CN115444141A - 高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了高抗氧化性大豆分离蛋白‑没食子酸复合物及其制备方法，制备方法为：1)将大豆分离蛋白加入去离子水中得分散液；2)将没食子酸超声溶于去离子水中，调节pH＝6.9‑7.1，得没食子酸水溶液；3)将分散液和没食子酸水溶液混合均匀得混合液，向混合液中加入漆酶酶液，交联反应，得到高抗氧化性大豆分离蛋白‑没食子酸复合物粗品。本发明制备的产品可用于制备高附加值产品，可应用于食品加工及保健品领域。本发明利用漆酶催化没食子酸共价交联大豆分离蛋白的方法，绿色环保、反应条件温和、无副产物等优点。此外，可对食物营养价值进行保护。相较于单一的大豆分离蛋白溶液，本发明的复合物抗氧化能力显著提高。

Description

高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物及其制备方法
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，具体地，涉及高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物及其制备方法。
背景技术
大豆分离蛋白作为一种植物性完全蛋白质，其氨基酸组成除蛋氨酸含量略低以外，其余必需氨基酸均较丰富，在营养价值上与动物蛋白相似，是目前最具营养价值的植物蛋白资源。大豆分离蛋白不仅营养成分丰富，而且具有与加工过程相关的多种功能特性，因此己成为食品加工领域中常用的食品基料。然而，大豆分离蛋白抗氧化性能差。在加工和贮藏过程中，大豆分离蛋白易受到活性氧的攻击而发生氧化，导致其结构发生改变，功能特性降低，从而使大豆蛋白食品的风味、口感降低，产品质地变差，货架期缩短。在豆制品中添加抗氧化剂是防止蛋白质氧化的有效手段之一。相较于人工化学合成的抗氧化剂，天然抗氧化剂更加安全健康。植物提取物是天然抗氧化剂的良好来源。植物多酚为其中发挥抗氧化作用的主要组分，经常被用作功能性膳食产品的添加剂。同时，由于功能食品的日益增多和人们对食源性保健品的认识的提高，多酚类物质的市场需求迅速增加。长期食用富含植物多酚的饮食有助于改善多种疾病，如癌症、糖尿病、骨质疏松症、神经退行性疾病和心血管疾病。多酚还被发现对肠道健康有益，可以调节肠道菌群，缓解炎症，防止癌症等慢性疾病的发展。
植物多酚以共价和非共价的方式与蛋白质发生相互作用，可改变蛋白质的空间结构及功能基团，从而影响蛋白质的功能特性以及产品的感官性状和营养价值。非共价相互作用通常是可逆的，包括疏水相互作用、氢键、静电相互作用、范德华相互作用、疏水相互作用。共价相互作用主要是由醌类物质的形成引起的。醌类物质具有较强的亲电性，可进一步与蛋白质上的亲核残基发生反应产生稳定的C＝N或C-S共价键。碱性条件是将多酚氧化成醌类物质最常用的方法。上述方法存在明显不足，例如通过非共价相互作用形成的大豆分离蛋白-多酚复合物，多酚易游离蛋白分子链，不能有效的增强大豆蛋白的抗氧化性；许多食物的pH值是偏中性的，而强碱的制备条件不利于维持人的体液酸碱度(pH 7.0–7.4)的稳定。故开发一种中性条件下的大豆分离蛋白-多酚复合物的制备方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物。
本发明的第二个目的是提供一种高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物的制备方法。
本发明的技术方案概述如下：
包括如下步骤：
1)将大豆分离蛋白加入去离子水中使浓度为15-25mg/mL，搅拌2-3小时，于2-8℃放置8-12小时，得分散液；
2)将没食子酸超声溶于去离子水中，使浓度为0.4-3.2mg/mL，调节pH＝6.9-7.1，得没食子酸水溶液；
3)按体积比为1：(1-1.5)的比例，将步骤1)获得的分散液和步骤2)获得的没食子酸水溶液混合均匀得混合液，向混合液中加入漆酶酶液，使浓度为0.8-2U/mL，在25℃-60℃，交联反应3.5-4.5h，得到高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物粗品。
还包括如下步骤：将所述高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物粗品用截留分子量为3000Da的透析袋进行透析，去除未反应游离的没食子酸；离心弃上清，冷冻干燥获得高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物粉末。
步骤2)为：将没食子酸超声溶于去离子水中，使浓度为3.2mg/mL，调节pH＝7，得没食子酸水溶液。
步骤3)为：按体积比为1：1的比例，将步骤1)获得的分散液和步骤2)获得的没食子酸水溶液混合均匀得混合液，向混合液中加入漆酶酶液，使浓度为1.6U/mL，在25℃，交联反应4h，得到高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物粗品。
所述的漆酶酶液为枯草芽孢杆菌漆酶酶液，所述枯草芽孢杆菌漆酶酶液用下述方法获得：
1)构建含有枯草芽孢杆菌漆酶基因的大肠杆菌：设计枯草芽孢杆菌漆酶基因的上游引物和枯草芽孢杆菌漆酶基因的下游引物，以枯草芽孢杆菌基因组为模板，利用所述上游引物与所述下游引物进行PCR扩增，并将扩增产物通过酶切-连接的方式整合入大肠杆菌质粒pET-28a中，获得重组质粒pET-28a-laccase，并通过CaCl2转化法转入大肠杆菌表达型宿主菌BL21(DE3)中，得到重组菌；
