CN115895291B - 一种鲜亮红曲黄色素及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鲜亮红曲黄色素及其制备方法与应用。本发明通过将红曲黄色素和蛋白质配制成色素蛋白液，再加入锡盐，得到色素蛋白盐沉淀溶解后再滴加多糖溶液，得到色素蛋白糖液；将槲皮素溶解于乙醇溶液中，再加入锡盐，进行络合反应，得槲皮素盐；将槲皮素盐溶液，滴加入色素蛋白糖液中，得到鲜亮红曲黄色素。该鲜亮红曲黄色素，呈色亮黄，呈色稳定性和染色效果较好，且具有良好的抗氧化和降脂活性。

Description

一种鲜亮红曲黄色素及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于食品添加剂领域，特别涉及一种鲜亮红曲黄色素及其制备方法与应用。

背景技术

红曲色素为红曲霉菌发酵产生的聚酮类次级代谢产物，根据呈色可分为红色素、黄色素、橙色素。天然红曲色素具有生产简便、绿色安全的优点及降血脂、血糖、血压、抗肿瘤、调节肠道微生态等多种功能活性，因而在肉制品、豆腐乳、饮料等食品着色中已有广泛应用。红曲色素在液态发酵过程中根据其溶解性及分泌特性可分为醇溶性和水溶性色素，直接发酵产生大部分都是醇溶性胞内色素，水溶性胞外色素含量很低。其中天然红曲黄色素由于其存在稳定性差、色泽偏暗、着色效果不理想等问题，难以应用于食品着色。目前市售水溶性红曲黄色素是由疏水红曲红色素经磺化还原和碱解开环制得，为半合成色素，显色和稳定性明显较天然色素更优(GB1886.66-2015)。但是，生产过程可能残留的碱解试剂和磺化试剂，使得半合成色素的安全性受到质疑。

因此，急需开发一种改善天然红曲黄色素显色和稳定性的新方法，促进天然红曲黄色素在食品工业中的推广和应用。

发明内容

为了解决现有技术中天然红曲黄色素应用于食品显色和着色效果不理想、易分解褪色的问题，本发明的首要目的在于提供一种鲜亮红曲黄色素的制备方法。

本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的鲜亮红曲黄色素。

本发明的再一目的在于提供上述鲜亮红曲黄色素的应用。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

一种鲜亮红曲黄色素的制备方法，包括以下步骤：

(1)将红曲黄色素和蛋白质充分溶解于缓冲液中，得到色素蛋白液；

(2)往色素蛋白液中加入锡盐，混合均匀，得到色素蛋白盐沉淀；

(3)将色素蛋白盐沉淀溶解于柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲溶液中，边搅拌边滴加多糖溶液，混合均匀，得到色素蛋白糖液；

(4)将槲皮素溶解于乙醇溶液中，再加入锡盐，置于水浴中搅拌进行络合反应，旋转蒸发除去乙醇，过滤除去未反应而析出的槲皮素，冷冻干燥制得槲皮素盐；

(5)配制一定浓度的槲皮素盐溶液，边搅拌边滴加入色素蛋白糖液中，搅拌均匀，冻干，获得色泽亮丽，稳定性的负载红曲黄色素的多酚-蛋白质-多糖复合纳米微粒，即鲜亮红曲黄色素。

步骤(1)中所述的黄色素为天然黄色素。

步骤(1)中所述的蛋白质为牛血清蛋白、酪蛋白、大豆分离蛋白和乳清蛋白中的至少一种。

步骤(1)中所述的天然红曲黄色素和所述的蛋白质优选按质量比1:2～10配比；更优选按质量比1:2～4配比；更优选地按质量比为1:3配比。

步骤(1)中所述的缓冲液优选pH值为2～4的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液；更优选pH值为3.0的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液；最优选通过如下步骤配制得到：将浓度为0.1M的柠檬酸溶液和浓度为0.2M的Na₂HPO₄混合，pH为3.0。

步骤(1)中所述的缓冲液的用量优选按所述的色素蛋白液中色素的浓度为质量百分比0.1～1.0％计算；更优选按所述的色素蛋白液中色素的浓度为质量百分比0.3～0.5％计算；最优选按所述的色素蛋白液中色素的浓度为质量百分比0.4％计算。

