CN113475620A

CN113475620A - 一种玉米醇溶蛋白-多酚共价复合物及其制备方法

Info

Publication number: CN113475620A
Application number: CN202110813359.0A
Authority: CN
Inventors: 魏子淏; 徐雅男; 薛长湖
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2021-07-19
Filing date: 2021-07-19
Publication date: 2021-10-08
Anticipated expiration: 2041-07-19
Also published as: CN113475620B

Abstract

本发明公开了一种制备玉米醇溶蛋白–多酚共价复合物的方法，属于食品科学和食品加工技术领域。本发明以玉米醇溶蛋白和植物多酚为原料，采用碳二亚胺介导的偶联法在乙醇‑水溶液中构建了玉米醇溶蛋白–多酚共价复合物。所述制备方法具有简单、高效和安全的特点。与对照玉米醇溶蛋白相比，所制备的玉米醇溶蛋白–多酚共价复合物具有更好的热稳定性和溶解性，且共价复合物的抗氧化性得到了显著的提升。本发明产品可以作为功能性食品添加剂，也可以用于构建新型的递送系统。此外，本方法制备的玉米醇溶蛋白–多酚共价复合物仍然保持蛋白原有的淡黄色，更易于被消费者接受，有利于扩大其应用范围。

Description

一种玉米醇溶蛋白-多酚共价复合物及其制备方法

技术领域

本专利具体涉及一种玉米醇溶蛋白–多酚共价复合物的制备方法，属于食品科学和食品加工技术领域。

背景技术

玉米醇溶蛋白(zein)是一种从玉米种子中分离出来的天然植物蛋白，商业中主要使用的是α-玉米醇溶蛋白，分子量约为22 kDa。玉米醇溶蛋白具有良好的生物降解性和生物相容性，常被用于构建递送系统，输送生物活性物质。玉米醇溶蛋白分子中存在着大量的非极性氨基酸和α-螺旋结构，导致其具有较强的表面疏水性，且几乎不溶于水。此外，天然的玉米醇溶蛋白抗氧化性较弱。玉米醇溶蛋白较低的水溶性和抗氧化性可能会限制其在食品中的应用。近年来，有大量研究表明在蛋白上共价接枝多酚可以改善蛋白的溶解性和抗氧化性。植物多酚是植物次生代谢产物，也是目前最受关注的天然抗氧化剂。此外，多酚还具有抗炎、抗病毒和抗癌等多种有益功效，所以适量的多酚对人体健康是有益的。目前，对于玉米醇溶蛋白和多酚之间的非共价作用的研究已较为透彻，但是很少有关于玉米醇溶蛋白和多酚之间共价反应的研究，且现有的制备zein–多酚共价复合物的方法为碱法，原理是基于多酚的氧化，会导致产物具有较深的颜色

如以下专利所示：申请号：202011178964.7，公开号为CN112121178A，发明名称“一种水溶性玉米醇溶蛋白–EGCG共价复合物及其制备和应用”，公开了一种制备玉米醇溶蛋白–表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)共价复合物的方法，制备方法如下：(1)将玉米醇溶蛋白、EGCG分散在水中形成混合体系，然后调节pH至11.0–13.0进行缩合反应；(2)反应结束后，利用透析袋分离，将透析后的溶液进行干燥，即得玉米醇溶蛋白–EGCG共价复合物。

文章《A comparative study of covalent and non-covalent interactionsbetween zein and polyphenols in ethanol-water solution》合成了玉米醇溶蛋白与EGCG、绿原酸(CA)和槲皮素(Q)的共价复合物。主要步骤如下：将1 g玉米醇溶蛋白溶解于50mL 70% (v/v)乙醇-水溶液中，然后用0.1 mol/L NaOH 调节pH至9.0。为了制备玉米醇溶蛋白–多酚共价复合物，将0.2 g单个多酚(EGCG,CA 或Q)溶解在50 mL 70% (v/v)乙醇-水溶液中，调节pH至9.0。然后将这两种溶液混合在一起，25℃下暴露于空气中反应。24小时后，样品置于超声浴中，换70% (v/v)乙醇-水溶液10次，透析24小时，以去除游离多酚，最后冻干获得多孔固体。在此基础上，在pH 7.0、无氧条件下制备了非共价玉米醇溶蛋白–多酚复合物。

