CN108624555A - 干细胞天然分泌多肽活性添加物的制备方法，复合多肽的面膜液及其制备方法 - Google Patents

干细胞天然分泌多肽活性添加物的制备方法，复合多肽的面膜液及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种干细胞天然分泌多肽活性添加物的制备方法、复合多肽的面膜液及其制备方法，符合多肽面膜液包括下述重量份的组分：干细胞天然分泌多肽活性添加物3‑5份；薰衣草提取物10‑13份；骨胶原1‑2份；透明质酸3‑5份；甘油5‑8份；维生素E6‑9份；PEG‑40氢化蓖麻油7‑10份；去离子水89‑93份。本发明的面膜液具备下述有益效果：1)本发明采用的天然干细胞分泌的肽成分多样化，较于成分现有技术中成分单一肽，肽成分多样化更利于人体肌肤细胞的吸收；2)再者，本发明采用的添加多肽为干细胞分泌的复合多肽成分，这些成分有效构成了利于皮肤细胞吸收和修复受损的完善的微环境。

Description

干细胞天然分泌多肽活性添加物的制备方法，复合多肽的面 膜液及其制备方法
技术领域
本发明涉及复合多肽面膜技术领域，具体涉及一种干细胞天然分泌多肽活性添加物的制备方法、复合多肽的面膜液。
背景技术
面膜通过阻隔肌肤与空气的接触，抑制皮脂分泌和汗水蒸发使肌肤温度上升，促进血液循环，是面膜内的有效成分渗入到表皮层或者更深更广的地方，催件皮肤吸收跟过的的水分、营养精华及各种有效成分后改善皮肤缺水和暗哑，减少细纹生成，延缓皮肤衰老。面膜胶是面膜的关键成分，决定着面膜的功效。多肽，是一种氨基酸链，也是构成肌肤细胞的基石，能够恢复肌肤活力，帮助肌肤再生。多肽具有多种功能，(1)能够帮助防止肌肤表面的自由基，而自由基已证实是导致衰老的原因之一，从而发挥抗氧化剂的作用。(2)补充胶原蛋白，增加肌肤表面的穿透能力，保持肌肤的弹性和光滑性，从而减少皱纹。(3)提高皮肤表面天然透明质酸钠的合成率，从而保持皮肤的锁水性。目前的面膜液主要采用透明质酸钠，甘油，尿囊素，水解胶原等成分加一些人工合成的一种或者多种多肽类分子，比如肌肽、五胜肽、二胜肽等肽成分，也能有效的增加面膜液的锁水，抗衰和减少皱纹的功效。但是存在以下问题(1)采用的人工合成的肽。(2)肽成分单一，肌肤细胞的修复和抗衰作用更多的依赖细胞的微环境而不是单独一种或者两种的肽成分能够完成的过程，肌肽、五胜肽、二胜肽等肽成分只是一个主要的成分，在主要成分的发挥作用时，很多次要成分尽管量少，但是在发挥作用中同样是构成肌肤细胞修复抗衰微环境的非常重要的因素。(3)人工合成肽添加量不确切。细胞需要微环境来维持它的活力和活性，微环境是由多种成分和各种成分的量的平衡来构成的，人工添加只控制主要肽的添加量，但是无法完全知道其他次要成分，更无法来准确添加最适合的量。
本发明采用脐带来源的间充质干细胞天然分泌的复合多肽作为面膜液的肽添加成分。
本发明要解决的技术问题是：研制开发出的脐带来源的间充质干细胞天然分泌的复合多肽作为面膜液的肽添加成分，复合多肽制备而得的面膜液能够有效构成利于皮肤细胞吸收和修复受损的完善的微环境，使得皮肤得到有效修复和保湿。
发明内容
本发明的目的是提供一种干细胞天然分泌多肽活性添加物的制备方法，复合多肽的面膜液及其制备方法，本发明的复合多肽的面膜液中的干细胞天然分泌多肽活性添加物中的肽成分多样化，本发明采用脐带来源的间充质干细胞天然分泌的复合多肽作为面膜液的肽添加成分，有效构成了利于皮肤细胞吸收和修复受损的完善的微环境，有利于皮肤对面膜液的有效吸收以及对受损细胞的快速修复。
