CN1198100A - 聚氨基葡糖药物投递系统 - Google Patents

Abstract

概括地说,本发明是关于一种新的药物投递组合物。更具体地说,本发明是关于一种药物投递组合物,它包括一种与所需药物组合的铁/聚氨基葡糖微粒,一种聚氨基葡糖配制的药物化合物,或者一种与所需物质组合的聚氨基葡糖/油－表面活性剂。本发明还设计了用于包括该组合物在内的药物投递的方法,以及生产这些组合物的方法。

Description

聚氨基葡糖药物投递系统

                     优先权

本申请基于1996年6月11日提交的美国临时申请第60/019543号，根据35U.S.C.§119(e)要求优先权。

                    发明的领域

概括地说本发明是关于一种新的药物投递系统。具体地说，本发明是关于一种包括修饰的铁/聚氨基葡糖微粒和聚氨基葡糖配方化合物的药物投递系统，它提供了增强的经口服给药的药物投递效果。另一方面，本发明还涉及一种用于口服投递治疗或预防物质的聚氨基葡糖基质。

                       发明的背景

发展有效的药物投递系统是制药工业中研究和开发的必要部分。至今市场可得到的几种投递载体包括：简单的丸剂、锭剂、静脉注射溶液、软膏、鼻喷雾剂、透皮贴剂、滴眼剂等。为了能持续地延时释放药物，投递措施尤其包括，可维持积蓄形成的延时释放丸剂，渗透泵和组合物。对生物聚合物的鉴定和合成已导致发展了更先进的投递系统，从而改善了口服给药的方式〔Langer，Science 249：1527-1533(1990)〕，并可能克服与生物活性丧失有关的问题，其生物活性丧失是由于药物在消化道内降解而引起，并因此导致药物的有效度降低。特别有意义的是一些小的生物聚合物颗粒，它们能有效地捕获药物，保护药物免受消化道杂乱环境的影响，并最终增加药物在胃肠道内的吸收。

几丁质，聚-β-(1→4)连接的N-乙酰基-D-葡糖胺，是一种自然界存在丰富的生物多聚物，它具有几个特点使之适合于用作药物投递载体，包括在稀酸溶液中适中的溶解度和对有机化合物的高亲和性。几丁质的脱乙酰基形式，聚氨基葡糖，具有类似于葡糖氨基聚糖的结构特征，在结缔组织修补重建中显得特别有前途，作为外源性基质〔Muzzarelli et al.，Biomaterials 9：247-252(1988)〕此外，聚氨基葡糖刺激巨噬细胞杀灭肿瘤细胞的活性和产生白介素1的能力，暗示有可能把它用作药物载体，对免疫系统受压剂的肿瘤患者给药。同上文献，这些特性已引导研究者试验各种聚氨基葡糖制剂，希望得到一种可能的药物投递赋形剂，它本身能经受住胃中的环境，同时能保护所结合的药物，并且，使药物能延时释放。

过去的努力主要是针对聚氨基葡糖制剂，用局限性的体外试验法，测定这种制剂保持完整性和提供持续地药物释放的能力。早期的体外试验研究暗示，简单的干燥聚氨基葡糖凝胶可能具有作为药物持续释放载体的潜在性用途〔Miyazaki，et al.，Chem.Pharm.Bull.29：3067-3069(1981)〕。近来的研究是将聚氨基葡糖微球或凝胶与例如下列成分共同配制：交联戊二醛〔Thacharodi和Ro，Biomaterial  16：145-148(1995)；Chandy和Sharma，Biomaterials 14：939-944(1993)〕；藻酸盐〔Alexakis，等人，Appl.Biochem.Biotechnol.50：93-106(1995)；Polk，等人，J.Pharm.Sci.83：178-185(1994)；Miyazaki等人，Biol.Pharm.Bull.17：745-747(1994)；Filiprovic-Grcic，等人，Intl.J.Pharm.116：39-44(1995)；Bodmeier和Paeratakwl.J.Pharm.Sci.78：964-967(1989)〕；含有抗衡离子如三聚磷酸盐或氯化钙的藻酸盐〔Bodmeier，等人，Pharm.Res.6：413-417(1989)〕，单独的三聚磷酸盐〔Sezer和Akbuga，Inel.J.Pharm.121：113-116(1995)〕；以及氢氧化钠/甲醇〔Chandy和Sharma Biomaterials13：949-952(1992)〕。

掺合有铁的聚氨基葡糖制剂似乎仅限于铁被捕获在聚氨基葡糖微球中的一种情况，并且然后再以脂质体或者白蛋白包被，以便调节铁从微球中释放的速度〔Chandy和Sharma，Biomaterils 17：61-66(1996)〕。在那种制剂中，来自FeCl₃的铁是被捕获的“药物”，而不是聚氨基葡糖微球本身的整个成分。而且，对铁的捕获受到将增溶聚氨基葡糖喷雾进入NaOH/甲醇溶液的影响，这种喷雾可产生直径大约1毫米大小的聚氨基葡糖微粒。