发明内容

本发明提供了一种玉米醇溶蛋白–多酚共价复合物的新型制备方法，采用碳二亚胺介导的偶联反应将多酚共价接枝到玉米醇溶蛋白上。

本发明提供的玉米醇溶蛋白–多酚共价复合物的制备方法，包括下列步骤：

1）称取一定量的玉米醇溶蛋白溶于70% (v/v)的乙醇-水溶液中，超声5 min，200rpm搅拌30 min，使其完全溶解。

2）称取一定量多酚溶于70% (v/v)的乙醇-水溶液中，超声5 min，200 rpm搅拌30min使其完全溶解；

3）在4℃下，向步骤2）的多酚溶液中加入一定量的EDC，随后加入一定量的NHS，隔绝氧气连续搅拌(300 rpm)反应0.5–2 h；

4）将步骤3）的多酚溶液缓慢加入步骤1）的玉米醇溶蛋白溶液中，将pH调至5–7，在连续搅拌的条件下(300 rpm)，4℃，隔绝氧气反应1 h，之后25℃下反应24 h；

5）在反应过程中，每隔四个小时测量反应液的pH，通过加入NaOH (0.1 M)和HCl(0.1 M)维持pH在固定值；

6）反应结束后，将混合物过超滤装置，将超滤得到的液体置于超声中透析。

7）将透析后的样品用纳米研磨机处理，经预冻，冷冻干燥后得到玉米醇溶蛋白–多酚共价复合物。

优选的，所述步骤1）混合体系中玉米醇溶蛋白的浓度为5 mg/mL–25 mg/mL。步骤2）中多酚的浓度为2–30 mmol/L。所述步骤4）混合体系中玉米醇溶蛋白与多酚的质量比为1.5:1–10:1。

通过上述合理设定玉米醇溶蛋白的浓度和多酚的浓度，玉米醇溶蛋白和多酚的质量比可能会影响多酚在蛋白上的接枝率，如果多酚量太少的话接枝率较低，但是能与玉米醇溶蛋白共价结合的多酚是有限的，考虑经济因素，多酚的量不能太多，因为与蛋白相比，多酚价格较高。

另外，EDC的用量也会影响反应结果，用量过多可能会导致蛋白自身的交联，太少会导致偶联效率低。

优选的，EDC的量为多酚添加量的1–5倍，NHS的添加量为多酚的1–3倍。进一步的，EDC的量为多酚添加量的3倍，NHS的添加量为多酚的2倍，此处所述的添加量为摩尔量。

公开号为CN112121178A，发明名称“一种水溶性玉米醇溶蛋白–EGCG共价复合物及其制备和应用”，虽然也公开了一种玉米醇溶蛋白–EGCG共价复合物，但是其方法制备出的共价复合物多酚含量比较低。

目前已有用EDC/NHS法制备多糖–多酚共价复合物的文献，例如现有技术中公开了的文献名称为《Grafting of gallic acid onto chitosan enhances antioxidantactivities and alters rheological properties of the copolymer》。该文献将壳聚糖(CS)(0.303 g，1.85 mmol)与HOBt (0.282 g，1.85 mmol)在去离子水(30.0 mL)中搅拌过夜，直至得到清澈的溶液。在CS溶液中加入GA (0.311 g，1.85 mmol)，然后滴加2.0 mL的EDC.HCl乙醇溶液(0.355 g，1.85 mmol)。反应在常温常压下进行，反应时间为24 h。将生成的液体倒入分子量为3500 Da的透析管中，在去离子水中透析48 h，共更换8次去离子水，将所得溶液冷冻干燥，得到GA–g–CS固体共聚物。