所述枯草芽孢杆菌漆酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述枯草芽孢杆菌漆酶基因的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述枯草芽孢杆菌漆酶基因的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
2)将步骤1)获得的重组菌发酵，纯化，制备获得枯草芽孢杆菌漆酶酶液。
上述方法制备的高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物。
本发明的优点：
(1)本发明的制备方法制备的产品可用于制备高附加值产品，可应用于食品加工及保健品领域。
(2)本发明利用漆酶催化没食子酸共价交联大豆分离蛋白的方法，相比强烈的反应条件(强碱)具有绿色环保、反应条件温和、无副产物等优点。此外，可对食物营养价值进行保护。
(3)相较于单一的大豆分离蛋白溶液，本发明制备的高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物抗氧化能力显著提高，DPPH自由基清除率最高可达74.19％，ABTS自由基清除能力最高可达80.02％，铁离子还原能力最高可达0.769Abs。
附图说明
图1为实施例2制备的16种高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物的结合率；
图2为实施例2制备的16种高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物的表面疏水性的测定；
图3为实施例2制备的4种高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物的十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶电泳测试结果照片(其中温度为25℃)；
图4为实施例2制备的4种高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物的红外光谱图(其中温度为25℃)；
图5为实施例2制备的16种高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物的DPPH自由基清除能力的示意图；
图6为实施例2制备的16种高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物ABTS自由基清除能力的示意图；
图7为实施例2制备的16种高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物铁离子还原能力的示意图；
图8为实施例2制备的16种高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物参数示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。对本发明内容所做的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
本发明所使用的枯草芽孢杆菌学名为Bacillus subtilis，购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心(网址http://www.china-cicc.org/)，菌种保存号为CICC20613，购买时间为2010年6月。
本发明所采用的大豆分离蛋白(SPI)为市售(对本发明不进行限定)。
实施例1
枯草芽孢杆菌漆酶酶液的制备：
1)构建含有枯草芽孢杆菌漆酶基因的大肠杆菌：设计枯草芽孢杆菌漆酶基因的上游引物和枯草芽孢杆菌漆酶基因的下游引物，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，CICC20613)基因组为模板，利用所述上游引物与所述下游引物进行PCR扩增，并将扩增产物通过酶切-连接的方式整合入大肠杆菌质粒pET-28a(市售)中，获得重组质粒pET-28a-laccase，并通过CaCl2转化法转入大肠杆菌表达型宿主菌BL21(DE3)中，得到重组菌；
所述枯草芽孢杆菌漆酶基因(GenBank号为：JN043511.1)的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；来源：NCBI官网，网址https://www.ncbi.nlm.nih.gov/。
所述枯草芽孢杆菌漆酶基因的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；(
Figure BDA0003105853870000041
Viewer 5.1.5设计)
所述枯草芽孢杆菌漆酶基因的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；(
Figure BDA0003105853870000042
Viewer 5.1.5设计)
上游引物5’-CGCGGATCCATGACACTTGAAAAATTTGTGG(SEQ ID No.2)；
下游引物5’-CGGCTCGAGCTATTTATGGGGATCAGTTATATCC(SEQ ID No.3)。
2)将步骤1)获得的重组菌发酵，纯化，制备获得枯草芽孢杆菌漆酶酶液，具体步骤为：