用聚氨基葡糖微球进行的体内试验更是相当局限。例如，Jameela等人〔J.Biomatter Sci.Polym.Ed.6：621-632(1994)〕描述一种聚氨基葡糖/藻酸盐组合的微球，在对家兔舌下给药之后，可使酮苯丙酸持续地释放3小时之久。Illum等人〔Pharm，Res.11：1186-1189(1994)〕证明，鼻喷雾给予被捕获在聚氨基葡糖中的胰岛素之后，大鼠和绵羊的粘膜对胰岛素的吸收增加了。但是，迄今尚未发现用于口服给药的有效的聚氨基葡糖制剂。

因此，有必要在本领域开发有效的口服药物投递载体，它经得住消化系统的严酷环境，并能够持续地释放所需要的药物，否则这种药物将是治疗无效的，或者只有有限的有效性。上面描述的聚氨基葡糖的特性，使这种丰富的多糖成为这种载体有吸引力的选择对象。

                       发明概述

一方面，本发明是关于一种药物投递组合物，它包含将药物捕获在其中的铁/聚氨基葡糖微粒或复合物。该组合物对口服给药特别有用，因为这种微粒或复合物对所捕获的药物提供对抗消化道严酷环境的保护，并且使药物能够通过一种可增加药物循环半衰期的途径被吸收。由这种金属/聚氨基葡糖复合物提供的另一个优点是对疏水有机化合物的高度亲和性，它能够把通常情况下不溶解的药物投递给循环系统。

在一个优选的实施方案中，铁/聚氨基葡糖微粒的大小小于10微米。但是，更优选的是直径小于5微米的微粒，而更优选的是所有微粒的直径都小于5nm，以便有利于肠粘膜细胞的胞内吞作用。

另一方面，本发明还提供了一种用于口服投递治疗或预防药物的聚氨基葡糖基质，特别在此聚氨基葡糖投递系统中特别需要使用的药物，是那些基本上不能经受消化道严酷环境的，因此吸收水平通常太低而不能用于口服投递系统的药物。作为一种口服投递系统，本发明可用于各种剂型，如粉剂、丸剂、片剂(caplet)、胶囊剂、凝胶剂、液体、混悬液、乳剂、酏剂、糖浆剂等，只要制备过程不导致微球的大小，或具有优选大小的微球在组合物中的特性发生显著的改变。可能是这样一种剂型，这种微粒本身可在很长一段时间内释放，或者使之在一段时间内一直都有效。口服组合物优选的设计是使活性化合物在胃肠道中特定的位置释放，在此生物有效度最大，药物降解作用最小。

尽管口服给药是目前优选的给药方法，但是还应考虑到其它的给药途径，包括例如皮下注射、透皮给药、肌内注射、静脉内注射、鼻内给药、肺内给药、直肠内给药、阴道内给药，腹膜内注射、眼科给药等，每种给药方式的最佳微粒大小都各不相同，对此，本领域中任一普通的技术人员都能容易地确定。例如，较大的微粒在口服系统中比在注射系统中更容易被接受，注射给药系统可能受机械注射装置，和/或毛细血管大小制约因素的限制。

目前制备这种药物投递微粒的优选方法包括，将聚氨基葡糖粉末溶解在酸溶液中，优选地是含有乙酸的溶液，对生成的混合物作超声波处理，并同时加入金属盐，优选的是柠檬酸铁铵。为了将药物捕获在微粒中，在超声波处理之前，一开始就将酸稳定性药物制剂加到聚氨基葡糖的酸溶液中。但是，这种微粒的制备可能通过许多变换方法来实现。

例如，可购得的若干种不同等级的任何一种聚氨基葡糖都可用于制备这种药物投递系统，还包括不同程度脱乙酰基的聚氨基葡糖。聚氨基葡糖还可以从几丁质通过以本领域熟知的碱处理脱乙酰基作用来制备。目前优选的是脱乙酰基在大约50～80％之间的聚氨基葡糖。更优选的是脱乙酰基60～75％的聚氨基葡糖。

此外，许多酸性缓冲液中的任何一种都可用于溶解聚氨基葡糖粉末。最初溶解聚氨基葡糖的酸溶液的浓度可在0.1％至15％范围内变化。但是最优选的是2％的酸溶液。同样，酸溶液的pH也可在1.0至6.8的pH范围内变化，但最优选的缓冲液是在2～3的pH范围之内。

同样地，多种铁盐都可用作在超声波处理过程中引起颗粒形成的铁源，包括例如氯化铁。另一些金属离子如锌、铜或镍在形成聚氨基葡糖微粒的过程中也可能有用，本发明对任何生理学可接受的酸或金属盐都加以考虑。

