，哮喘组及NGF组小鼠气道上皮和其周围可见有大量的NGF蛋白及NGF-mRNA阳性细胞存在，但雾化吸入抗NGF微球组可见有明显减少，雾化吸入抗NGF微球组较雾化吸入抗NGF有好转。对照组小鼠只见有少量阳性细胞，各组小鼠肺组织NGF蛋白及NGF mRNA平均阳性系数为：哮喘组>对照组,雾化吸入抗NGF组<哮喘组，雾化吸入抗NGF微球组<雾化吸入抗NGF组(t分别等于4.58、4.28、4.19，4.36，4.29，4.12，P均<0.05)；而对于其阳性产物的平均灰度值(待测物质的灰度值越高，则表示其在细胞中的表达量则越低，反之，灰度值如越低则表示其在细胞中的表达量则越高)为：哮喘组<对照组，雾化吸入抗NGF组>哮喘组，雾化吸入抗NGF微球组>雾化吸入抗NGF组，t分别等于25.9、20.1、49.8、16.8、42.6、18.6，P均<0.05)，结果见表2。
表2各组小鼠NGF-mRNA及NGF蛋白的灰度值
注：上表中的F值则为单因素方差分析后的统计值；而Hc值为多个独立样本比较(Kruskal-Wallis H检验)后的校正统计值；与哮喘组比*P<0.05#为F值
2)对于肺内炎性介质TGF-β1蛋白和TGF-β1mRNA的肺内表达情况分析
由表3结果显示：雾化吸入抗NGF抗体微球较雾化吸入抗NGF对哮喘小鼠的气道炎症TGF-β1蛋白和TGF-β1mRNA表达的抑制作用更有效。
表3各组小鼠TGF-β1-mRNA及TGF-β1蛋白的灰度值
注：上表中的F值则为单因素方差分析后的统计值；而Hc值为多个独立样本比较(Kruskal-Wallis H检验)后的校正统计值；与哮喘组比*P<0.05；#为F值
各组小鼠的肺组织中的TGF-β1蛋白以及TGF-β1-mRNA的平均阳性系数则为：哮喘组>对照组，雾化吸入抗NGF组<哮喘组,雾化吸入抗NGF微球组<雾化吸入抗NGF组(t分别为4.22，4.26，3.98，4.17，4.98，4.62，P均<0.05)。而对于其阳性产物的平均灰度值(待测物质的灰度值越高，则表示其在细胞中的表达量则越低，反之，灰度值如越低则表示其在细胞中的表达量则越高，下同)为哮喘组<对照组，雾化吸入抗NGF组>哮喘组，雾化吸入抗NGF微球组>雾化吸抗NGF组(t分别为31.58、20.68、45.18、15.19、46.26、19.25，P均<0.05)，哮喘组和NGF组小鼠气道上皮及其气道上皮周围则可见大量的TGF-β1蛋白的阳性细胞，然而雾化吸入抗NGF组和雾化吸入抗NGF微球组则相反，但表现为雾化吸入抗NGF微球组明显减少，对照组则可见少量阳性细胞。
实验结论：抗NGF微球包封率高为82.8.0±3.2％，体外释药试验效果好且释药时间长，最长释放时间长达80余天，经雾化吸入抗NGF微球可以抑制小鼠气道的肺组织内的NGF和炎性介质TGF-β1的表达，并可抑制气道高应性。
本领域技术人员将认识到，对以上描述做出众多变通是可能的，所以实施例仅是用来描述一个或多个特定实施方式。
尽管已经描述和叙述了被看作本发明的示范实施例，本领域技术人员将会明白，可以对其作出各种改变和替换，而不会脱离本发明的精神。另外，可以做出许多修改以将特定情况适配到本发明的教义，而不会脱离在此描述的本发明中心概念。所以，本发明不受限于在此披露的特定实施例，但本发明可能还包括属于本发明范围的所有实施例及其等同物。

Claims (9)