上述文献的方法与本专利的不同点主要有：

（1）用了HOBt（羟基苯并三唑），HOBt的羟基和蛋白质的氨基之间存在着强烈的离子键和氢键，这会降低蛋白质的氨基与多酚活性基团之间的共价相互作用。

（2）没有加NHS，会导致较多的副反应发生。

（3）多酚的用量较高，成本高。

现有技术文献《Amphiphilic carboxymethyl chitosan-quercetin conjugatewith P-gp inhibitory properties for oral delivery of paclitaxel》也公开了类似的方法，将0.4 g羧甲基壳聚糖(CMCS)溶解于20 mL蒸馏水中，将槲皮素(Qu)溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，在冰浴和连续搅拌下，将其滴加到CMCS溶液中。然后在混合液中加入DMAP（反应物质量的5%）、EDC和NHS（EDC和NHS的摩尔比为1:1.4）。30 min后，将反应移至室温，并在黑暗中搅拌24小时。反应结束时，反应混合物在丙酮中沉淀并过滤。过滤后的固体样品依次用丙酮和无水乙醇仔细清洗，除去游离的槲皮素，将清洗过的样品在真空下干燥。将干燥后的样品用去离子水溶解，在冰浴中用探针式超声波分散20 min，然后在3000 rpm下离心10 min。上清液用0.8 μm水膜过滤除去大颗粒，然后放入截留分子量为14000 Da的透析袋去除小分子杂质和微量有机溶剂。

上述文献的方法与本专利的不同点主要有：

（1）反应基质不同，文献用了二甲基甲酰胺，而这种有机试剂不能用于食品。

（2）没有调整反应的pH，可能会导致反应的效率较低。

本发明在参考EDC法制备多糖–多酚共价复合物的基础上，获得了EDC法制备蛋白–多酚共价复合物的技术方案。

因为蛋白和多糖的空间结构，分子量等性质有较大差别，所以EDC法制备多糖–多酚共价复合物的方法不能直接用来制备蛋白–多酚共价复合物。研究发现，用EDC法制备的多糖–多酚共价复合物的接枝率受反应条件的影响，与多糖的解聚度、分子量、多糖与多酚的起始摩尔比、反应pH、温度和时间有关。由于不同的多糖和多酚的结构和分子量等性质有较大差异，实验者在做EDC实验时，通常都会参考前人的分子配比。而蛋白与多糖的结构、分子量以及所含氨基数量差别较大，所以不能直接照搬碳二亚胺法制备多糖–多酚的方法制备蛋白质–多酚共价复合物。需要优化蛋白与多酚的起始摩尔比和反应pH等条件才能使反应进行并达到较高的接枝率。

优选的，步骤4）中，将步骤3）的多酚溶液加入步骤1）的玉米醇溶蛋白溶液中，将pH调至6.5。主要技术考虑是：多酚与玉米醇溶蛋白的反应主要分为两步。第一步，EDC活化多酚的羧基，生成中间产物，这步反应适于在酸性条件下进行(pH 4–6)。第二步，中间产物受到氨基进攻形成酰胺交联，这步反应适于在弱碱性条件下进行。选择中性的溶液可以同时兼顾两者。

优选的，多酚选自绿原酸(CGA)、没食子酸(GA)中的一种或多种。不同分子量和结构的多酚与蛋白质的结合亲和力有所差别。本专利中主要是选择带有羧基的多酚，因为是多酚的羧基和EDC试剂反应，生成具有较高反应活性的中间产物，但是这个中间产物容易和水发生反应生成副产物，所以加入了NHS，用以保护中间产物。之后中间产物再和蛋白上的活性基团（如氨基）发生反应。