步骤(2)中所述的锡盐优选为柠檬酸亚锡二钠。

步骤(2)中所述的锡盐的用量按其在溶液A中的浓度为2.5～25mM计算；更优选按其在溶液A中的浓度为4～6mM计算；最优选按其在溶液A中的浓度为5mM计算。

步骤(2)中所述的混合的转速优选为400～800rpm；更优选为600rpm。

步骤(2)中所述的混合的时间优选为30～90分钟；更优选为60分钟。

步骤(3)中所述的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液优选pH值为7.0～9.0的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液；更优选pH值为7.5的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液。

步骤(3)中所述的多糖优选为壳聚糖。

步骤(3)中所述的多糖的用量优选按多糖：蛋白质＝质量比1：1～3配比计算；更优选按多糖：蛋白质＝质量比1：1～2配比计算。

步骤(3)中所述的混合的转速优选为400～800rpm；更优选为600rpm。

步骤(3)中所述的混合的时间优选为30～60分钟；更优选为40分钟。

步骤(4)中所述的锡盐优选为柠檬酸亚锡二钠。

步骤(4)中所述的槲皮素和所述的锡盐的摩尔比为1:1～2。

步骤(4)中所述的水浴的温度优选为50～90℃；更优选为60℃。

步骤(4)中所述的搅拌的转速优选为400～800rpm；更优选为600rpm。

步骤(4)中所述的反应的时间优选为1～3小时；更优选为2小时。

步骤(5)中所述的槲皮素盐的添加量优选按槲皮素盐和红曲黄色素的质量比为1:10～30计算；更优选按槲皮素盐和红曲黄色素的质量比为1:10～20计算。

一种鲜亮红曲黄色素，通过上述制备方法得到。

所述的鲜亮红曲黄色素在食品染色和/或稳定性评价中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：

(1)本发明以具有两亲性结构的蛋白质为包封材料，采用Sn²⁺为蛋白质沉淀剂，实现红曲黄色素的包封，尤其是水溶性红曲黄色素，结合于蛋白质网络结构中，减少外部不良环境胁迫的影响，提高红曲黄色素的稳定性；同时Sn²⁺可以作为辅色因子和媒染剂提高色素着色效果。

(2)本发明提供的多酚-蛋白质-多糖三元纳米微粒稳定包封体系，特点在于采用槲皮素盐复合物取代单一的酚类物质，通过疏水作用，氢键和共价键与蛋白质中活性位点结合，即能提高纳米微粒结构对外界氧化因子的抵抗作用，也可以作为辅色素与红曲黄色素的聚酮(azaphilonoid)结构发生分子内共色结合，使该复合红曲黄色素最大吸收波长从原来天然红曲黄色素的352nm(紫外光区)红移400～408nm(至可见光区)，明显改善其色泽。

(3)本发明采用Sn²⁺与槲皮素活泼羰基和羟基络合，可以使疏水的槲皮素转为水溶性良好的槲皮素盐复合物，避免使用有机试剂对蛋白质结构的破坏。槲皮素盐复合物的最大紫外吸收波长由375nm红移至435nm，实现天然红曲黄色素的增色效果，而未络合的槲皮素并不能产生增色效应。

(4)本发明通过调节合适的pH，使带正电荷的壳聚糖通过静电作用包裹在带负电荷的蛋白质表面，提高纳米颗粒间的空间位阻，并通过表面静电相斥作用克服单一蛋白质纳米颗粒聚集的问题，制得稳定的亮丽的红曲黄色素纳米级胶体溶液。

(5)蛋白-多糖包封会降低天然色素的生物活性。本发明通过在红曲黄色素-蛋白-多糖微粒表面引入具有良好生物活性的槲皮素盐，可以提升色素纳米微粒的抗氧化活性和降脂活性。

(6)本发明提供的制备方法操作简单、方便，试剂均为食品级，避免了对其安全性的质疑，可创制色泽亮丽，稳定性高，健康营养的新型红曲黄色素产品，促进天然功能红曲黄色素在食品工业中的推广和应用。