在另一个实施方案中，药物可能以含有如下成分的组合物形式被口服给药，所述组合物包含聚氨基葡糖，糖，例如但不限于麦芽糖、己糖、甘露糖或葡萄糖，以及药物。本发明还涉及制备一种口服药物投递系统的方法。此方法包括如下步骤：(a)制备聚氨基葡糖/糖溶液，(b)将药物溶解于一种有机溶剂内，例如，但不限于丙酮、甲醇、乙醇或乙腈，(c)将步骤(a)和(b)的溶液混合，(d)将步骤(c)的混合物冷却干燥，以及(e)将此冷冻干燥的混合物再组合在适当的口服赋形剂中用于对受治疗者给药。还可以将形成的冷冻干燥混合物研磨制成细粉末。另外，作为一种口服投递系统，本发明还可以以多种剂型使用，如粉剂、丸剂、片剂(caplet)、胶囊剂、凝胶剂、液体、混悬液、乳剂、酏剂、糖浆剂等。还有另一个精心设计的实施方案是一种口服给药的方法，包括对患者给予一个口服组合物，此组合物含有与糖和药物组合的聚氨基葡糖。

还考虑用于该药物投递系统的其它可选择成分。例如，但不局限于如下制药学可接受的油：canola油、玉米油、花生油、橄榄油、植物油、矿物油等，或脂类组合物也可能包括在此聚氨基葡糖/药物混合物中，在超声处理步骤之前，处理过程中或处理之后加入都可以。脂类的加入又可能使之必须加入任何一种生理学可接受的表面活性剂，这取决于待掺入药物的物理特性。油或脂类可能对捕获的药物在通过胃肠道时提供附加的保护作用。还可能延缓治疗或预防药物从聚氨基葡糖基质中的释放，或者还可能改善在肠内的吸收。如上所述，油或脂类还可能包括形成乳浊液，然后可以把它喷涂在表面、再干燥、收集并压缩在胶囊或片剂中。作为另一种添加成分，还可能加入明胶作为带有捕获药物的聚氨基葡糖基质的固定剂，然后可以收集这种含有被固定治疗或预防药物的颗粒，用于以胶囊的形式给药。

超声处理进行的程度是，使形成的聚氨基葡糖微粒直径小于10微米，优选的是直径小于5微米。最优选的超声处理是持续到使微粒直径小于大约5毫微米，只要能得到优选大小的微粒，超声处理的持续时间和功率可以变化。此外，任何类型，型号的超声处理器都可用于制备这种聚氨基葡糖微粒，同样，只要形成的微粒具有优选的大小。例如，无论是探头式或者是水浴形式的超声处理器都适合用于制备这种药物投递系统。这取决于超声处理器的功率，超声处理的持续时间可以从1分钟变化到10分钟。当前优选的超声处理器是Branson Sonifier Mode250，以最大强度的大约60％处理持续时间1～3分钟。

作为使用超声处理器的替代方法，还可以用各种类型的匀浆器，乳化器，液化器等来制备这种药投递系统。

为了对治疗或预防物质进行生理学投递，用于制备聚氨基葡糖的优选方法包括，将聚氨基葡糖溶解在酸性溶液中，然后加入治疗或预防物质。取等分量该混合物，与生理学可接受的油混合，并作超声处理。生成的聚氨基葡糖基质对口服投递如下治疗或预防物质特别有用，例如：激素(如，但不限于胰岛素、孕酮、雌激素、睾丸素，糖皮质激素、盐皮质激素、生长激素)，细胞因子(如，但不局限于白介素、淋巴因子、单核因子)，化学激活因子，造血因子(如，但不限于促红细胞生成素)，以及其它治疗或预防物质，多肽或蛋白质，这些物质在口服投递后通常是没有生理活性的。在此系统中有用的蛋白质或多肽可能是天然的和从天然存在的来源中纯化的，还可能是重组产生的，或者化学合成的。

本发明还考虑用于制备这种药物投递系统方法的变化形式。例如，可通过优选的方法制备聚氨基葡糖微粒，但不存在药物。一旦按此方式制备了聚氨基葡糖微粒，然后就可以将它与所需要的药物溶液混合，混合之后再将此混合物如上述进行处理。按另一种方法，同样可在不存在药物的情况下制备聚氨基葡糖微粒，再将颗粒冷冻干燥，随后在含有药物的溶液中重新水化。