其他可选择的多酚有咖啡酸、原儿茶酸和迷迭香酸等。

优选的，所述步骤1）中还添加0.001%(w/v)的山梨酸钾。在实验过程中，发现玉米醇溶蛋白溶液滋生微生物，严重影响玉米醇溶蛋白和多酚的共价接枝，即使共价接枝完成后，也可能会破坏共价接枝结构。考虑加入特定组分或特殊处理，抑制微生物的生长。

开始考虑在蛋白溶液中加入叠氮化钠(0.005，w/w)，可以很好的抑制微生物的生长，但是叠氮化钠有毒性，不适合。

经过大量实验验证，在步骤1）玉米醇溶蛋白溶液中添加0.001%(w/v)的山梨酸钾，可以很好的起到杀菌的效果。

本发明的有益效果：

现有技术研究表明：将多酚共价接枝到蛋白质上可以改善蛋白质的抗氧化性、表面疏水性和热稳定性等；玉米醇溶蛋白–多酚复合物的相关研究主要集中于非共价复合物；玉米醇溶蛋白–多酚共价复合物的制备方法主要是碱法，会导致产物颜色变深。

目前所采用的碱催化法主要存在以下缺点：

（1）在碱性条件下，多酚首先被氧化成相应的醌类化合物，这会导致制备的复合物变为较深的褐色或绿色，影响其在食品中的应用。

（2）羟基的氧化会导致多酚的抗氧化性能有所下降。

（3）现有方法制备的复合物中多酚含量较低，抗氧化性没有大幅度的提升。

本发明利用一种新的方法制备了玉米醇溶蛋白–多酚共价复合物，不改变蛋白的颜色，并显著提高了抗氧化性。

本发明采用碳二亚胺介导的偶联反应制备玉米醇溶蛋白与两种多酚的共价复合物，这两种多酚分别为绿原酸(CGA)和没食子酸(GA)。这种方法制备出的共价复合物具有较高的多酚含量，抗氧化性也大幅提升，并且产物保持了蛋白原有的颜色，更有利于其在食品中的应用。

EDC是一种溶于水的碳二亚胺试剂，在酰胺合成中用作羧基的活化试剂，常和NHS合用，提高偶联效率。EDC/NHS优于醛类交联剂，实验证明EDC/NHS处理不会影响增加产物的细胞毒性。EDC/NHS只是帮助多酚的羧基和蛋白的氨基形成酰胺键，本身并没有成为交联的一部分，且中间产物（水溶性的脲衍生物，细胞毒性很小）可以消除并被清洗掉，具有无毒、生物相容好的特点。

（1）与现有技术（碱法）相比，本发明所采用的碳二亚胺交联法制备的共价复合物不会改变玉米醇溶蛋白的颜色，且不会破坏多酚的结构。

（2）SDS-PAGE 显示复合物的分子量明显增大，证实共价复合物的形成。通过测量多酚含量，发现本发明制备的复合物的多酚含量和接枝率高于现有技术。

（3）通过测量抗氧化性，发现本发明制备的复合物的抗氧化性比原始蛋白有了大幅度的提升，与现有技术相比，本发明的抗氧化性提升的更多。

综上所述，本发明所制备的玉米醇溶蛋白–多酚共价复合物可以显著提高玉米醇溶蛋白的抗氧化性，且生成的复合物仍保持原蛋白的颜色，有利于其在食品中的应用，尤其是可以用于构建新型的递送系统。

附图说明

图1. 对照zein和zein–多酚共价复合物的电泳谱图（条带为：1，标准蛋白；2，对照zein；3，zein–CGA共价复合物；4，zein–GA共价复合物）。

图2. 对照zein和zein–多酚复合物的溶解度。

图3. 对照zein和zein–多酚共价复合物的抗氧化性。

图4. 对照zein和zein–多酚复合物的分散性（1，对照zein；2，zein–CGA 非共价复合物； 3，zein–GA 非共价复合物；4，zein–CGA共价复合物；5，zein–GA共价复合物）。