附图说明

图1为鲜亮红曲黄色素的紫外全波长扫描图谱图。

图2为鲜亮红曲黄色素的色泽比较结果图；其中，A为样品实物图，B为色度分析结果。

图3为鲜亮红曲黄色素的粒径分析结果图。

图4为鲜亮红曲黄色素的微观形态图；其中，(A)-(D)分别为实施例1-4制得的鲜亮红曲黄色素，比例尺为1μm。

图5为鲜亮红曲黄色素在不同环境胁迫下的稳定性分析结果图；其中，A为热处理条件下色价保留率，B为抗坏血酸处理条件下色价保留率，C为光处理条件下色价保留率，D为不同pH处理下粒径变化。

图6为不同pH条件下鲜亮红曲黄色素的显色和紫外全波长扫描图谱分析结果图；其中，A为不同pH条件下色素的实物图；B为不同pH条件下色素的色度变化分析结果；C-G分别为未包封红曲黄色素、实施例1-4制得鲜亮红曲黄色素的紫外全波长扫描图谱。

图7为鲜亮红曲黄色素微乳形态图和粒径分析结果图。

图8为鲜亮红曲黄色素的染色应用分析结果图；其中，A为染色应用实物图，B为染色样品色度分析。

图9为鲜亮红曲黄色素的生物活性分析结果图；其中，A为DPPH自由基清除率分析；B为ABTS自由基清除率分析；C为胆固醇结合率分析；D为胆固醇酯酶抑制率分析。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中所涉及的试剂、方法，如无特殊说明，均为本领域常用的试剂和方法，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

(1)天然红曲黄色素的制备

红曲霉Monascus ruber CGMCC No.10910于2015年7月2日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，已在专利201510449543.6中公开。

红曲霉培养基：

PDA培养基：马铃薯葡萄糖200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15-20g/L，蒸馏水定容，pH自然，121℃灭菌20min。

种子培养基：葡萄糖20g/L,酵母提取粉3g/L，鱼粉蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾4g/L，氯化钾0.5g/L，七水硫酸亚铁0.01g/L，蒸馏水定容，pH自然，121℃灭菌20min。

发酵培养基：葡萄糖150g/L，硝酸钠0-7g/L，硝酸钾0-7g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾5g/L，氯化钾0.5g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，七水合硫酸铁0.01g/L，七水合硫酸锌0.01g/L，一水合硫酸锰0.03g/L，蒸馏水定容，pH自然，121℃灭菌20min。

红曲霉培养：

菌种活化：将保藏于-80℃甘油管的菌种取出，室温下解冻接种于种子液培养基中，置于30℃、180rpm的摇床下培养24-28h活化，活化后划线于PDA培养基中30℃培养箱培养7d，培养后的种子平板保存于4℃冰箱14天内备用。

种子液培养：将种子平板中的刮取8个红曲霉单菌落(直径约1cm)到含有50ml种子液培养基的250ml三角烧瓶中，30℃、180rpm的条件摇床培养24-28h，种子液培养12h后的每30min将贴壁于三角瓶壁上的菌丝体摇落回培养基中。

发酵培养：按8％(v/v)的接种量接种培养好的种子液于含有50mL发酵培养基的250mL三角烧瓶中，30℃、180rpm的条件下摇床培养10天。

发酵完成后，收集全部50mL发酵液，使用0.8μm孔径大小的纤维素酯混合滤膜进行抽滤，分离得到发酵滤液为天然亲水红曲黄色素，在制备鲜亮红曲黄色素时应用。

(2)水溶性壳聚糖购自于山东卫康生物医药有限公司。

实施例1

本实施例提供一种鲜亮红曲黄色素的制备方法：

(1)配置0.1M(M为mol/L的缩写)的柠檬酸溶液和0.2M的Na₂HPO₄溶液，适当比例混合使其pH为3.0；

(2)将天然红曲黄色素加入到步骤(1)制备得到的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液中，充分溶解，得到质量百分比为0.4％的红曲黄色素溶液；继续加入牛血清蛋白，600转/分钟搅拌30分钟，混匀得到红曲黄色素-牛血清蛋白混合液，其中红曲黄色素和牛血清蛋白的质量比为1:3；