                       附图说明

图1显示在体外试验中，溴百里酚兰(BTB)从铁(Fe)，聚氨基葡糖(Ch)，或者铁/聚氨基葡糖微粒复合物中的释放速度。

图2显示口服给予孕酮/铁/聚氨基葡糖微粒后，孕酮的生物利用度。

图3显示口服给予聚氨基葡糖配制的孕酮后，与微粒化的孕酮相比较，孕酮的生物利用度。

图4显示，链脲佐菌素处理的动物在口服给予胰岛素/聚氨基葡糖组合物或胰岛素/PBS组合物后，表明血糖水平的数据。

                      发明详述

通过如下关于制备和应用铁/聚氨基葡糖药物投递组合物以及聚氨基葡糖/蛋白质药物投递系统的实施例，对本发明进行说明。实施例1描述铁/聚氨基葡糖微粒的制备。实施例2说明一种化合物在和从铁/聚氨基葡糖微粒中的体外保留和释放。实施例3表明在一段时间之后，铁/聚氨基葡糖微粒对一种化合物体内投递。实施例4描述一种化合物从铁/聚氨基葡糖微粒中的释放，或者，聚氨基葡糖配制的化合物作为时间函数地释放。实施例5描述用聚氨基葡糖作基质口服给予胰岛素。

                     实施例1

      制备铁/聚氨基葡糖微粒

首先通过在2％乙酸中溶解粉末状的聚氨基葡糖，制备1％SeaSanMer N 2000级的聚氨基葡糖(CTC Organics，Atlanta，GA)溶液，并将此溶液作热压处理。为了制备铁/聚氨基葡糖微粒，将1-5ml聚氨基葡糖溶液超声处理1-3分钟，同时滴加4％柠檬酸铁铵贮备液，每毫升聚氨基葡糖溶液滴加0.2-0.3ml。柠檬酸铁铵贮备液是预先用水配制的。这几步的最后结果是形成了非常细微的聚氨基葡糖微粒悬液。典型地，此聚氨基葡糖微粒的密度大约是每毫升聚氨基葡糖溶液净重0.3g，或者是每毫升重配的缓冲液含18mg冷冻干燥的固体。用测微计对悬液中的微粒作定时地测定，发现其直径范围大约是2至10微米。为了将小分子掺入此铁/聚氨基葡糖微粒中，按如下所述对上述的方法进行了修改。

                       实施例2

      药物释放的体外试验

为了初步测定捕获在如上述制备的聚氨基葡糖/铁微粒中的小分子的释放速度，按下述进行了体外透析试验。A.制备含有溴百里酚兰的铁/聚氨基葡糖微粒

制备5mg/ml溴百里酚兰(BTB)(Sigma.St.Louis，MO)的水溶液，将相当于200μg的BTB与500μl如实施例1中制备的铁/聚氨基葡糖溶液彻底混匀。另一种方法是，每毫升1％聚氨基葡糖溶液混合相当于400μg的BTB。将形成的混合物超声处理3分钟，同时，在超声处理的过程中，滴加0.2-0.4ml 4％柠檬酸铁铵水溶液，这样，制备成含有溴百里酚兰被捕获在聚氨基葡糖微球中的桔黄色微粒。B.从铁/聚氨基葡糖微粒释放溴百里酚兰的体外试验

将如上所述制备的含有溴百里酚兰的铁/聚氨基葡糖微粒，单独置于具有12kD截止分子量的透析袋中，并将每个透析袋置于50ml的园锥形试管中，浸没在45ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，以便测定BTB被释放进入透析缓冲液的速度。将此试管放置在末端对末端的振荡器上，通过用Spectronic-20在595nm自始至终地监测光吸收度，来测定溴百里酚兰释放进入缓冲液的速度，平行地进行几组对照试验：一组是在一个透析袋中仅含有等量的溴百里酚兰，另一组是含有与聚氨基葡糖混合的溴百里酚兰(不是如上述A部分中所述的掺合，而是仍形成了均匀的桔黄色溶液)还有一组是袋中含有与柠檬酸铁铵溶液混合的溴百里酚兰。

释放速度显示在图1中。从图中可见，与仅含有溴百里酚兰的袋，含有与柠檬酸铁铵混合的溴百里酚兰的袋，或者含有与聚氨基葡糖混合的溴百里酚兰的袋相比较，含有捕获在铁/聚氨基葡糖微粒中的溴百里酚兰的透析袋，以低很多的速度释放溴百里酚兰。在保温的初始阶段，仅见从铁/聚氨基葡糖微粒中相对缓慢的释放，而较长时间保温后，这种缓慢的释放变得非常更加突出。这些数据表明，铁/聚氨基葡糖微粒具有显著的滞留最初被捕获分子的能力，并且具有以缓慢的速度开始释放这些分子的能力。

                      实施例3

      药物释放的体内试验

鉴于上述实施例2中的体外试验结果，我们设计了几个实验，用于测定是否在体内铁/聚氨基葡糖微粒也能延缓药物的释放。一种水溶性的杀真菌剂制霉菌素被选择用于初步研究。A.  制备含有制霉菌素的铁/聚氨基葡糖微粒