将步骤(1)获得的重组菌接种至LB液体培养基，于37℃培养箱中培养12h，得到种子液；将该种子液按照1％的比例接种至新的LB液体培养基中，在37℃，220rpm条件下培养至OD600为0.8后，分别按照1mg/L与1mmol/L的加入量加入IPTG与CuCl2，然后在16℃，220rpm条件下发酵20h；发酵完毕后10000rmp离心获取菌体并利用高压细胞破碎仪破碎细胞，经Ni-NTA亲和层析柱纯化后，获取纯化的枯草芽孢杆菌漆酶。
LB液体培养基的配方：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L、卡那霉素50mg/L，余量为水。
实验证明：利用本方法获得到的枯草芽孢杆菌漆酶，具有发酵周期短(加入诱导剂后20h便可完成发酵)、生产成本低(每升发酵成本约1.52元)、可实现快速大批量生产。
实施例2
高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物的制备方法，包括如下步骤：
1)将大豆分离蛋白加入去离子水中使浓度为20mg/mL，搅拌2.5小时，于4℃放置10小时，得分散液；
2)将没食子酸超声溶于去离子水中，使浓度分别为0.4、0.8、1.6、3.2mg/mL，调节pH＝7，得没食子酸水溶液；
3)按体积比为1：1的比例，将步骤1)获得的分散液分别和步骤2)获得的没食子酸水溶液混合均匀得四份混合液，分别向混合液中加入漆酶酶液，使浓度为1.6U/mL，分别在25℃、40℃、50℃、60℃，交联反应4h，得到高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物粗品。
4)将所述高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物粗品用截留分子量为3000Da的透析袋进行透析，去除未反应游离的没食子酸；离心弃上清，冷冻干燥获得高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物粉末。(见图8)
对照例：大豆分离蛋白空白样品的制备
将大豆分离蛋白加入去离子水中使浓度为10mg/mL，搅拌2.5小时，于4℃放置10小时，得分散液；
分别于25℃、40℃、50℃、60℃孵育4小时，离心(3000rpm，15min)，弃上清，冷冻干燥，得到大豆分离蛋白空白样品。
对对照例及实施例2中制备的16种高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物的红外光谱如图4所示。红外光谱表明高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物存在代表蛋白二级结构特征峰酰胺I峰(1600-1700cm-1)，但在随着没食子酸浓度的增大吸收峰的强度逐渐减小，表明蛋白的二级结构发生变化。
对对照例及实施例2中制备的16种高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物进行共价结合率的测定，通过Folin-Ciocalteu方法进行定量。以没食子酸为标准物质同样方法测定标准曲线。然后将透析后的高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物溶液用去离子水稀释，得到在校准曲线范围内的吸光度读数。利用下式计算没食子酸与大豆分离蛋白的共价结合率：
Figure BDA0003105853870000051
对实施例2制备的共16种抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物共价结合率的计算结果如图1所示。随着没食子酸浓度的增加，共价结合率逐渐增加(77％-97％，25℃)。通常，温度不仅影响漆酶的催化效率，而且影响没食子酸的稳定性。然而，随着温度从25℃升至60℃，漆酶催化的大豆分离蛋白和没食子酸之间的结合率有轻微增加。因此，温度不是影响结合率的主要因素，低温条件可以应用于实际的食品加工和生产中。
对对照例制备的产物及实施例2制备得到的复合物进行表面疏水性的测定，疏水性指数测定方法如下：用pH 7.4的20mM磷酸盐缓冲液对复合物溶液进行系列稀释，以获得0.1-0.5mg/mL的蛋白质浓度。随后，在相同缓冲溶液中制备的8mM 8-苯氨基-1-萘磺酸(ANS)溶液20μL添加到2mL样品溶液中，并将混合物在环境温度下孵育5分钟。在荧光分光光度计(Cary+Eclipse，Agilent)上于380/470nm的激发/发射波长下测量上述样品的荧光强度。空白样品为仅缓冲液和ANS。使用线性回归分析计算始斜率，即蛋白质表面疏水性指数(S0)。
对对照例制备的产物及实施例2制备得到的复合物的疏水性指数变化如图2所示。从图2的结果可以看出，在与被漆酶催化的没食子酸结合后，大豆分离蛋白的疏水性显著降低(p＜0.05)。而且，疏水作用随着温度的升高而增加。
对对照例制备的产物及实施例2制备得到的复合物的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳图照片如图3所示。泳道1为对照大豆分离蛋白，条带清晰的显示了大豆分离蛋白的两个主要蛋白，即β-伴大豆球蛋白(7S)和大豆球蛋白(11S)，α，α'和β亚基代表7S，A，B亚基代表11S。显然没食子酸与大豆分离蛋白结合的蛋白条带几乎消失了。当没食子酸浓度高时，交联反应最明显。
SDS-PAGE凝胶电泳分析：浓缩胶和分离胶的浓度分别为5％与12％，选择分子量分布为10～180kDa范围的Marker进行SDS-PAGE电泳试验。