为实现上述目的，本发明是通过下列技术方案实现的：
一种干细胞天然分泌多肽活性添加物的制备方法，包括下述步骤
脐带间充质干细胞的培养：脐带样本采集：在靠近胎盘端2-3cm处，取大于20cm的脐带组织；
脐带间充质干细胞的分离和提取：将脐带剖开并剪成段，该段为2cm；
在一次性培养皿中加入含2％双抗的PBS洗液，将剪好的脐带放入其中洗涤2-3次，洗去残留血液，将挑去血管的脐带放入玻璃培养皿，用小剪刀剪碎至糊状，加入含胎牛的培养基，并且搅拌均匀，吸取糊状的脐带组织，分装至若干个培养瓶中，培养瓶中加入含胎牛培养基进行培养；
脐带间充质干细胞的培养：
(1)七天，在每个培养瓶中加入含胎牛的培养基，注意加液时培养瓶不能侧立，可将移液管伸入培养瓶内缓慢滴加，避免组织移动；
(2)约十四天左右，显微镜下可见MSC细胞爬出组织，轻轻晃动培养瓶使组织脱落去除，加入培养基继续培养；
(3)三天左右全量换液，并将没有去除的少量组织块用移液管轻轻吹下倒掉；
(4)显微镜下观察局部细胞融合度达到90％以上时，用胰酶消化传代，两个培养瓶的细胞合成一瓶；
干细胞传代：
(1)细胞融合度达到85％-90％时，吸出培养基，加入PBS洗涤，向培养瓶中加入胰酶；
(2)吸取细胞悬液于15ml离心管内，1000rpm离心5分钟；
(3)倒去上清液，再加入5ml培养基重悬，离心洗涤；
(4)倒去上清液，加入7ml培养基重悬细胞，混合均匀，加入T-75培养瓶中，放入培养箱继续培养；
间充质干细胞天然分泌因子多肽收集：收集生长旺盛期的P3、P4、P5代的分泌的细胞多肽成分即干细胞天然分泌多肽活性添加物。
本发明还提供了一种复合多肽的面膜液，至少包括下列重量份的组分
本发明还提供了一种复合多肽的面膜液制备方法，包括下述步骤
(1)采用超临界CO2萃取法工艺获取薰衣草提取物，收集新鲜的薰衣草，风干，磨成粉，将薰衣草粉装入萃取罐中，在6.5Mpa，4度下通入CO2，萃取一定1.5小时后，从解析罐中放出萃取物，待用；
(2)将薰衣草提取物10-13粉，透明质酸3-5份、甘油5-8份、维生素E 6-9份PEG-40氢化蓖麻油7-10份、去离子水89-93份。放入搅拌机中，90度搅拌均匀；
(3)在静置条件下，将搅拌容器冷却；
(4)待温度降到40°后加干细胞天然分泌多肽活性添加物3-5份、骨胶原1-2份，进行搅拌，搅拌的速度低于500r/min。
优选的，所述步骤(4)的搅拌的速度为t，满足数量关系t<500r/min。
本发明的复合多肽的面膜液及其制备方法，具有下述有益效果：1)本发明采用的天然干细胞分泌的肽成分多样化，较于成分现有技术中成分单一肽，肽成分多样化更利于人体肌肤细胞的吸收；2)再者，本发明采用的添加多肽为干细胞分泌的复合多肽成分，这些成分有效构成了利于皮肤细胞吸收和修复受损的完善的微环境；2)本发明采用脐带来源间充质干细胞，取自于胎儿分娩时经过严格的检测和筛选的脐带，是多功能干细胞(pluripotent stem cell)，发育等级仅次于胚胎干细胞，优于成体干细胞，可直接复制各种脏器和修复组织，有效避免了成体干细胞，比如脂肪干细胞，骨髓干细胞等年龄相关的干细胞衰老问题；3)本发明添加的干细胞复合多肽全部在临床级别的GMP洁净实验室采用体外培养间充质干细胞，并收集干细胞生长旺盛期分泌的细胞多肽，经过严格的无菌检测，达到临床治疗级别，在保证使用的安全同时最大程度的保证其活性和有效性，进一步使得面膜液在使用过程中，更好的渗透皮肤，对皮肤进行修复。
附图说明