用蒸馏水配制2mg/ml的制霉菌素(Sigma)悬液，取100μl与如实施例1中所述制备的200μl聚氨基葡糖溶液彻底混匀。将生成的混合液超声处理2-3分钟，同时加入4％柠檬酸铁铵(100μl/ml聚氨基葡糖：制霉菌素混合液)，生成带黄色的微粒。将此悬液离心，抽吸除去上清液，并将微粒片再混悬在200μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。离心之后上清液清亮，表明药物已高程度掺入，因为制霉菌素通常不溶于水，而在水溶液中形成微细颗粒状态。可通过在C-18柱上进行HPLC(Waters)，以及通过用冷甲醇从微粒中萃取被捕获的制霉菌素，测定药物在聚氨基葡糖微粒中的掺入作用。B.  口服给予制霉菌素铁/聚氨基葡糖微粒片制霉菌素的血清浓度

对实验组成年雌性小鼠用安装在1ml注射器上的喂药针头，口服给予含有制霉菌素的铁/聚氨基葡糖微粒。对第一对照组小鼠口服给予制霉菌素在PBS中的悬液，对第二对照组小鼠口服给予与制霉菌素混合的，并且其中加入了5μl戊二醛而形成了凝胶的聚氨基葡糖悬液。对每只小鼠给予了等量的大约4mg制霉菌素，体积为200-400μl。

小鼠在口服给药后0小时、1小时和5小时，从后眼窝穿刺采血。使血液凝固，并分离出血清。在用冷甲醇萃取血清之后，如上所述用HPLC测定制霉菌素的血清浓度。

在如下表1中列举了给药后5小时的血液制霉菌素浓度值，在给药后0小时和1小时，来测定出制霉菌素。与只接受了制霉菌素或者仅与聚氨基葡糖混合的制霉菌素的小鼠相比较，接受了被捕获在铁/聚氨基葡糖微粒中的制霉菌素的小鼠，在给药后5小时产生了较高的血清制霉菌素浓度。此外，将口服或腹膜内给予含制霉菌素的铁/聚氨基葡糖微粒的二组小鼠血清制霉菌素浓度相比较表明，接受口服给药的小鼠比腹膜内给药的小鼠具有比150％更高的血清制霉菌素浓度。此结果表明，与聚氨基葡糖结合提供了更高水平可利用的药物。

表1用不同的投递系统口服给药后血中制霉菌素的浓度

        制剂                        浓度(μg/ml)

制霉菌素PBS悬液                         0.938

与聚氨基葡糖和戊二醛混合的制霉菌素      0.338

在铁/聚氨基葡糖微粒中的制霉菌素         2.964

在铁/聚氨基葡糖微粒中的制霉菌素^*       1.787

     ^*除了是腹膜内给药外，这种制剂与上面紧靠的配方相同。

                        实施例4

       药物释放的体内试验

为了进一步评价铁/聚氨基葡糖微粒在体内投递和释放药物的效率，对不同组大鼠口服给予如下述(A-B)制备的孕酮。此实验与实施例3的实验不同之处在于对被捕获药物水溶解度的影响也进行了评价。另外，为了评价聚氨基葡糖配制的化合物在体内被投递和释放的效率，对二组大鼠口服给予了如下述(C-D)制备的孕酮。A.制备含孕酮的铁/聚氨基葡糖微粒

将孕酮(Sigma Chemical Co.St.Louis，MO)溶于二甲基亚砜(DMSO，Sigma)中成最终浓度10mg/ml，并取1ml该溶液与含有0.1％吐温20和1ml矿物油的等体积1％铁/聚氨基葡糖相混合。将形成的乳浊液超声处理1-3分钟，同时滴加50μl柠檬酸铁铵贮备液，在显微镜下对形成的溶液进行测定，已确定微粒大小的范围是2-10微米。接受这种制备物给药的大鼠被称作第一组。

对照制备物包括：悬浮于PBS中的孕酮，并且所形成的是经超声处理的悬液(用于对第二组给药)，悬浮于PBS中的孕酮，在作超声处理的过程中，对此悬液加入柠檬酸铁铵(用于对第三组给药)，以及不加柠檬酸铁铵的孕酮悬液(用于对第四组给药)。

除上述对照之外，还使用了含有水溶性孕酮的其它二个制备物。在水溶性的形式中，此甾类化合物被捕获在2-羟基丙基-β-环糊精中，这种水溶性形式可从Sigma(St.Louis，MO)购得。在第一个水溶性孕酮制备物中，是将10mg/ml的甾类化合物溶液与1％聚氨基葡糖悬液混合(以每毫升聚氨基葡糖液含相当于10mg孕酮的比率)。将这种制备物对第5组大鼠给药。含有水溶性孕酮的第二个制备物的制备法与第一个制备物类似，区别仅在于在超声处理过程中加入了50μl 4％柠檬酸铁铵，形成了带有被捕获甾类化合物的铁/聚氨基葡糖微粒。此制备物对第6组大鼠口服给药。B.  口服给予孕酮铁/聚氨基葡糖微粒后孕酮的生物利用度