实施例2制备的4种高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物的十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶电泳测试结果照片(其中温度为25℃)见图3。
对实施例2与对照组的制备方法得到的复合物进行抗氧化能力的比对，测定方法如下：
(1)DPPH自由基清除能力测定
配制浓度为0.2mmol/L的DPPH-乙醇溶液，4℃避光保存备用。取2mL的DPPH-乙醇溶液，加入等体积待测样液(蛋白浓度为2.0mg/mL)，混合均匀后，黑暗中静置反应30min，然后测定517nm下溶液的吸光度。每一个样品平行测试3次。用无水乙醇作为参比。
DPPH自由基清除能力根据下式计算：
Figure BDA0003105853870000061
Ai：2mL DPPH-乙醇溶液与2mL待测溶液的吸光度；
Aj：2mL待测溶液与2mL乙醇的吸光度；
Ac：2mL DPPH-乙醇溶液与2mL乙醇的吸光度。见图5。
(2)ABTS自由基清除能力测定
取3.9mL 37℃预热的ABTS·+反应液，加入100uL待测溶液(蛋白浓度为2.0mg/mL)，37℃水浴条件下反应10min，测定734nm下溶液的吸光度。
所述ABTS·+反应液配制方法：7mmol/L的ABTS溶液与2.45mmol/L K2S2O8溶液等体积混合，反应12-16小时后，制成ABTS·+储备液，用10mmol/LPBS缓冲液稀释(一般稀释40-50倍)，测定734nm下溶液的吸光度为0.70±0.02，即为ABTS·+反应液。
所述2.45mmol/L K2S2O8溶液配制方法：8g NaCl、0.2g KCl、3.63g Na2HPO4·12H2O、0.24g KH2PO4溶于900mL去离子水中，用HCl调pH 7.4，定容1L。
所述2.45mmol/L K2S2O8溶液配制方法：0.0066g K2S2O8去离子水定容10mL。
ABTS自由基清除能力根据下式计算：
Figure BDA0003105853870000062
Ai：待测溶液的吸光度；
Ac：以去离子水为空白对照的吸光度。见图6。
(3)铁离子还原力测定
取蛋白浓度为2mg/mL的样品溶液100uL，用1mL去离子水进行适当稀释，加入浓度为0.2mol/L pH 6.6的磷酸钠缓冲液和1％铁氰化钾溶液各0.5mL，混合均匀，置于50℃水浴中20min后迅速冷却，加入0.5mL 10％的三氯乙酸溶液，混匀后离心(3000r/min，10min)。取上清液2mL，分别加入去离子水2mL及0.1％的氯化铁溶液(现用现配)0.4mL，混匀后静置10min，于700nm波长处测定吸光度，见图7。
对对照例制备的产物及实施例2制备得到的复合物的抗氧化能力如图5、图6、图7所示。DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力及铁离子还原能力测定是用来检测样品抗氧化能力的三种常用手段。测定结果越高，代表该样品的抗氧化能力越强。经图比对可知，DPPH自由基清除率最高可达74.19％(与未加修饰的大豆分离蛋白比较提升了近5倍)，ABTS自由基清除能力最高可达80.02％(与未加修饰的大豆分离蛋白比较提升了近1.5倍)，铁离子还原能力最高可达0.769Abs(与未加修饰的大豆分离蛋白比较提升了近3倍)。故本发明制备的高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物具有优越的抗氧化能力。
实施例3
高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物的制备方法，包括如下步骤：
1)将大豆分离蛋白加入去离子水中使浓度为20mg/mL，搅拌3小时，于4℃放置8小时，得分散液；
2)将没食子酸超声溶于去离子水中，使浓度为3.2mg/mL，调节pH＝7，得没食子酸水溶液；
3)按体积比为1：1的比例，将步骤1)获得的分散液和步骤2)获得的没食子酸水溶液混合均匀得混合液，向混合液中加入漆酶酶液，使浓度为2U/mL，在50℃，交联反应4h，得到高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物粗品；
4)将所述高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物粗品用截留分子量为3000Da的透析袋进行透析，去除未反应游离的没食子酸；离心弃上清，冷冻干燥获得高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物粉末。
实施例4
高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物的制备方法，包括如下步骤：
1)将大豆分离蛋白加入去离子水中使浓度为15mg/mL，搅拌2小时，于8℃放置8小时，得分散液；
2)将没食子酸超声溶于去离子水中，使浓度为0.4mg/mL，调节pH＝6.9，得没食子酸水溶液；
3)按体积比为1：1的比例，将步骤1)获得的分散液和步骤2)获得的没食子酸水溶液混合均匀得混合液，向混合液中加入漆酶酶液，使浓度为1.6U/mL，在60℃，交联反应3.5h，得到高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物粗品；
4)将所述高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物粗品用截留分子量为3000Da的透析袋进行透析，去除未反应游离的没食子酸；离心弃上清，冷冻干燥获得高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物粉末。