图5. Zein–多酚共价复合物的扫描电镜图片（1，zein–CGA 共价复合物；2，zein–GA 共价复合物）。

图6. 碳二亚胺介导的zein–多酚共价复合物的形成途径。

图 7 zein–多酚共价复合物的总酚当量和接枝率。

图 8 对照zein和zein–多酚共价复合物的自由氨基含量。

图9 对照zein和zein–多酚复合物的热变性温度。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步说明：

其中，本发明所用所有试剂和原料均为符合国家原料标准的常用试剂，可在常规试剂生产销售公司购得。

实施例1：

1）将200 mg 玉米醇溶蛋白溶于10 mL 70% (v/v)的乙醇-水溶液中，超声5 min，搅拌30 min使其完全溶解，并添加0.001% (w/v)的山梨酸钾。

2）将0.25 mM 的绿原酸(CGA)溶于10 mL 70% (v/v)的乙醇-水溶液中，超声5min，搅拌30 min使其完全溶解；

3）在4℃下，向步骤2）的多酚溶液中先加入0.75 mM EDC，随后加入0.5 mM NHS，搅拌反应1 h；

4）将步骤3）的多酚溶液加入步骤1）的玉米醇溶蛋白溶液中，将pH调至6.5, 4℃反应1 h，室温反应24 h；

5）反应结束后，将混合物过超滤装置，将超滤得到的液体置于超声中透析。

6）将透析后的样品用纳米研磨机处理，经预冻，冷冻干燥后得到玉米醇溶蛋白–多酚共价复合物。

超滤和透析的具体步骤如下：

超滤膜的分子量为30 kDa，将超滤后的样品装入透析袋中，置于蒸馏水中透析48h，共换10次水，透析袋的分子量为3500 Da。将透析后的样品在–40°C预冻24 h，之后冷冻干燥2天得到固体样品。

实施例2：

2）将0.25 mM 的没食子酸(GA)溶于10 mL 70% (v/v)的乙醇-水溶液中，超声5min，搅拌30 min使其完全溶解；

实施例3：测定实施例1和2制备的共价复合物

一、电泳

测定实施例1和2制备的玉米醇溶蛋白–绿原酸(zein–CGA)共价复合物和玉米醇溶蛋白–没食子酸(zein–GA)共价复合物。

实验方法

通过SDS-PAGE评估玉米醇溶蛋白(zein)和多酚之间的共价反应。分离胶和浓缩胶的浓度分别为12.5%和5%。将蛋白质样品分散在蒸馏水中，浓度为2 mg/mL，之后将其与4×上样缓冲液混合，加热变性10 min。标准蛋白和样品的上样量都为10 μL，电泳缓冲液为Tris-甘氨酸缓冲液。电泳结束后，用考马斯亮蓝R250对SDS-PAGE凝胶进行染色，并在含有8%醋酸的溶液中脱色。

图6是碳二亚胺介导的zein–多酚共价复合物的形成途径的示意图。图1是对照zein和zein–多酚共价复合物的电泳谱图，从图1可以看出，zein–多酚共价复合物的条带比起对照蛋白有所上升，说明复合物的分子量增大了。由于SDS可以破坏蛋白与多酚间的非共价键，复合物分子量的增大可以归因为多酚与玉米醇溶蛋白发生了共价结合。

二、多酚含量的测定

用福林酚法测定共价复合物的多酚含量，计算接枝率。具体步骤如下：将0.5 mL玉米醇溶蛋白–多酚复合物溶液(1 mg/mL)与2.5 mL新制备的福林酚试剂(200 mmol/L)混合。在黑暗中反应5 min后，向混合物中加入2 mL Na₂CO₃溶液(7.5%，w/v)，在黑暗中反应2h。然后测定玉米醇溶蛋白–多酚复合物在760 nm处的吸光度，最终结果以每克复合物的毫克多酚当量表示。根据以下方程式计算接枝率：