对体重在300-350克的成年雌性大鼠(卵巢已被切除)，分别给予在(A)中所述各种孕酮制剂的一种，每种制剂的给药剂量均为每只大鼠给予相当于1mg孕酮。用安装在1ml注射器上的喂药针头口服给药。在给药后，0、2、4和20小时，通过后眼窝穿刺法对大鼠采血，使用Coat-A-Count孕酮固相放射免疫测定试剂盒(Diagnostic ProductCorporation，Los Angeles，CA)，通过放射性免疫测定法(RIA)测定血清孕酮浓度。

结果显示在图2中。发现给予在铁/聚氨基葡糖微粒中含不溶性孕酮的第一组大鼠血清孕酮浓度最高，在给药后4小时测定出最高的浓度。从给予捕获在铁/聚氨基葡糖中水溶性孕酮的第六组动物，也测定出类似的高浓度(特别是给药后4小时)。虽然以其它几种制剂给予孕酮的大鼠，在给药后2小时也显示出最高的血清孕酮浓度，但在给药后4小时可测定的孕酮浓度降到至接近对照的水平。根据对孕酮通常公认的短半衰期，这些结果表明，对不同的制剂存在不同的孕酮释放速度，或者是对被捕获在铁/聚氨基葡糖微粒中的甾类化合物(天然的或水溶性的)存在不同的吸收途径。C.  制备聚氨基葡糖配制的孕酮

将200mg孕酮(Sigma Chemical Co.St.Louis，MO)溶于5ml丙酮中(试剂级：Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)，同时将0.3g麦芽糖(Fisher Scientific)溶解于10ml 2％聚氨基葡糖溶液中(通过将粉末状的SeaSanMer N 2000级聚氨基葡糖(CTC Organics，Atlanta，GA)溶解于0.25M柠檬酸(Fisher Scientific)中制备的)。将5ml孕酮/丙酮溶液与5ml聚氨基葡糖/麦芽糖溶液混合。使所形成的混合物在液氮中快速冷冻。并进行冷冻干燥。冷冻干燥之后，计算在这种经研磨的混合物中相当的孕酮重量(通常是3.03-3.05mg精细粉末＝仅仅1mg孕酮)，也可以将形成的海绵状干燥的聚氨基葡糖配制的孕酮研磨成细粉末。对实验动物口服给药时，将形成的冷冻干燥混合物在去离子水中重新配制。如前面所述，本发明还可以用于各种剂型，如粉剂、丸剂、片剂(Caplet)、胶囊剂、凝胶剂、液体、混悬液、乳剂、酏剂、糖浆剂等。D.  口服给予孕酮聚氨基葡糖微粒后孕酮的生物利用度

将体重300-350克的成年雌性大鼠(卵巢切除)分成二个实验组(每组7只动物)。接受了如(C)中所述重新配制的聚氨基葡糖配制的孕酮的动物被称为A组(试验组)，而接受了微粒化(粉末状)孕酮的动物被称为B组(对照组)。用安装在1ml注射器上的喂药针头对动物口服给药，剂量为每只大鼠给予相当于5mg的孕酮。在给药后0、1、5、24和48小时对大鼠采血，用Coat-A-Count孕酮固相放射免疫检测试剂盒(Diagnostic Product Corportion，Los Angeles，CA)，通过放射性免疫测定法(RIA)测定血清孕酮浓度。

显示在图3中的结果表明，在给药后1小时和48小时(P＝0.013)，以及给药后24小时(P＝0.001)，接受了聚氨基葡糖配制的孕酮混合物的动物与对照动物(接受了微粒化孕酮)相比较，具有显著较高的血清孕酮浓度。

                        实施例5

    蛋白质药物释放的体内试验

考虑到上述聚氨基葡糖基质对药物的生理学投递之有效性的结果，进一步研究了聚氨基葡糖经由同样的口服给药途径投递蛋白质的能力。A.  制备含有胰岛素的聚氨基葡糖微粒

如上实施例1中所述在2％乙酸(pH 3.9)中配制1％聚氨基葡糖溶液，不同的是未对该混合物加入柠檬酸铁铵。将1ml等分量聚氨基葡糖溶液与12mg牛胰腺胰岛素(Sigma，大约300单位)混合，并使生成的溶液充分混合均匀，加入含有0.1％聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯(吐温20)(Sigma)的另1ml等分量聚氨基葡糖/乙酸溶液，并对混合液进行旋转搅拌。取1ml等分量此最后的溶液，加入到1.5ml Canola油中(Hunt-Wesson Fullerton，CA)，并将此混合物超声处理1分钟在所形成的块状混合液中，胰岛素的最终浓度是60单位/ml。

将6mg胰岛素(大约154 U.S.P单位)加到1ml PBS中并将溶液充分混匀，作为对照。将Canola油加入此溶液，对形成的混合液超声处理1分钟。同上面的待测溶液一样，形成的对照液表现为白色乳状混合液，但是，对照混合液会逐渐分层，而待测液表现为稳定的乳剂。B.正常动物口服给药后胰岛素的生物利用度