(3)向步骤(2)制得的红曲黄色素-牛血清蛋白混合液中添加柠檬酸亚锡二钠(终浓度为5mM)，600转/分钟搅拌60分钟，得到色素蛋白盐沉淀；

(4)配置0.1M的柠檬酸溶液和0.2M的Na₂HPO₄溶液，混合得到pH为7.5的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液。将步骤(3)所得的色素蛋白盐沉淀溶解于10mL柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液中，边搅拌边滴加0.1g/mL的壳聚糖水溶液，控制壳聚糖和蛋白质的质量比为1:2，600转/分钟搅拌40分钟，混合均匀，得到色素-牛血清蛋白-壳聚糖复合物溶液；

(5)将一定质量的槲皮素溶解于体积百分比50％的乙醇溶液中，加入一定质量的柠檬酸亚锡二钠，控制槲皮素和柠檬酸亚锡二钠的摩尔比为1:1，置于60℃水浴，600转/分钟搅拌条件下进行络合反应2小时，旋转蒸发除去乙醇，过滤除去未反应而析出的槲皮素，冷冻干燥制得槲皮素盐；

(6)向步骤(4)制得的色素-牛血清蛋白-壳聚糖复合物溶液中添加步骤(5)制得的槲皮素盐，控制槲皮素亚锡和红曲黄色素的质量比为1:10，600转/分钟搅拌30分钟，冷冻干燥，获得色泽亮丽，稳定性好的负载红曲黄色素的槲皮素盐-蛋白质-多糖复合纳米微粒。

实施例2

本实施例提供一种鲜亮红曲黄色素的制备方法：

(1)配置0.1M的柠檬酸溶液和0.2M的Na₂HPO₄溶液，适当比例混合使其pH为3.0；

(2)将红曲黄色素加入到步骤(1)制备得到的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液中，充分溶解，得到质量百分比为0.4％的红曲黄色素溶液；继续加入牛血清蛋白，600转/分钟搅拌30分钟，混匀得到红曲黄色素-牛血清蛋白混合液，其中红曲黄色素和牛血清蛋白的质量比为1:3；

(3)向步骤(2)制得的红曲黄色素-牛血清蛋白混合液中添加柠檬酸亚锡二钠(终浓度为5mM)，600转/分钟搅拌60分钟，得到色素蛋白盐沉淀；

(4)配置0.1M的柠檬酸溶液和0.2M的Na₂HPO₄溶液，混合得到pH为7.5的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液。将步骤(3)所得的色素蛋白盐沉淀溶解于10mL柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液中，边搅拌边滴加0.1g/mL的壳聚糖水溶液，控制壳聚糖和蛋白质的质量比为1:2，600转/分钟搅拌40分钟，混合均匀，得到色素-牛血清蛋白-壳聚糖复合物溶液；

(5)将一定质量的槲皮素溶解于体积百分比50％乙醇溶液中，加入一定质量的柠檬酸亚锡二钠，控制槲皮素和柠檬酸亚锡二钠的摩尔比为1:2，置于60℃水浴，600转/分钟搅拌条件下进行络合反应2小时，旋转蒸发除去乙醇，过滤除去未反应而析出的槲皮素，冷冻干燥制得槲皮素盐；

(6)向步骤(4)制得的色素-牛血清蛋白-壳聚糖复合物溶液中添加步骤(5)制得的槲皮素盐，控制槲皮素亚锡和红曲黄色素的质量比为1:20，600转/分钟搅拌30分钟，冷冻干燥，获得色泽亮丽，稳定性好的负载红曲黄色素的槲皮素盐-蛋白质-多糖复合纳米微粒。

实施例3

本实施例提供一种鲜亮红曲黄色素的制备方法：

(1)配置0.1M的柠檬酸溶液和0.2M的Na₂HPO₄溶液，适当比例混合使其pH为3.0；

(2)将红曲黄色素加入到步骤(1)制备得到的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液中，充分溶解，得到质量百分比为0.4％的红曲黄色素溶液；继续加入牛血清蛋白，600转/分钟搅拌30分钟，混匀得到红曲黄色素-牛血清蛋白混合液，其中红曲黄色素和牛血清蛋白质量比为1:3；

