CN108719999A - 一种蛋白质-多酚-多糖共价复合物的制备方法及其应用 - Google Patents
一种蛋白质-多酚-多糖共价复合物的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了食品科学中食品添加剂技术领域的一种蛋白质‑多酚‑多糖共价复合物的制备方法及其应用。所述制备方法为：首先通过碳二亚胺法活化多酚的羧基，使其与多糖反应生成多糖‑多酚共价复合物；再利用漆酶诱导蛋白质与多糖‑多酚共价复合物发生共价交联，形成蛋白质‑多酚‑多糖共价复合物。所述制备方法简单、高效、易于生产，制备的蛋白质‑多酚‑多糖共价复合物具有良好的抗氧化能力和热稳定性，以蛋白质‑多酚‑多糖共价复合物为乳化剂制备β‑胡萝卜素乳状液具有良好的理化稳定性，可广泛应用于食品、药品及化妆品工业等领域。
Description
技术领域
本发明属于食品科学中食品添加剂技术领域，具体涉及一种蛋白质-多酚-多糖共价复合物的制备方法及其应用。
背景技术
多糖广泛分布于动植物和微生物中，其种类众多。作为一种可再生资源，多糖具有成本低廉、生物可降解、无毒环保、功能丰富等优点。少数多糖具有抗氧化、抗病毒以及免疫调节活性等作用。多糖除了具有上述诸多优点外，还具有许多反应活性位点，可以根据需求对其进行改性，获得具有理想生理活性的改性多糖。
多酚类化合物种类众多，包括酚酸类、类黄酮以及1,2-二苯乙烯和木酚素类等。植物多酚具有抗氧化、抗菌消炎、抗病毒、抗癌等活性，另外，植物多酚还有一定的抑制肥胖功能。
蛋白质作为一种重要的营养物质，具有多种功能特性，如水合作用和表面活性等。蛋白质多种重要功能取决于其分子结构多样性。通过物理、化学或酶法改性等方式对蛋白质进行修饰，提高其稳定性并改善其功能特性。酶反应操作简单、条件温和、反应易控、专一性强，是提高蛋白质营养价值、功能特性和感官品质的重要途径。随着酶制剂产业的发展，酶的品种不断增加、品质也逐步改善，其应用范围也更加广泛。
近年来，多有学者致力于多糖-多酚、蛋白质-多酚、蛋白质-多糖，蛋白质-多糖-多酚共价复合物制备的研究，现有技术多集中于研究多糖、蛋白质和多酚其中两者之间的共价接枝作用，少有针对蛋白质-多糖-多酚三者共价复合物制备。需要指出的是，目前技术形成的蛋白质-多糖-多酚三者共价复合物从分子作用方式的角度分析，为蛋白质与多糖通过美拉德反应直接作用，多酚位于大分子(蛋白质-多糖)外侧。另外，美拉德反应具体机理尚未完全解释清楚，且副产物多，难以实现产物纯化，获得目标产物。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种蛋白质-多酚-多糖共价复合物的制备方法及其应用。具体技术方案如下：
一种蛋白质-多酚-多糖共价复合物的制备方法：首先通过碳二亚胺法活化多酚的羧基，使其与多糖反应生成多糖-多酚共价复合物；再利用漆酶诱导蛋白质与多糖-多酚共价复合物发生共价交联，形成蛋白质-多酚-多糖共价复合物，具体步骤为：
(1)将多酚、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺加入到无水乙醇中，4℃搅拌1-2h，获得活化多酚乙醇溶液；然后将活化多酚乙醇溶液与pH6.0多糖水溶液混合，调节混合溶液pH值为6.0，4℃搅拌0.5-1.5h，随后升温至25℃继续搅拌反应22-26h；采用透析、离心、再透析的方法对产物进行纯化，然后冷冻干燥，获得多糖-多酚共价复合物；
(2)蛋白质和多糖-多酚共价复合物分别溶解于pH 5.0磷酸盐缓冲液，混合两者，然后加入漆酶，于20℃-40℃反应2-3h，反应结束后灭酶、透析、冷冻干燥，获得蛋白质-多酚-多糖共价复合物。
所述多糖为壳聚糖、海藻酸钠、菊粉、透明质酸、羧甲基纤维素、羧甲基壳聚糖、肽聚糖或肝素；
所述多酚为阿魏酸、绿原酸、香草酸、没食子酸、肉桂酸或咖啡酸；
所述蛋白质为β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、乳铁蛋白、酪蛋白、酪蛋白酸钠、大豆蛋白、花生蛋白、血清蛋白、卵蛋白、胶原蛋白、明胶或丝素蛋白。
步骤(1)中所述多糖用量为2-10g/L，多酚用量为3-15g/L，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的总量与多酚摩尔比为1:1-3:1；
