CN113876966B - 一种对体内巨噬细胞进行亚型鉴定的荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
一种对体内巨噬细胞进行亚型鉴定的荧光探针及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种对体内巨噬细胞进行亚型鉴定的荧光探针及其制备方法和应用，所述荧光探针包括脂滴荧光染剂BODIPY和荧光染剂DiD，所述脂滴荧光染剂BODIPY和荧光染剂DiD的质量比为1：1.2～2.5。该探针可以在体内靶向巨噬细胞，该探针不仅可以将巨噬细胞与其他细胞进行区分，同时还可以对体内对活体组织中的巨噬细胞进行促炎症M1亚型/抗炎症M2亚型鉴定。
Description
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种对体内巨噬细胞进行亚型鉴定的荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
巨噬细胞是一种免疫细胞，遍布皮肤、肝脏、肺脏、骨髓等全身器官。巨噬细胞具有很强的可塑性，可以根据不同微环境的特定刺激物定向活化成为不同亚型，并具有特殊的细胞功能。例如，细菌、脂多糖(LPS)、干扰素-γ等可以将巨噬细胞诱导成为促炎症M1亚型，它们在机体防护、炎症等过程发挥重要作用。白介素-4(IL-4)、白介素-10等可以将巨噬细胞诱导成为抗炎症M2亚型，它们主要参与组织重建、代谢调控等过程。
目前，越来越多的研究显示巨噬细胞的促炎症M1亚型极化与多种疾病的发生发展密切相关，例如肥胖、粥样动脉硬化、糖尿病、慢性伤口、癌症等。因此，巨噬细胞的亚型鉴定对疾病临床诊断、治疗过程监测有很大的帮助作用，然而目前仍缺乏有效的体内巨噬细胞亚型鉴定技术。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
作为本发明其中一个方面，本发明提供一种对体内巨噬细胞进行亚型鉴定的荧光探针，其中，所述荧光探针包括脂滴荧光染剂BODIPY和荧光染剂DiD，所述脂滴荧光染剂BODIPY和荧光染剂DiD的质量比为1：1.2～2.5。
优选地，所述荧光探针还包括聚(D,L-乳酸-co-乙醇酸)，所述荧光探针中，聚(D,L-乳酸-co-乙醇酸)的质量为脂滴荧光染剂BODIPY的62.5～125倍。
优选地，所述亚型，为巨噬细胞促炎症M1亚型和抗炎症M2亚型。
优选地，所述脂滴荧光染剂BODIPY和荧光染剂DiD的质量比为1：1.25。
作为本发明的另一个方面，本发明提供对体内巨噬细胞进行亚型鉴定的荧光探针的制备方法，其由以下步骤组成，
称取聚(D,L-乳酸-co-乙醇酸)溶解于溶剂中；
加入脂滴荧光染剂BODIPY和荧光染剂DiD，混合均匀得到有机相；
将所述有机相加入到缓冲液水相中，搅拌混合；
超滤离心。
优选地，所述溶剂，包括二甲基亚砜。
优选地，所述称取聚(D,L-乳酸-co-乙醇酸)溶解于溶剂中，其为，配制浓度为4～6mg/mL的聚(D,L-乳酸-co-乙醇酸)溶液。
优选地，所述加入脂滴荧光染剂BODIPY和荧光染剂DiD，混合均匀得到有机相，其中，所述脂滴荧光染剂BODIPY和荧光染剂DiD的质量比为1：1.2～2.5；所述聚(D,L-乳酸-co-乙醇酸)的质量为脂滴荧光染剂BODIPY的62.5～125倍。
优选地，所述有机相加入到缓冲液水相中，所述有机相以1：4～5的比例加入到缓冲液水相中。
作为本发明的另一个方面，所述荧光探针能够区分鉴定巨噬细胞促炎症M1亚型和抗炎症M2亚型。