(3)向步骤(2)制得的红曲黄色素-牛血清蛋白混合液中添加柠檬酸亚锡二钠(终浓度为5mM)，600转/分钟搅拌60分钟，得到色素蛋白盐沉淀

(4)配置0.1M的柠檬酸溶液和0.2M的Na₂HPO₄溶液，混合得到pH为7.5的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液。将步骤(3)所得的色素蛋白盐沉淀溶解于10mL柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液中，边搅拌边滴加0.1g/mL的壳聚糖水溶液，控制壳聚糖和蛋白质的质量比为1:2，600转/分钟搅拌40分钟，混合均匀，得到色素-牛血清蛋白-壳聚糖复合物溶液；

(5)将一定质量的槲皮素溶解于体积百分比50％的乙醇溶液中，加入一定质量的柠檬酸亚锡二钠，控制槲皮素和柠檬酸亚锡二钠的摩尔比为1:2，置于60℃水浴，600转/分钟搅拌条件下进行络合反应2小时，旋转蒸发除去乙醇，过滤除去未反应而析出的槲皮素，冷冻干燥制得槲皮素盐；

(6)向步骤(4)制得的色素-牛血清蛋白-壳聚糖复合物溶液中添加步骤(5)制得的槲皮素盐，控制槲皮素亚锡和红曲黄色素的质量比为1:25，600转/分钟搅拌30分钟，冷冻干燥，获得色泽亮丽，稳定性好的负载红曲黄色素的槲皮素盐-蛋白质-多糖复合纳米微粒。

实施例4

本实施例提供一种鲜亮红曲黄色素的制备方法：

(1)配置0.1M的柠檬酸溶液和0.2M的Na₂HPO₄溶液，适当比例混合使其pH为3.0；

(2)将红曲黄色素加入到步骤(1)制备得到的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液中，充分溶解，得到质量百分比为0.4％的红曲黄色素溶液；继续加入牛血清蛋白，600转/分钟搅拌30分钟，混匀得到红曲黄色素-牛血清蛋白混合液，其中红曲黄色素和牛血清蛋白的质量比为1:3；

(3)向步骤(2)制得的红曲黄色素-牛血清蛋白混合液中添加柠檬酸亚锡二钠(终浓度为5mM)，600转/分钟搅拌60分钟，得到色素蛋白盐沉淀；

(4)配置0.1M的柠檬酸溶液和0.2M的Na₂HPO₄溶液，混合得到pH为7.5的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液。将步骤(3)所得的色素蛋白盐沉淀溶解于10mL柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液中，边搅拌边滴加0.1g/mL的壳聚糖水溶液，控制壳聚糖和蛋白质的质量比为1:2，600转/分钟搅拌40分钟，混合均匀，得到色素-牛血清蛋白-壳聚糖复合物溶液；

(5)将一定质量的槲皮素溶解于体积百分比50％乙醇溶液中，加入一定质量的柠檬酸亚锡二钠，控制槲皮素和柠檬酸亚锡二钠的摩尔比为1:2，置于60℃水浴，600转/分钟搅拌条件下进行络合反应2小时，旋转蒸发除去乙醇，过滤除去未反应而析出的槲皮素，冷冻干燥制得槲皮素盐；

(6)向步骤(4)制得的色素-牛血清蛋白-壳聚糖复合物溶液中添加步骤(5)制得的槲皮素盐，控制槲皮素亚锡和红曲黄色素的质量比为1:30，600转/分钟搅拌30分钟，冷冻干燥，获得色泽亮丽，稳定性好的负载红曲黄色素的槲皮素盐-蛋白质-多糖复合纳米微粒。

物理化学指标测定：

(1)紫外特征吸收分析：

称取适量实施例1～4制得的鲜亮红曲黄色素，溶解于纯水中配制成色价浓度约为1.0AU/mL的色素胶体溶液，采用紫外-可见分光光度计(UV-2802S，尤尼柯(上海)仪器有限公司，中国)测定样品的紫外特征吸收图谱，记录最大紫外吸收波长λmax。

(2)色度分析：

称取适量实施例1-4制得的鲜亮红曲黄色素，溶解于纯水中配制成色价浓度约为3.0AU/mL的色素胶体溶液，采用色差仪(CR-400，Konica minolta，日本)分析鲜亮红曲黄色素冻干粉和胶体溶液色度，记录b值(正值代表黄色的色度值)。