步骤(2)中所述多糖-多酚共价复合物用量为2-15g/L，蛋白质用量为5-20g/L；所述漆酶为白腐菌漆酶，其用量为2U/mL-10U/mL。
步骤(1)所述透析、离心、再透析的方法具体为：将混合溶液置于12-14kDa透析袋中，用去离子水透析22-26h；再将透析袋内混合溶液4500rpm离心1-1.5h，上清液置于12-14kDa透析袋中，用去离子水透析45-50h。
步骤(1)中所述混合溶液中乙醇的体积分数为20％-35％；步骤(2)中采用85℃加热1min进行灭酶处理。
所述的蛋白质-多酚-多糖共价复合物在制备β-胡萝卜素乳状液中的应用，所述β-胡萝卜素乳状液的制备方法为：将蛋白质-多酚-多糖共价复合物溶解于pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，形成质量分数为0.2％-1.2％的水相；β-胡萝卜素溶解于植物油中，形成质量分数为5％的油相；按照水相与油相质量比9:1混合，8000-12000rpm高速剪切5-10min，再进行高压均质，获得β-胡萝卜素含量为0.25％的乳状液。
所述高压均质方式为：在温度为40℃-80℃条件下，采用两级均质阀加压，一级均质压力40-60MPa，二级均质压力4-6MPa，均质循环1-5次。
本发明的有益效果为：
(1)本发明通过化学改性在几乎不破坏多酚酚羟基的前提下将多糖和多酚进行进行共价接枝，再利用酶法改性将多糖-多酚与蛋白质进行定向共价接枝，形成结构可控的多糖-多酚-蛋白质共价复合物。具体地，利用一些多酚除含有典型酚羟基，还含有羧基，通过碳二亚胺法活化多酚的羧基，使其与多糖的氨基或伯羟基发生酰胺化反应或酯化反应，形成多糖-多酚共价复合物，该共价复合物具有抗氧化能力，其持水力、乳化性也得到提高；利用酶法使蛋白质和多糖-多酚共价复合物发生共价交联反应，将蛋白质、多酚和多糖三者的功能特性进行整合，合成具有优良性能的生物大分子，并减少副产物的生成。本发明制备新型“三明治结构”多糖-多酚-蛋白质共价复合物的方法简单、高效、易于生产。
(2)制备的蛋白质-多酚-多糖共价复合物具有良好的抗氧化能力和热稳定性，可将其应用到食品、药物或功能活性成分的传递系统中，并广泛应用于食品、药品及化妆品工业等领域。以蛋白质-多酚-多糖共价复合物为乳化剂制备的β-胡萝卜素乳状液具有良好的理化稳定性，在常温贮藏和光照加速过程中β-胡萝卜素的保留率高于以蛋白质为乳化剂制备的乳状液中β-胡萝卜素的保留率。
附图说明
图1为蛋白质-多酚-多糖共价复合物的制备方法及其应用的流程图。
图2为25℃贮藏条件下β-乳球蛋白和β-乳球蛋白-阿魏酸-壳聚糖共价复合物制备的β-胡萝卜素乳状液中β-胡萝卜素含量随时间变化图。
图3为光照条件下β-乳球蛋白和β-乳球蛋白-阿魏酸-壳聚糖共价复合物制备的β-胡萝卜素乳状液中β-胡萝卜素含量随时间变化图。
具体实施方式
以下实施例便于更好地理解本发明。
本发明的蛋白质-多酚-多糖共价复合物的制备方法及其应用，其流程图如图1所示。
实施例1
β-乳球蛋白-阿魏酸-壳聚糖共价复合物的制备方法，步骤如下：
(1)将0.50g壳聚糖分散于70mL去离子水中，将壳聚糖溶液调节至pH 6.0，溶胀过夜，使其充分溶解。将1.20g阿魏酸、2.38g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1.43g N-羟基琥珀酰亚胺加入30mL无水乙醇中，4℃搅拌1h获得混合溶液。将壳聚糖溶液加入上述混合溶液中，4℃搅拌1h，随后，升温至25℃继续搅拌反应24h。将反应产物置于12kDa透析袋中，用去离子水透析24h；再将透析袋内混合溶液4500rpm离心1h，上清液置于12kDa透析袋中，用去离子水透析48h。然后冷冻干燥，得到阿魏酸含量为8.32wt％壳聚糖-阿魏酸共价复合物。
(2)将0.40gβ-乳球蛋白、0.40g壳聚糖-阿魏酸共价复合物分别溶解于20mL pH5.0磷酸盐缓冲液中，溶胀过夜，其充分溶解。将β-乳球蛋白溶液和壳聚糖-阿魏酸共价复合物溶液均匀混合，向混合溶液中加入4U/mL的漆酶，25℃条件下反应2h，85℃加热1min进行灭酶。透析、冷冻干燥，获得β-乳球蛋白-阿魏酸-壳聚糖共价复合物。
采用差示扫描量热法测量β-乳球蛋白、壳聚糖-阿魏酸和β-乳球蛋白-阿魏酸-壳聚糖共价复合物的热变性温度，结果如表1所示。