图1是本发明面膜液保湿效果测试结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合最佳实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
脐带样本采集：
一种干细胞天然分泌多肽活性添加物的制备方法，包括下述步骤
第一步脐带间充质干细胞的培养：脐带样本采集：在靠近胎盘端2-3cm处，用止血钳夹住脐带，然后在靠近止血钳处用丝线结扎，在结扎处和止血钳之间，用手术剪将脐带剪断；脐带的另一端也用细丝线结扎，两个结扎点之间的脐带长度须＞20cm；
第二步脐带间充质干细胞的分离和提取：以下所有的制备操作均在万级洁净间局部百级生物安全柜中操作。
1、用手术镊将脐带从运输液中取出，放入一次性培养皿，用剪刀将脐带剖开并剪成2cm 尺寸的小段；
2、在一次性培养皿中加入含2％双抗的PBS洗液，将剪好的脐带放入其中洗涤2-3次，洗去残留血液；将洗好的脐带放入新的培养皿，用无菌的手术镊挑去血管组织，获得脐带胶组织；
3、将挑去血管的脐带放入玻璃培养皿，用小剪刀剪碎至糊状，加入少量含胎牛的培养基，尽可能的搅拌均匀，将10ml移液管剪去尖头，吸取糊状的脐带组织，分装至若干个T-75培养瓶中；
4、向培养瓶中加入少量含胎牛培养基，轻轻晃动培养瓶使组织均匀的覆盖在培养瓶底部，培养瓶侧壁作上标记，放入CO2培养箱；
第三步脐带间充质干细胞的培养：
1、七天左右，在每个培养瓶中加入少量含胎牛的培养基，注意加液时培养瓶不能侧立，可将移液管伸入培养瓶内缓慢滴加，避免组织移动，约十四天左右，显微镜下可见MSC细胞爬出组织，轻轻晃动培养瓶使组织脱落去除，加入培养基继续培养；
2、三天左右全量换液，并将没有去除的少量组织块用移液管轻轻吹下倒掉；显微镜下观察局部细胞融合度达到90％以上时，用胰酶消化传代，两个培养瓶的细胞合成一瓶
第四步干细胞传代：
1、观察细胞融合度达到85％-90％，从培养瓶中吸出用过的培养基并丢弃；
2、加入PBS洗涤。从与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入洗涤液，前后摇晃容器数次吸出洗涤液丢弃；
3、向培养瓶中加入胰酶，轻轻摇晃培养瓶使胰酶完全覆盖细胞层，消化3分钟左右，肉眼可见贴壁细胞层有大量细胞掉落时，倾斜培养瓶，加入大于所用胰酶一倍体积的培养基终止消化，轻轻吹打细胞层表面数次，使培养基分散；
4、吸取细胞悬液于15ml离心管内，1000rpm离心5分钟，轻轻倒去上清液，再加入5ml培养基重悬，离心洗涤，倒去上清液，加入7ml培养基重悬细胞，混合均匀，加入T-75 培养瓶中，放入培养箱继续培养。
第五步间充质干细胞天然分泌因子多肽收集
收集生长旺盛期的P3，P4，P5代的分泌的细胞多肽成分，即为干细胞天然分泌多肽活性添加物。
干细胞天然分泌多肽活性添加物的检测结果如下：
质量检测
流式细胞仪检测结果显示，贴壁细胞均表达CD44、CD29，低表达CD106，不表达造血细胞表型CD14、CD34、CD45和内皮细胞表型CD31，也不表达HLA-DR：细胞倍增时间为 30h，细胞周期分析表明，G0～G1期和+G2+M期所占比例分别为78.84％和11.16％。台酚蓝检测细胞存活率达98％。
生物安全检测
HBsAg阴性，HCV-Ab阴性，HIV1/2-Ab阴性，梅毒螺旋抗体阴性，CMV-IgM抗体阴性细菌检查阴性，真菌检查阴性，内毒素检查阴性，支原体检查阴性