(3)粒径分析：

称取适量实施例1-4制得的鲜亮红曲黄色素，溶解于纯水中配制成质量浓度约为1.0mg/mL的色素胶体溶液，采用纳米激光粒度仪(Mastersizer 2000，马尔文仪器有限公司，英国)测定样品溶液的粒径。

(4)表面微观结构分析：

称取实施例1-4制得的鲜亮红曲黄色素冻干样1.0mg，采用扫描电镜(Merlin，Zeiss公司,德国)分析样品的表面微观结构。

(5)热稳定性分析：

称取适量实施例1-4制得的鲜亮红曲黄色素，溶解于纯水中配制成色价浓度约为2.0AU/mL的色素胶体溶液，置于90℃水浴加入4小时，间隔1小时取样，采用紫外-可见分光光度计测定色价变化，计算色素的保留率。

(6)光稳定性分析：

称取适量实施例1-4制得的鲜亮红曲黄色素，溶解于纯水中配制成色价浓度约为2.0AU/mL的色素胶体溶液，置于白光灯(光强为5000lx)照射4天，间隔1天取样，采用紫外-可见分光光度计测定色价变化，计算色素的保留率。

(7)抗坏血酸稳定性分析：

称取适量实施例1-4制得的鲜亮红曲黄色素，溶解于纯水中配制成色价浓度约为1.0AU/mL的色素胶体溶液，加入抗坏血酸混匀，控制抗坏血酸的终浓度为0.25、0.5、1.0mg/mL，放置室温1天后采用紫外-可见分光光度计测定色价变化，计算色素的保留率。

(8)pH稳定性分析：

配置0.1M的柠檬酸溶液和0.2M的Na₂HPO₄溶液，混合分别得到pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液。称取适量实施例1-4制得的鲜亮红曲黄色素10mg，分别溶解于不同pH的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲溶液中，采用色差仪分析色素溶液色度，采用紫外-可见分光光度计分析紫外特征光谱，采用激光粒度仪分析粒径的变化。设置化学红曲黄色素(购自广东天益生物科技有限公司)作为显色对照。

(9)油分散性分析：

称取适量实施例1-4制得的鲜亮红曲黄色素，溶解于纯水中配制成2％(w/v)的红曲黄色素复合物胶体溶液。配制有机相混合物(96％橄榄油，4％聚甘油蓖麻醇酸酯，v/v，食品级)，添加到红曲黄色素复合物胶体溶液中，使两者体积比为1:9，使用高速剪切机(UltraTuraax T25,IKA Labortechnik,Staufen,Germany)在10,000rpm下搅拌3分钟形成预乳液(90％水相和10％有机相)。在30℃、280W超声处理10min(AS20500ATH，天津自动科学仪器有限公司，中国)下进一步均匀化。

采用质量浓度为0.02％尼罗红染料对色素复合乳液进行染色，避光处理30分钟后，加入适量的水稀释，于激光共聚焦扫描显微镜(LSM710,Zeiss，德国)下观察乳液的微观形态。采用激光粒度仪分析粒径的变化。

应用例：

称取适量实施例1-4制得的鲜亮红曲黄色素，溶解于纯水中配制成色价浓度约为5.0AU/mL的色素胶体溶液各50mL，放入体积小大相近的鹌鹑蛋，置于90℃水浴加入1小时，取出记录染色情况，并采用色差仪测定蛋白部分的色度。设置化学红曲黄色素作为染色对照。

图1总结了鲜亮红曲黄色素的紫外全波长扫描图谱。天然红曲黄色素的λmax为352nm，在紫外光区，呈荧光黄色。槲皮素盐-牛血清蛋白-壳聚糖包封处理可使天然红曲黄色素的λmax红移至可见光区(400nm以上)，而且槲皮素盐的添加量越高，增色效应越强。