两组大鼠，每组3只，被用于口服给予上述在聚氨基葡糖基质中制备的胰岛素之后，测定胰岛素的利用度。在此测定方案中，每只大鼠先喂给0.3ml 0.625g/ml的葡萄糖溶液。5分钟之后，每次大鼠再喂给0.3ml胰岛素/聚氨基葡糖混合液或者胰岛素对照混合液。在给予胰岛素之后的0、30、60和120分钟，对每只大鼠从尾静脉采血，用Exac Tech血糖检测系统(Medisense，Waltham，MA)测定血液葡萄糖浓度。

结果列举在表2中，该结果表明胰岛素在聚氨基葡糖基质中被口服给药能引起血糖水平短时间地下降，而单独口服给予胰岛素时则未测定出血糖下降，但是，这些结果对如下问题没有提供任何信息：所见到的血糖下降是否是由于被吸收的聚氨基葡糖单独引起。

                         表2

            给予胰岛素后的血糖水平

          葡萄糖浓度(mg/dl±SD)

时间(分钟)    对照组     试验组

   0          84±7      90±9

  30         119±18     50±5

  60         114±18     63±3

 120         109±11    106±34C.  正常和链脲霉素处理的动物口服给药后胰岛素的生物利用度

为了确定上面看到的血糖降低是否是由于胰岛素的生物利用度增加而引起，或者是由于聚氨基葡糖本身增加吸收而引起，应用正常大鼠和通过给予链脲霉素(Sigma，St.Louis，MO)导至成为糖尿病状态的大鼠〔Rakieten，et al.Cancer Chemotherapy Peports 29：91-98(1963)〕，进行了如下的实验。简单地说，可通过静脉内注射链脲霉素来诱发大鼠糖尿病，此链脲霉素是溶解于以抗凝剂酸性柠檬酸葡萄糖(ACD)溶液缓冲的生理盐水中(ACD以0.9％NaCl作1∶50稀释)。该溶液的最终链脲霉素浓度是20mg/ml，pH5.0。通过0.22微米的滤膜对此稀释液作过滤除菌，并在配制后10-15分钟内使用。大鼠先用氟烷麻醉，然后经尾静脉，以大约50mg/kg体重的剂量一次静脉内注射给药。通常在给药前血糖水平是在80-110mg/dl血液的范围内。给药后第一天，血糖水平一般提高到大于600mg/dl，给药后第6天，血糖水平一般是350-450mg/dl。

以在(A)中所述的口服药物投递系统对大鼠给予牛胰岛素，并测定所引起的血糖改变。作为不同实验的对照，来自每组的大鼠还按如下口服给药：(i)溶于PBS中的胰岛素，(ii)按上述(A)中配制的胰岛素但未加入聚氨基葡糖，以及(iii)上面(A)中所述的制剂，但未加入胰岛素。作为补充的阳性对照，以溶于PBS的牛胰岛素作肌内注射给药。

在起初的实验中，如在(A)中所述制备的胰岛素18.4单位可压制血糖水平几乎2小时之久，而肌内注射0.26单位可压制血糖达1小时之久。当从此口服投递系统中省去聚氨基葡糖，或者仅以胰岛素的PBS溶液单独口服给药，均未见血糖水平有任何改变。

在随机的实验中(见图3)，如上述(A)中制备的胰岛素18.4单位可压制血糖水平2.5小时以上。以胰岛素的PBS溶液处理的动物未见血糖水平有任何改变。D.  胰岛素口服给药治疗糖尿病

前面的结果表明，胰岛素在聚氨基葡糖中经由口服途径给药，能够压制血糖水平。为了测定口服给予胰岛素治疗糖尿病的能力，使用了一种动物模型，其中大鼠通过如上所述的静脉内给予链脲霉素而诱导形成糖尿病状态。糖尿病的发作可通过测定血糖水平来监测。当测得血糖持续地高于300mg/dl时，按下面的实验对动物口服给予胰岛素。

对一组大鼠给予如上面(A)中所述制备的胰岛素，测定血糖水平，并与给予胰岛素PBS溶液的一组大鼠血糖水平相比较。对每组的大鼠都给予了18.4单位胰岛素。对于仅喂予胰岛素PBS溶液的大鼠。未发现血糖水平的任何变化。但是，对于喂给包含在聚氨基葡糖中胰岛素的大鼠，血糖水平在大鼠被监测的最初3小时的过程中持续被压制。这些资料表明，口服给予包含在聚氨基葡糖基质内的胰岛素，对治疗动物模型的糖尿病是有效的，这表明以同样的药物投递系统，对治疗人的糖尿病也可能有效。