实施例5
高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物的制备方法，包括如下步骤：
1)将大豆分离蛋白加入去离子水中使浓度为25mg/mL，搅拌3小时，于2℃放置12小时，得分散液；
2)将没食子酸超声溶于去离子水中，使浓度为0.8mg/mL，调节pH＝7.1，得没食子酸水溶液；
3)按体积比为1：1.2的比例，将步骤1)获得的分散液和步骤2)获得的没食子酸水溶液混合均匀得混合液，向混合液中加入漆酶酶液，使浓度为2U/mL，在25℃，交联反应4.5h，得到高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物粗品；
4)将所述高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物粗品用截留分子量为3000Da的透析袋进行透析，去除未反应游离的没食子酸；离心弃上清，冷冻干燥获得高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物粉末。
实施例6
高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物的制备方法，包括如下步骤：
1)将大豆分离蛋白加入去离子水中使浓度为22mg/mL，搅拌2.5小时，于5℃放置10小时，得分散液；
2)将没食子酸超声溶于去离子水中，使浓度为1.6mg/mL，调节pH＝7，得没食子酸水溶液；
3)按体积比为1：1.5的比例，将步骤1)获得的分散液和步骤2)获得的没食子酸水溶液混合均匀得混合液，向混合液中加入漆酶酶液，使浓度为0.8U/mL，在40℃，交联反应4h，得到高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物粗品；
4)将所述高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物粗品用截留分子量为3000Da的透析袋进行透析，去除未反应游离的没食子酸；离心弃上清，冷冻干燥获得高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物粉末。
实验证明，实施例3、4、5、6制备的高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物其结合率、表面疏水性、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、铁离子还原能力与图8所示的实施例2中的第三组参数中，温度为50℃的反应结果相似。
序列表
<110> 天津大学
中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物及其制备方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1542
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 1
atgacacttg aaaaatttgt ggatgctctc ccaatcccag atacactaaa gccggtacag 60
cagtcaaaag atagcacata ctacgaagta accatggagg aatgctacca tcagcttcac 120
cgcgatctcc ctccaacccg cttgtggggc tataacggtt tattccccgg tcccaccatt 180
aaggccaaaa gaaatgaaaa cgtttatgtg aaatggatga ataaccttcc ttcagagcat 240
tttcttccga ttgatcacac cattcatcac agtgacagcc agcatgccga acccgaggtg 300
aaaaccgtcg ttcatttaca cggcggcgtc actccagatg acagcgacgg ttatcctgag 360
gcctggtttt ctaaagactt tgaacaaaca ggcccttatt ttaaacgaga ggtttaccat 420
tatccaaatc agcagcgcgg agctatttta tggtatcacg atcatgctat ggcgctcacg 480
aggctgaatg tgtatgccgg gctcatcggt gcttatatca tccatgaacc aaaggaaaaa 540
cgtctaaagc tcccatcagg tgaatacgat gtgccgcttt tgatcacgga ccgtacgatt 600
aatgaagatg gctctttatt ttatccgagc ggaccggaaa acccttcacc gtcactgcca 660
aatccgtcaa tcgttccagc cttttgcgga gatacaattc tcgtcaacgg gaaggcatgg 720
ccatacatgg aggtcgaacc gagaaaatac cgtttccgcg tcatcaatgc ctctaatacg 780
agaacatata acctgtcact tgataatggc ggagaattta tccagatcgg ttctgacggc 840
ggacttttgc cgcgctccgt caagctaaac tctttcagta tcgcgccagc tgagcgcttt 900