图2展示了鲜亮红曲黄色素的色度分析结果。与未包封的黄色素相比，鲜亮红曲黄色素的b值明显提高，说明槲皮素盐使色素变得更鲜艳，结果与增色效应相符。

图3展示了鲜亮红曲黄色素的粒径分析结果。本发明制得鲜亮红曲黄色素的粒径为252-382nm。

图4展示了鲜亮红曲黄色素的表观形态分析结果。随着槲皮素盐添加量提高，通过疏水作用和共价结合使色素复合纳米微粒更容易聚集，提高纳米微粒的粒径。

图5展示了鲜亮红曲黄色素对不同环境因子变化的稳定性分析结果。食品的加工和灭菌一般在90℃的热处理下进行。如图5中A所示，经过热处理4h，天然红曲黄色素的保留率为46.13％，而实施例1-4制得的红曲黄色素纳米颗粒的保留率分别为74.39％、72.46％、64.68％和62.72％，说明鲜亮红曲黄色素具有更好的热稳定性。抗坏血酸作为一种常见的添加剂，通常用于食品保鲜。然而在加工和储存过程中，抗坏血酸自氧化产生H₂O₂，对天然色素有一定程度的降解。如图5中B所示，天然红曲黄色素在不同抗坏血酸浓度(0、0.25、0.5和1.0mg/mL)下色价保留率分别为89.73％、79.35％、65.35％和65.40％，而黄色素纳米颗粒的色价保留率更高，在抗坏血酸为1.0mg/mL条件下，实施例1-4制得的红曲黄色素纳米颗粒的色价保留率分别为89.32％、83.45％、74.62％和71.61％。此外，光照处理4天后，与未包封的天然红曲黄色素(74.00％)相比，实施例1-4制得红曲黄色素纳米颗粒的色价的保留率分别为83.18％、80.77％、80.26％和80.65％，说明了红曲黄色素纳米颗粒具有更优的光稳定性(图5中C)。天然红曲黄色素的显色随着环境pH变化而变化。此外，单一蛋白质包封材料容易在等电点条件下聚集沉淀。本发明采用带正电荷的壳聚糖溶液通过静电作用结合到带负电荷的蛋白质表面，通过空间位阻和同电相斥使其保持分散均匀的胶体溶液。如图5中D所示，在pH为6.0时红曲黄色素纳米颗粒的粒径最小。在pH 5.0～8.0条件下红曲黄色素纳米颗粒的粒径维持在250～400nm，当pH3.0～4.0时，尽管粒径增大至400～600nm，红曲黄色素纳米颗粒仍保持均匀的胶体溶液。

图6总结了各色素在不同pH条件下的显色变化情况。随着pH从3.0升高至8.0，天然红曲黄色素显色从黄色转变为黄褐色，色调变暗，色度和紫外全波长扫描图谱也明显改变，说明天然红曲黄色素为pH敏感型色素。而环境pH变化对实施例1-4制得红曲黄色素纳米颗粒的显色，色度值和紫外全波长扫描图谱变化较未包封色素程度低。这说明，槲皮素盐-牛血清蛋白-壳聚糖包封处理不仅能改善红曲黄色素的色泽，而且能提高红曲黄色素的物理化学和显色稳定性。

图7展示了鲜亮红曲黄色素微乳形态图和粒径分析结果。槲皮素盐-牛血清蛋白-壳聚糖包封体系既提供了疏水的多酚结构，也提供了亲水的多糖链结构，可以作为良好的乳化剂，使复合物稳定均匀分散在油相中，形成粒径为1-3μm的乳液，扩大了亲水黄色素在疏水环境的应用。

图8展示了天然红曲黄色素及其复合纳米颗粒的染色应用。如图8中A所示，天然红曲黄色素染色后鹌鹑蛋白显褐色，而实施例1-4制得红曲黄色素纳米颗粒染色后蛋白显亮黄色。随着槲皮素盐的添加量提高，色素染色效果更好，实施例1制得色素染色效果与化学红曲黄色素(购自广东天益生物科技有限公司)相当。图8中B测定的色度值也表明槲皮素盐-牛血清蛋白-壳聚糖包封处理可以有效提高红曲黄色素的色泽和染色效果。

已有研究表明蛋白-多糖包封会降低天然色素的生物活性。如图9所示，与天然红曲黄色素相比，实施例1-4制得红曲黄色素纳米微粒的氧化自由基清除率，胆固醇结合率和胆固醇酯酶抑制率更高，说明通过在红曲黄色素-蛋白-多糖微粒表面引入具有良好生物活性的槲皮素盐，可以明显提升抗氧化活性和降脂活性。