最后，上述的方法和制剂还可用于其它药物以及其它治疗或预防物质。这些药物或物质可以是(但不限于)那些难以溶解的药物或物质，例如许多精神活性药物(如Clozapine)或激素(如胰岛素、孕酮、雌激素、睾丸素、糖皮质激素、盐皮质激素、生长激素)，细胞因子(如白介素、淋巴因子、单核因子)，化学激活因子，造血因子(如促红细胞生成素)，或者其它治疗或预防物质。

可以预料，对于本领域的专业人员，根据上述例证性实施例中所述，可对本发明作出许多修改或变化。因此，仅仅在所附的权利要求中所列举的范围才应该置于本发明之中。

Claims (43)

1.一种含有聚氨基葡糖-铁复合物和药物的口服药物投递组合物。

2.权利要求1的组合物，其是不溶性的。

3.权利要求1的组合物，其在酸性pH中是稳定的。

4.权利要求1的组合物，其中的药物是孕酮。

5.一种用于药物投递的方法，包括对患者给予一种含有聚氨基葡糖-铁复合物和药物的口服组合物。

6.权利要求5的方法，其中的组合物是不溶性的。

7.权利要求5的方法，其中的组合物在酸性pH中是稳定的。

8.权利要求5的方法，其中的药物是孕酮。

9.一种制备口服药物投递组合物的方法，该方法包括如下步骤：

(a)将聚氨基葡糖和药物溶解于酸溶液中，

(b)对此混合液作超声处理，同时加入铁盐溶液，从而形成铁/聚氨基葡糖/药物微粒，以及

(c)收集这种微粒。

10.权利要求9的方法，其中的酸溶液是乙酸溶液。

11.权利要求9的方法，其中乙酸溶液的浓度范围为0.1％-15.0％。

12.权利要求9的方法，其中的乙酸溶液是2％的溶液。

13.权利要求9的方法，其中乙酸溶液的pH范围是1.5-6.5。

14.权利要求9的方法，其中乙酸溶液的pH范围是3.9-4.2。

15.权利要求9的方法，其中的铁盐是柠檬酸铁铵。

16.权利要求9的方法，其中所需的药物是孕酮。

17.一种通过权利要求9至16中任一权项的方法制备的口服药物投递组合物。

18.一种用于对患者口服投递治疗或预防物质的方法，包括一种含有聚氨基葡糖，药剂学可接受的油，以及该治疗或预防物质的组合物。

19.权利要求18的方法，其中的治疗或预防物质选自激素，细胞因子，化学激活因子和生长因子。

20.权利要求18的方法，其中的治疗或预防物质是胰岛素。

21.权利要求18的方法，其中的油是选自canola油、玉米油、花生油、橄榄油、植物油和矿物油。

22.一种用于制备一种组合物的方法，该组合物是用于对动物口服给予治疗或预防物质，该方法包括如下步骤：

(a)制备聚氨基葡糖和治疗或预防物质的混合物，

(b)加入药剂学可接受的油，以便形成一种混合物，以及

(c)将此混合物对动物口服给药。

23.权利要求22的方法，其中的治疗或预防物质选自激素、细胞因子、化学激活因子以及生长因子。

24.权利要求22的方法，其中的治疗或预防物质是胰岛素。

25.权利要求19的方法，其中的油是选自canola油、玉米油、花生油、橄榄油、植物油以及矿物油。

26.一种用于口服给予治疗或预防物质的药物投递组合物，所述组合物是通过权利要求22至25中任一权项的方法制备的。

27.一种含有聚氨基葡糖、糖和药物的口服药物投递组合物。

28.权利要求26的组合物，其是不溶性的。

29.权利要求26的组合物，其在酸性pH中是稳定的。

30.权利要求26的组合物，其中的糖是麦芽糖。

31.权利要求26的组合物，其中的药物是孕酮。

32.一种口服给药的方法，包括对患者给予一种口服组合物，此组合物含有与糖和药物组合的聚氨基葡糖。

33.权利要求32的方法，其中的组合物是不溶性的。

34.权利要求32的方法，其中的组合物在酸性pH中是稳定的。

35.权利要求32的方法，其中的糖是麦芽糖。

36.权利要求32的方法，其中的药物是孕酮。

37.一种制备口服药物投递组合物的方法，该方法包括如下步骤：

(a)制备聚氨基葡糖/糖溶液，

(b)把所需的药物溶解于有机溶剂中，

(c)将(a)和(b)步骤中的形成物混合在一起，

(d)将步骤(c)的混合物冷冻干燥，

(e)在适当的口服赋形剂中重新配制此冷冻干燥的混合液，用于对受试者给药。

38.权利要求37的方法，其中的冷冻干燥混合物被研磨成精细粉末。

39.权利要求37的方法，其中的有机溶剂是丙酮。

40.权利要求37的方法，其中的有机溶剂是乙醇。

41.权利要求37的方法，其中的糖是麦芽糖。

42.权利要求37的方法，其中的药物是孕酮。

43.一种通过权利要求37至42中任一权项的方法制备的口服药物投递组合物。

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