表1β-乳球蛋白、壳聚糖-阿魏酸和β-乳球蛋白-阿魏酸-壳聚糖共价复合物热变性温度和热焓的比较
从表1可知，β-乳球蛋白-阿魏酸-壳聚糖共价复合物的变性温度高于β-乳球蛋白的变性温度，说明β-乳球蛋白与壳聚糖-阿魏酸共价复合物形成β-乳球蛋白-阿魏酸-壳聚糖共价复合物后，热稳定性得到明显提高。
实施例2
乳铁蛋白-绿原酸-壳聚糖共价复合物的制备方法，步骤如下：
(1)将0.50g壳聚糖分散于70mL去离子水中，将壳聚糖溶液调节至pH 6.0，溶胀过夜，使其充分溶解。将14.19g绿原酸、2.38g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1.43gN-羟基琥珀酰亚胺加入30mL无水乙醇中，4℃搅拌1h获得混合溶液。将壳聚糖溶液加入上述混合溶液中，4℃搅拌1h。随后，升温至25℃继续搅拌反应24h。将反应产物置于12kDa透析袋中，用去离子水透析24h；再将透析袋内混合溶液4500rpm离心1h，上清液置于12kDa透析袋中，用去离子水透析48h。然后冷冻干燥，得到得到绿原酸含量为11.32wt％壳聚糖-绿原酸共价复合物。
(2)将0.40g乳铁蛋白、0.40g壳聚糖-绿原酸共价复合物分别溶解于20mL pH 5.0磷酸盐缓冲液中，溶胀过夜，使其充分溶解。将β-乳球蛋白溶液和壳聚糖-阿魏酸共价复合物溶液均匀混合，向混合溶液中加入2U/mL的漆酶，30℃条件下反应2h，85℃加热1min进行灭酶。透析、冷冻干燥，获得乳铁蛋白-绿原酸-壳聚糖共价复合物。
实施例3
α-乳白蛋白-绿原酸-海藻酸钠共价复合物的制备方法，步骤如下：
(1)将0.50g海藻酸钠分散于70mL去离子水中，将海藻酸钠溶液调节至pH 6.0，溶胀过夜，使其充分溶解。将0.88g绿原酸、0.96g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.58g N-羟基琥珀酰亚胺加入30mL无水乙醇中，4℃搅拌1h获得混合溶液。将海藻酸钠溶液加入上述混合溶液中，4℃搅拌1h。随后，升温至25℃，继续搅拌反应24h。将反应产物置于12kDa透析袋中，用去离子水透析24h；再将透析袋内混合溶液4500rpm离心1h，上清液置于12kDa透析袋中，用去离子水透析48h。然后冷冻干燥，得到绿原酸含量为7.19wt％海藻酸钠-绿原酸共价复合物。
(2)将0.40gα-乳白蛋白、0.40g海藻酸钠-绿原酸共价复合物分别溶解于20mL pH5.0磷酸盐缓冲液中，溶胀过夜，使其充分溶解。将α-乳白蛋白溶液和海藻酸钠-绿原酸共价复合物溶液均匀混合，向混合溶液中加入6U/mL的漆酶，40℃条件下反应2h，85℃加热1min进行灭酶。透析、冷冻干燥，获得α-乳白蛋白-绿原酸-海藻酸钠共价复合物。
实施例4
β-乳球蛋白-阿魏酸-壳聚糖共价复合物在制备β-胡萝卜素乳状液中的应用，具体为：
将β-乳球蛋白和β-乳球蛋白-阿魏酸-壳聚糖共价复合物复溶于pH 7.0磷酸盐缓冲液(10mM)中，形成浓度为5g/L的蛋白质溶液，溶胀过夜，使其充分溶解形成水相。将30％β-胡萝卜素油悬浮液溶解于中链甘油三酸酯(MCT)(5wt％)中，加热至140℃并搅拌至完全溶解，形成油相。在高速乳化剪切机的剪切作用下缓慢将油相加入到水相中(油相与水相的质量比为9:1)，10000rpm剪切10min，形成粗乳状液。粗乳状液通过高压均质机进一步均质得到β-胡萝卜素乳状液。采用两级均质阀高压均质机，一级均质压力60MPa，二级均质压力6MPa，均质循环3次。将制备的乳状液迅速转移至棕色瓶中，充氮，于4℃下避光保存。
25℃避光贮藏条件下，分别测定β-乳球蛋白和β-乳球蛋白-阿魏酸-壳聚糖共价复合物稳定的β-胡萝卜素乳状液中β-胡萝卜素含量随时间的变化，测定结果如图2所示。由图2可知，在25℃避光贮藏条件下，与β-乳球蛋白稳定的β-胡萝卜素乳状液相比，β-乳球蛋白-阿魏酸-壳聚糖共价复合物稳定的β-胡萝卜素乳状液中β-胡萝卜素具有更高的化学稳定性。
将β-乳球蛋白和β-乳球蛋白-阿魏酸-壳聚糖共价复合物稳定的β-胡萝卜素乳状液置于光照箱中，在光照强度450w/m2，温度40℃条件下进行紫外光持续照射，分别测定β-乳球蛋白和β-乳球蛋白-阿魏酸-壳聚糖共价复合物稳定的β-胡萝卜素乳状液中β-胡萝卜素含量随时间的变化，测定结果如3所示。由图3可知，在紫外光持续照射条件下，与β-乳球蛋白稳定的β-胡萝卜素乳状液相比，β-乳球蛋白-阿魏酸-壳聚糖共价复合物稳定的β-胡萝卜素乳状液中β-胡萝卜素具有更高的化学稳定性。