接枝率(%)=（C/C₀）*100

其中C是透析后玉米醇溶蛋白–多酚复合物中的多酚含量，C₀是多酚的添加量。

由图7可以看出，本发明所制备的玉米醇溶蛋白–多酚共价复合物的总酚当量较高，且接枝率较高，可达35%以上，说明本发明所采用的方法具有较高的偶联效率。

三、自由氨基的测定

用OPA法测量了对照蛋白和zein–多酚共价复合物的自由氨基含量。简而言之，将80 mg OPA溶解于2 mL甲醇中，然后添加5 mL 20% (w/v)SDS，200 μL巯基乙醇、50 mL四硼酸钠溶液(0.1 M)，用蒸馏水定容至100 mL，即为OPA试剂。然后将200 μL样品溶液(2 mg/mL)与4 mL OPA试剂混合，并在35°C下反应2 min，之后测定其在340 nm处的吸光度，以_L-亮氨酸为标准物质。

由图8可以看出，与多酚发生共价反应后，玉米醇溶蛋白的自由氨基含量显著降低，说明蛋白中的自由氨基发生了反应。因为OPA试剂中含有SDS和巯基乙醇，可以破坏蛋白和多酚之间的非共价键，所以蛋白自由氨基含量的减少进一步证明了玉米醇溶蛋白–多酚共价复合物的形成。

四、溶解度测定

实验方法：

将蛋白样品分散于蒸馏水中，浓度为1 mg/mL, 恒速(200 rpm)搅拌30 min，然后将样品离心20 min (8000 rpm)。用考马斯亮蓝法测定上清液中的蛋白质含量，以牛血清分离蛋白为标准物做标准曲线。对照zein和zein–多酚复合物的溶解度表示为上清液中蛋白质浓度占总蛋白质浓度的百分比。

蛋白质的溶解度是蛋白的一项重要性质，因为它显著影响了蛋白的乳化性、凝胶性和起泡性等性质。从图2可以看出，蛋白与多酚反应后，溶解度都有所上升，这可能是因为引入了多酚的亲水性羟基。相比非共价复合物，共价复合物的溶解度上升的更显著，更有利于复合物在食品工业中的应用。

玉米醇溶蛋白–多酚非共价复合物的制备方法是：

将多酚与蛋白分散在水溶液中，将溶液的pH调为6，不加EDC和NHS，隔绝空气，搅拌反应24 h之后直接冷冻干燥得到非共价复合物。之所以用pH 6是因为多酚在碱性以及有氧条件下可能会被氧化成相应的醌，醌会和蛋白发生共价反应，弱酸性条件可以避免多酚的氧化。非共价复合物中多酚的添加量与相对应的共价复合物中的多酚含量相同。

五、抗氧化性

实验方法：

首先配制ABTS储备液，将10 mg的ABTS溶于2.6 mL的2.45 mM过硫酸钾溶液中，室温下避光反应16 h。实验前用去离子水将储备液稀释至波长734 nm处吸光值为0.70±0.02。取稀释至一定浓度的样品溶液，加入3 mL ABTS溶液，室温下避光反应60 min，然后在波长734 nm处测定其吸光值并比较样品清除ABTS自由基的能力与Trolox清除ABTS自由基的能力，以Trolox当量（nmol TE/mg样品）表示样品清除ABTS自由基的能力。

用乙醇配制1.7510^-4mol/L的DPPH溶液，取2 mL稀释至一定浓度的样品溶液与DPPH溶液充分混合，在室温下避光反应60 min，检测其在波长517 nm处的吸光值。以Trolox当量（nmol TE/mg样品）表示样品清除DPPH自由基的能力。

由图3可以看出，共价接枝多酚后，玉米醇溶蛋白的抗氧化性有了显著的提升，这是因为引入了多酚的羟基。本专利所采用的碳二亚胺交联法是将多酚的羧基与EDC反应，之后与蛋白相连，不会破坏多酚的羟基，所以相比常用的碱处理方法可能会更好的发挥多酚的抗氧化性。