gatatcctca ttgacttcgc cgcgtttgaa ggacaatcga ttattttagc aaacagcgag 960
ggctgcggcg gcgacgttaa tccggaaaca gacgcaaaca tcatgcaatt cagagtcaca 1020
aaaccgttag cccaaaaaga cgaaagcaga aagccaaaat acctggcatc ttacccttcg 1080
gtacagcatg aaagaataca aaacctccga acattgaagc tggcaggcac tcaagaccaa 1140
tacggcagac ccgtccttct tcttaacaac aaacgctggc acgatcctgt cactgaagca 1200
ccgaaagtcg gttctaccga aatatggtcg attatcaacc cgactcgcgg aacacatccg 1260
atccatcttc atttggtctc cttccgtgta ttggaccggc gcccatttga tacagcccgt 1320
tttgaagagc gcggagaact ggcctacacc ggacccgccg ttccgccgcc accaagtgaa 1380
aaaggctgga aagacacggt tcagtcccac gccggtgaag tcctgagaat cgccgtaaca 1440
ttcgggccat acactgggcg gtacgtatgg cattgccaca ttcttgagca tgaagactat 1500
gacatgatga gaccgatgga tataactgat ccccataaat ag 1542
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgcggatcca tgacacttga aaaatttgtg gatgc 35
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgctcgagc tagtggtggt ggtggtggtg tttatgg 37

Claims (6)

1.高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物的制备方法；其特征是包括如下步骤：
1)将大豆分离蛋白加入去离子水中使浓度为15-25mg/mL，搅拌2-3小时，于2-8℃放置8-12小时，得分散液；
2)将没食子酸超声溶于去离子水中，使浓度为0.4-3.2mg/mL，调节pH＝6.9-7.1，得没食子酸水溶液；
3)按体积比为1：(1-1.5)的比例，将步骤1)获得的分散液和步骤2)获得的没食子酸水溶液混合均匀得混合液，向混合液中加入漆酶酶液，使浓度为0.8-2U/mL，在25℃-60℃，交联反应3.5-4.5h，得到高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物粗品。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是还包括如下步骤：将所述高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物粗品用截留分子量为3000Da的透析袋进行透析，去除未反应游离的没食子酸；离心弃上清，冷冻干燥获得高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物粉末。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是所述步骤2)为：将没食子酸超声溶于去离子水中，使浓度为3.2mg/mL，调节pH＝7，得没食子酸水溶液。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤3)为：按体积比为1：1的比例，将步骤1)获得的分散液和步骤2)获得的没食子酸水溶液混合均匀得混合液，向混合液中加入漆酶酶液，使浓度为1.6U/mL，在25℃，交联反应4h，得到高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物粗品。
5.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于所述的漆酶酶液为枯草芽孢杆菌漆酶酶液，所述枯草芽孢杆菌漆酶酶液用下述方法获得：
1)构建含有枯草芽孢杆菌漆酶基因的大肠杆菌：设计枯草芽孢杆菌漆酶基因的上游引物和枯草芽孢杆菌漆酶基因的下游引物，以枯草芽孢杆菌基因组为模板，利用所述上游引物与所述下游引物进行PCR扩增，并将扩增产物通过酶切-连接的方式整合入大肠杆菌质粒pET-28a中，获得重组质粒pET-28a-laccase，并通过CaCl2转化法转入大肠杆菌表达型宿主菌BL21(DE3)中，得到重组菌；
所述枯草芽孢杆菌漆酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述枯草芽孢杆菌漆酶基因的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述枯草芽孢杆菌漆酶基因的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
2)将步骤1)获得的重组菌发酵，纯化，制备获得枯草芽孢杆菌漆酶酶液。
6.权利要求1-5之一的方法制备的高抗氧化性大豆分离蛋白-没食子酸复合物。
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