Claims (7)
1.一种蛋白质-多酚-多糖共价复合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：首先通过碳二亚胺法活化多酚的羧基，使其与多糖反应生成多糖-多酚共价复合物；再利用漆酶诱导蛋白质与多糖-多酚共价复合物发生共价交联，形成蛋白质-多酚-多糖共价复合物，具体步骤为：
(1)将多酚、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺加入到无水乙醇中，4℃搅拌1-2h，获得活化多酚乙醇溶液；然后将活化多酚乙醇溶液与pH 6.0多糖水溶液混合，调节混合溶液pH值为6.0，4℃搅拌0.5-1.5h，随后升温至25℃继续搅拌反应22-26h；采用透析、离心、再透析的方法对产物进行纯化，然后冷冻干燥，获得多糖-多酚共价复合物；
(2)蛋白质和多糖-多酚共价复合物分别溶解于pH 5.0磷酸盐缓冲液，混合两者，然后加入漆酶，于20℃-40℃反应2-3h，反应结束后灭酶、透析、冷冻干燥，获得蛋白质-多酚-多糖共价复合物。
2.根据权利要求1所述的一种蛋白质-多酚-多糖共价复合物的制备方法，其特征在于，所述多糖为壳聚糖、海藻酸钠、菊粉、透明质酸、羧甲基纤维素、羧甲基壳聚糖、肽聚糖或肝素；
所述多酚为阿魏酸、绿原酸、香草酸、没食子酸、肉桂酸或咖啡酸；
所述蛋白质为β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、乳铁蛋白、酪蛋白、酪蛋白酸钠、大豆蛋白、花生蛋白、血清蛋白、卵蛋白、胶原蛋白、明胶或丝素蛋白。
3.根据权利要求1所述的一种蛋白质-多酚-多糖共价复合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述多糖用量为2-10g/L，多酚用量为3-15g/L，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的总量与多酚摩尔比为1:1-3:1；
步骤(2)中所述多糖-多酚共价复合物用量为2-15g/L，蛋白质用量为5-20g/L；所述漆酶为白腐菌漆酶，其用量为2U/mL-10U/mL。
4.根据权利要求1所述的一种蛋白质-多酚-多糖共价复合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述透析、离心、再透析的方法具体为：将混合溶液置于12-14kDa透析袋中，用去离子水透析22-26h；再将透析袋内混合溶液4500rpm离心1-1.5h，上清液置于12-14kDa透析袋中，用去离子水透析45-50h。
5.根据权利要求1所述的一种蛋白质-多酚-多糖共价复合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述混合溶液中乙醇的体积分数为20％-35％；步骤(2)中采用85℃加热1min进行灭酶处理。
6.权利要求1所述的蛋白质-多酚-多糖共价复合物在制备β-胡萝卜素乳状液中的应用，其特征在于，所述β-胡萝卜素乳状液的制备方法为：将蛋白质-多酚-多糖共价复合物溶解于pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，形成质量分数为0.2％-1.2％的水相；β-胡萝卜素溶解于植物油中，形成质量分数为5％的油相；按照水相与油相质量比9:1混合，8000-12000rpm高速剪切5-10min，再进行高压均质，获得β-胡萝卜素含量为0.25％的乳状液。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述高压均质方式为：在温度为40℃-80℃条件下，采用两级均质阀加压，一级均质压力40-60MPa，二级均质压力4-6MPa，均质循环1-5次。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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