本发明的有益效果：本发明提供了一种负载两种不同荧光染剂的探针，该探针可以在体内靶向巨噬细胞，该探针不仅可以将巨噬细胞与其他细胞进行区分，同时还可以对体内对活体组织中的巨噬细胞进行促炎症M1亚型/抗炎症M2亚型鉴定。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为纳米探针透射电镜及纳米粒径分布图。
图2为纳米探针体外应用与效果评价的结果图。
图3为经静脉注射纳米探针，纳米探针在小鼠体内生物分布的结果图。
图4为经静脉注射纳米探针，纳米探针在小鼠体内靶向性测试的结果图。
图5为经静脉注射纳米探针，纳米探针在小鼠体内区分不同亚型巨噬细胞的结果图。
图6为对照例1制备的荧光探针共聚焦显微镜图。
图7为对照例2制备的荧光探针纳米颗粒的粒径分布图。
图8为对照例3制备的荧光探针荧光光谱图。
图9为对照例4制备的荧光探针荧光光谱图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1：纳米探针的制备方法
称取聚(D,L-乳酸-co-乙醇酸)(PLGA)溶于二甲亚砜溶剂中配备得到5mg/mL的溶液。将80μg脂滴荧光染剂BODIPYTM 500/510C1,C12(购自InvitrogenTM，货号：D3823，分子式：C22H31BF2N2O2，分子量：404.3059)和100μg荧光染剂DiD(购自InvitrogenTM，货号：D307，分子式：C61H99ClN2O4，分子量：959.9171)加入到1mL含PLGA的有机相溶液中混合均匀。将上述有机相以1：4的体积比例加入到4mL含0.1％吐温80的磷酸缓冲液(pH 7.4)水相中，搅拌得到粗制纳米荧光探针。制备所得的纳米探针置于10KDa的超滤离心管中，通过20min超滤离心的方法除去纳米探针溶剂中所含的二甲亚砜，并将纳米探针重新分散于pH 7.4的磷酸缓冲液中。
参考附图1，所合成的纳米探针为实心的球形粒子(图1A.透射电镜图)，平均粒径为～178nm(图1B.粒径分布图)。
实施例2：纳米探针体外应用与效果评价
参考附图2，在体外培养骨髓来源巨噬细胞，用LPS+IFN-r和IL-4分别将其诱导成为促炎症M1亚型/抗炎症M2亚型(图2A.示意图)，并用流式细胞仪验证不同亚型巨噬细胞的标志物表达情况(图2B.流式细胞术图)。用含纳米探针的培养液培养巨噬细胞6小时，然后用荧光共聚焦显微镜进行观察，可以发现：促炎症M1亚型巨噬细胞被DiD红色荧光标记且胞内有脂滴荧光染剂BODIPY标记所产生的绿色荧光，而抗炎症M2亚型巨噬细胞仅被DiD红色荧光标记但无脂滴标记绿色荧光(图2C.共聚焦显微镜图)。通过荧光强度定量分析，可以发现促炎症M1亚型巨噬细胞的脂滴荧光染剂BODIPY标记所产生的绿色荧光强度显著高于抗炎症M2亚型巨噬细胞(图2D.荧光强度定量分析图)。提示：该纳米探针可以在体外有效标记和区分M1/M2不同亚型巨噬细胞。
实施例3：经静脉注射后纳米探针在小鼠体内的生物分布
参考附图3，纳米探针经静脉注射后，用小动物活体成像(IVIS)检测纳米探针在小鼠不同脏器的分布情况。可以发现：纳米探针主要在肝脏、肺脏等器官聚集。相比正常小鼠，纳米探针在LPS刺激小鼠的炎症局部聚集更多(图3A.IVIS图)。提示：纳米探针可以有效蓄积到炎症发生部位。
实施例4：经静脉注射后纳米探针在小鼠体内的靶向性
参考附图4，纳米探针经静脉注射后，分离、制备炎症发生部位的单细胞悬液，用流式细胞仪分析荧光标定细胞的种类。可以发现：DiD红色荧光标记的细胞高表达巨噬细胞的标志物F4/80和CD11b(图4A.流式细胞术图)。提示：纳米探针可以特异性地靶向正常小鼠和LPS刺激小鼠的巨噬细胞。