1.一种用于降低气道高反应性的抗NGF抗体缓释微球，其特征在于：所述抗NGF抗体药物制备成缓释微球，采用雾化吸入的方式用于治疗哮喘降低气道高反应性。
2.如权利要求1所述的用于降低气道高反应性的抗NGF抗体缓释微球，其特征在于：所述抗NGF抗体药物缓释微球采用微米级聚乳酸、羟基乙酸的微球作为药物的载体。
3.一种如权利要求1-2任一项所述的用于降低气道高反应性的抗NGF抗体缓释微球的制备方法，其特征在于：包括将抗NGF抗体微粉化、抗NGF抗体微囊化；所述抗NGF抗体微粉化，将抗NGF抗体溶液溶于牛血清蛋白溶液，并按照质量比0.4-1:1的比例混合，混合液经冻干制得抗NGF粉；所述抗NGF抗体微囊化，采用乳化-溶剂挥发法，依次利用聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙烯醇、二氯甲烷、去离子水10％氯化钠溶液处理，制得抗NGF抗体缓释微球。
4.如权利要求3所述的用于降低气道高反应性的抗NGF抗体缓释微球的制备方法，其特征在于：所述牛血清蛋白溶液的浓度为0.5～1.0mg/mL，所述抗NGF抗体溶液的浓度为2～8mL/kg，制备NGF抗体微粉；所述的冻干条件为-20～-30℃冷冻3小时；20℃干燥12h处理。
5.如权利要求3所述的用于降低气道高反应性的抗NGF抗体缓释微球的制备方法，其特征在于，所述抗NGF抗体微囊化的制备步骤包括：
S1：将聚乳酸、羟基乙酸按照重量比为1:2～5的比例进行混合，制备成聚乳酸；
S2：将10～20mg NGF抗体微粉与300mg聚乳酸混合，溶解在1～3mL的二氯甲烷中形成油相；
S3：配置2％的聚乙烯醇溶液8～15mL，加入到油相中，高速搅拌20～60s，形成S/O/W型复乳液；
S4：用去离子水配置10％氯化钠溶液，将复乳液转移到400～500mL 10％氯化钠溶液中，进行磁搅拌，挥发残余有机溶剂，收集微球，用50～100mL去离子水洗涤三次，真空度为-0.05～-0.09MPa，温度为-20～-5℃真空冷冻干燥12h，得到抗NGF抗体微球。
6.如权利要求5所述的用于降低气道高反应性的抗NGF抗体缓释微球的制备方法，其特征在于：所述抗NGF抗体微囊化的制备步骤包括：
S1：将聚乳酸、羟基乙酸按照重量比为1:3～4的比例进行混合，制备成聚乳酸；
S2：将12～17mg NGF抗体微粉与300mg聚乳酸混合，溶解在2mL的二氯甲烷中形成油相；
S3：配置2％的聚乙烯醇溶液10～13mL，加入到油相中，高速搅拌30～40S，形成S/O/W型复乳液；
S4：用去离子水配置10％氯化钠溶液，将复乳液转移到420～480mL 10％氯化钠溶液中，进行磁搅拌，挥发残余有机溶剂，收集微球，用60～80mL去离子水洗涤三次，真空度为-0.07～-0.08MPa，温度为-15～-10℃真空冷冻干燥12h，得到抗NGF抗体微球。
7.如权利要求5-6任一项所述的用于降低气道高反应性的抗NGF抗体缓释微球的制备方法，其特征在于：所述磁搅拌为先1700r/min搅拌2h，-20～-5℃冰浴0.5h，然后800r/min磁力搅拌2h。
8.如权利要求5-6任一项所述的用于降低气道高反应性的抗NGF抗体缓释微球的制备方法，其特征在于：所述的缓释微球的的粒径4.8±0.5μm。
9.如权利要求5-6任一项所述的用于降低气道高反应性的抗NGF抗体缓释微球的应用，其特征在于：所述缓释微球用于治疗哮喘降低气道高反应性。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101461786A (zh) * 2009-01-08 2009-06-24 上海交通大学 用水包油－油包固体制备的pla/plga壳－核微球及其制备方法
CN101653604A (zh) * 2001-05-30 2010-02-24 基因技术股份有限公司 抗ngf抗体用于治疗各种疾病

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101653604A (zh) * 2001-05-30 2010-02-24 基因技术股份有限公司 抗ngf抗体用于治疗各种疾病
CN101461786A (zh) * 2009-01-08 2009-06-24 上海交通大学 用水包油－油包固体制备的pla/plga壳－核微球及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUAYAN SUN等: "preparation and evaluation of NGF-microsphere conduits for regeneration of defective nerves", 《NEUROLOGICAL RESEARCH》 *
李园园: "抗神经生长因子微球局部植入对哮喘大鼠的干预作用及其机制", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

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