六、热稳定性

实验方法：

用差示扫描量热仪(DSC)测量了样品的热变性温度来评估样品的热稳定性。实验方法如下：称5 mg样品，置于铝坩埚中密封，用密封的空坩埚作空白对照。加热速率为10°C/min，温度范围为30–200°C，氮气流速为20 mL/min。用仪器自带的分析软件得到热变性温度(°C)。

图9结果表明：玉米醇溶蛋白与多酚反应后，热变性温度都有所升高，说明玉米醇溶蛋白的热稳定性有所改善，其中共价复合物比非共价复合物的热稳定性更好，更有利于在食品工业中应用。

七、分散性

实验方法：

称取10 mg样品于玻璃瓶中，加入10 mL 蒸馏水，放入转子，搅拌30 min，将转子取出后拍照。

从图4中可以看出对照蛋白以及非共价复合物的分散性较差，大部分样品都沉到了底部，而共价复合物几乎都均匀的分散在了水中，说明共价接枝多酚后，蛋白的分散性得到了明显的改善。

八、扫描电镜

实验方法：

将少量冷冻干燥后的样品置于导电胶上，真空喷金后，在扫描电镜仪器上观察样品的微观形态。

从图5中可以看出，zein–多酚共价复合物形成了均匀的球形颗粒，且粒径较小，这可能是复合物分散性改善的原因之一。

需要说明的是，本专利说明书并非对本发明的配料和工艺做出限制，本领域技术人员根据发明的基本思想，可以根据本发明的基本思想，做出各种修改和改进，但只要不脱离本发明的基本思想，均应当在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种玉米醇溶蛋白–多酚共价复合物的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：

1）称取一定量的玉米醇溶蛋白溶于70% (v/v)的乙醇-水溶液中，超声5 min，200 rpm搅拌30 min，使其完全溶解。

2）称取一定量多酚溶于70% (v/v)的乙醇-水溶液中，超声5 min，200 rpm搅拌30 min使其完全溶解；

5）在反应过程中，每隔四个小时测量反应液的pH，通过加入NaOH (0.1 M)和HCl (0.1M)维持pH在固定值；

2.根据权利要求1所述的玉米醇溶蛋白–多酚共价复合物的制备方法，其特征在于，其中所述步骤1）混合体系中玉米醇溶蛋白的浓度为5 mg/mL–25 mg/mL；步骤2）中多酚的浓度为2–30 mmol/L；步骤3）中EDC的量为多酚添加量的1–5倍，NHS的添加量为多酚的1–3倍。

3.根据权利要求1所述的玉米醇溶蛋白–多酚共价复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤4）混合体系中玉米醇溶蛋白与多酚的质量比为1.5:1–10:1。

4.根据权利要求1所述的玉米醇溶蛋白–多酚共价复合物的制备方法，其特征在于，步骤4）的pH 为6.5。

5.根据权利要求1所述的玉米醇溶蛋白–多酚共价复合物的制备方法，其特征在于，多酚选自绿原酸(CGA)、没食子酸(GA)、咖啡酸、原儿茶酸、迷迭香酸的一种。

6.根据权利要求1所述的玉米醇溶蛋白–多酚共价复合物的制备方法，其特征在于，步骤6）中超滤膜的分子量选择30 kDa，透析袋的分子量选择3500 Da，透析时间48 h，透析温度 4℃。

7. 根据权利要求1所述的玉米醇溶蛋白–多酚共价复合物的制备方法，其特征在于，步骤7）中预冻条件为–40℃预冻24 h，冷冻干燥的时间为48 h。

8.根据权利要求2所述的玉米醇溶蛋白–多酚共价复合物的制备方法，其特征在于，EDC的量为多酚添加量的3倍，NHS的添加量为多酚的2倍。

9.根据权利要求1所述的玉米醇溶蛋白–多酚共价复合物的制备方法，其特征在于，其中所述步骤1）中添加0.001%(w/v)的山梨酸钾。