实施例5：经静脉注后纳米探针可在小鼠体内区分不同亚型巨噬细胞
参考附图5，纳米探针经静脉注射后，借助共聚焦显微镜进行成像，可以发现：正常小鼠组织中有DiD红色荧光标记但无BODIPY标记脂滴荧光的巨噬细胞，而LPS刺激小鼠组织中有被DiD红色荧光标记且有BODIPY标记脂滴荧光的细胞(图5A.共聚焦显微镜图)。提示：纳米探针被小鼠体内巨噬细胞摄取后，可以基于荧光成像差异对不同亚型巨噬细胞进行区分。
对照例1：
将实施例1的PLGA替换为脂质体，其他实验条件与实施例1相同，发现将PLGA替换为脂质体后，染色效果不佳。可能是由于，虽然脂质体纳米探针可以对巨噬细胞进行染色，但是脂质体会诱发抗炎症M2亚型巨噬细胞生成新的脂滴，因而造成染色效果不佳(图6.共聚焦显微镜图)。
对照例2：
将实施例1中有机相：水相的体积比例由1：4替换为1：9，其他实验条件与实施例1相同，发现将体积比例替换为1：9，染色效果不佳。可能是由于，有机相：水相的1：9体积比例所制得纳米颗粒的粒径更小(平均粒径为～106nm，图7.纳米颗粒的粒径分布图)，这会降低纳米颗粒对巨噬细胞的靶向性，因而造成染色效果不佳。
对照例3：
将实施例1中的荧光染剂DiD替换为荧光染剂DiI，其他实验条件均与实施例1相同，本发明研究发现，将荧光染剂DiD替换为荧光染剂DiI后染色效果不佳。可能是由于绿色荧光染剂BODIPY的放射光波段与红色荧光染剂DiI的激发光波段存在一定的荧光共振能量转移，从而降低BODIPY的荧光强度(图8.荧光光谱图)，进而影响染色效果。
对照例4：
将实施例1中的脂滴荧光染剂BODIPY的用量由80μg替换为40μg，其他实验条件均与实施例1相同，本发明研究发现，将脂滴荧光染剂BODIPY的用量降低为40μg后染色效果不佳。可能是由于，在巨噬细胞摄取相同数量纳米颗粒的条件下，荧光染剂BODIPY的用量降低导致单颗细胞的绿色荧光信号变弱，(图9.荧光光谱图)，进而影响染色效果。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (3)
1.一种对体内巨噬细胞进行亚型鉴定的荧光探针在制备巨噬细胞亚型鉴定试剂中的应用，其特征在于：所述荧光探针用于区分巨噬细胞促炎症M1亚型和抗炎症M2亚型；
所述荧光探针包括脂滴荧光染剂BODIPY和荧光染剂DiD，所述脂滴荧光染剂BODIPY和荧光染剂DiD的质量比为1：1.25；
所述荧光探针还包括聚(D,L-乳酸-co-乙醇酸)，所述荧光探针中，聚(D,L-乳酸-co-乙醇酸)的质量是脂滴荧光染剂BODIPY的62.5~125倍；
所述对体内巨噬细胞进行亚型鉴定的荧光探针，其制备方法由以下步骤组成，
称取聚(D,L-乳酸-co-乙醇酸)溶解于溶剂中；
加入脂滴荧光染剂BODIPY和荧光染剂DiD，混合均匀得到有机相；
将所述有机相加入到缓冲液水相中，搅拌混合；其中，所述有机相以1：4~5的比例加入到缓冲液水相中；
超滤离心。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述溶剂，包括二甲基亚砜。
3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述称取聚(D,L-乳酸-co-乙醇酸)溶解于溶剂中，其为：配制浓度为4~6 mg/mL的聚(D,L-乳酸-co-乙醇酸)溶液。
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