综上所述，本发明提出一种创制色泽亮丽，稳定性高，健康营养的新型红曲黄色素产品的制备方法，有助于促进天然功能红曲黄色素在食品工业中的推广和应用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种鲜亮红曲黄色素的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将红曲黄色素和蛋白质加入缓冲液中充分溶解，得到色素蛋白液；

（2）往色素蛋白液加入锡盐，混合均匀，析出色素蛋白盐沉淀；

（3）将色素蛋白盐沉淀加入柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲溶液中溶解，边搅拌边滴加多糖溶液，混合均匀，得到色素蛋白糖液；

（4）将槲皮素溶解于乙醇溶液中，并加入锡盐，于水浴控温搅拌进行络合反应，然后通过旋转蒸发除去乙醇，过滤取滤液冷冻干燥，制得槲皮素盐；

（5）配制槲皮素盐溶液，搅拌下加入色素蛋白糖液中，混合均匀，冷冻干燥，获得鲜亮红曲黄色素；

步骤（1）中所述的蛋白质为牛血清蛋白、酪蛋白、大豆分离蛋白和乳清蛋白中的至少一种；

步骤（2）中所述的锡盐为柠檬酸亚锡二钠；

步骤（3）中所述的多糖为壳聚糖；

步骤（4）中所述的锡盐为柠檬酸亚锡二钠。

2.根据权利要求1所述的鲜亮红曲黄色素的制备方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的黄色素为天然黄色素。

3.根据权利要求1所述的鲜亮红曲黄色素的制备方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的红曲黄色素和所述的蛋白质按质量比1 : 2～10配比；

步骤（1）中所述的缓冲液是pH值为2～4的柠檬酸-Na₂HPO₄ 缓冲液；

步骤（1）中所述的缓冲液的用量按所述的色素蛋白液中色素的浓度为质量百分比0.1～1.0%计算。

4.根据权利要求3所述的鲜亮红曲黄色素的制备方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的红曲黄色素和所述的蛋白质按质量比1 : 2～4配比；

步骤（1）中所述的缓冲液是pH值为3.0的柠檬酸-Na₂HPO₄ 缓冲液；

步骤（1）中所述的缓冲液的用量按所述的色素蛋白液中色素的浓度为质量百分比0.3～0.5%计算。

5.根据权利要求1所述的鲜亮红曲黄色素的制备方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的锡盐的用量按其在加入锡盐后的色素蛋白液中的终浓度为2.5～25mM计算；

步骤（3）中所述的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲溶液是pH值为7.0～9.0的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲溶液；

步骤（3）中所述的多糖的用量是按多糖：蛋白质=质量比1：1～3配比计算；

步骤（4）中所述的槲皮素和所述的锡盐的摩尔比为1:1～2；

步骤（5）中所述的槲皮素盐的添加量按槲皮素盐和红曲黄色素的质量比为1:10～30计算。

6.根据权利要求5所述的鲜亮红曲黄色素的制备方法，其特征在于：

步骤（3）中所述的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲溶液是pH值为7.5的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲溶液；

步骤（3）中所述的多糖的用量按壳多糖：蛋白质=质量比1：1～2配比计算；

步骤（5）中所述的槲皮素盐的添加量按槲皮素盐和红曲黄色素的质量比为1:10～20计算。

7.根据权利要求1所述的鲜亮红曲黄色素的制备方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的混合的转速为400～800rpm；

步骤（2）中所述的混合的时间为30～90 分钟；

步骤（3）中所述的混合的时间为30～60 分钟；

步骤（4）中所述的水浴的温度为50～90℃；

步骤（4）中所述的搅拌的转速为400～800rpm；

步骤（4）中所述的反应的时间为1～3小时。

8.根据权利要求7所述的鲜亮红曲黄色素的制备方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的搅拌的转速为600rpm；

步骤（2）中所述的混合的时间为60 分钟；

步骤（4）中所述的水浴的温度为60 ℃；

步骤（4）中所述的搅拌的转速为600rpm；

步骤（4）中所述的反应的时间为2小时。

9.一种鲜亮红曲黄色素，其特征在于：通过权利要求1～8任一项所述的制备方法得到。

10.权利要求9所述的鲜亮红曲黄色素在食品染色和/或稳定性评价中的应用。