一种复合多肽的面膜液，至少包括下述重量份的原料：干细胞天然分泌多肽活性添加物 3-5份，薰衣草提取物10-13份，骨胶原1-2份，透明质酸3-5份，甘油5-8份，维生素E6-9 份，PEG-40氢化蓖麻油7-10份，去离子水89-93份。
一种复合多肽的面膜液的制备方法如下：
1)采用超临界CO2萃取法工艺获取薰衣草提取物，萃取的压力、温度、时间等对薰衣草萃取率有影响。以挥发油的提取率作为评定标准，设计三因素三水平正交实验，得出，6.5Mpa， 4度，萃取1.5个小时是最佳的工艺条件。在步骤1中收集新鲜的薰衣草，风干，磨成粉，将薰衣草粉装入萃取罐中，在6.5Mpa，4度下通入CO2，萃取一定1.5小时后，从解析罐中放出萃取物，待用。
2)将薰衣草提取物10-13粉，透明质酸3-5份、甘油5-8份、维生素E 6-9份PEG-40氢化蓖麻油7-10份、去离子水89-93份。放入搅拌机中，90度搅拌均匀。在静置条件下，将搅拌容器冷却。
3)待温度降到40度后加入干细胞天然分泌多肽活性添加物3-5份、骨胶原1-2份，进行搅拌。搅拌的速度低于500r/min。为了保证干细胞天然分泌多肽活性添加物最佳活性，必须等到温度降到40度一下方能加入。搅拌速度应当低于500r/min。过高的机械剪切力也会大大影响添加物的活性和最佳效果。
将实施例1中制得的复合多肽的面膜液，随机选取50例志愿者自愿进行测试，测试结果如下：
样本数：50人，其中女性38人，男性12人，年龄23-59岁，平均年龄33岁。
本发明采用的天然干细胞分泌的肽成分更利于人体肌肤细胞的吸收。
表1随机抽样测试结果
将实施例1中制得的复合多肽的面膜液涂覆于皮肤表面，对角质层含水量随时间变化进行测试，设有两组对照，如图1和表1所示，第一组为不涂任何成分，第二组为涂覆甘油，第三组为涂覆本发明的复合多肽的面膜液的角质层含水量随时间变化曲线图。
从志愿者测试结果以及保湿性测试结果可知，本发明的复合多肽的面膜液适用于皮肤时，不会过敏，对肌肤无刺激，从图1可知本发明的面膜液保湿效果好，修复效果佳，本质原因是面膜液中的多肽为干细胞分泌的复合多肽成分，这些成分有效构成了利于皮肤细胞吸收和修复受损的完善的微环境，为皮肤角质层的修复提供了较佳的微环境。再者，本发明采用脐带来源间充质干细胞，取自于胎儿分娩时经过严格的检测和筛选的脐带，是多功能干细胞，发育等级仅次于胚胎干细胞，优于成体干细胞，可直接复制各种脏器和修复组织，有效避免了成体干细胞，比如脂肪干细胞，骨髓干细胞等年龄相关的干细胞衰老问题；本发明添加的干细胞复合多肽的实验环境皆为临床级别的GMP洁净实验室采用体外培养间充质干细胞，并收集干细胞生长旺盛期分泌的细胞多肽，经过严格的无菌检测，达到临床治疗级别，在保证使用的安全同时最大程度的保证了面膜液中多肽的活性和有效性，对皮肤的保湿和修复效果极佳。
以上所述仅为本发明的优选实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明所作的等效变换，均在本发明的专利保护范围内。

Claims (4)

1.一种干细胞天然分泌多肽活性添加物的制备方法，其特征在于：包括下述步骤
脐带样本采集：在靠近胎盘端2-3cm处，取大于20cm的脐带组织；
脐带间充质干细胞的分离和提取：将脐带剖开并剪成2cm的小段；
在一次性培养皿中加入含2％双抗的PBS洗液，将剪好的脐带放入其中洗涤2-3次，洗去残留血液，将挑去血管的脐带放入玻璃培养皿，用小剪刀剪碎至糊状，加入含胎牛的培养基，并且搅拌均匀，吸取糊状的脐带组织，分装至若干个培养瓶中，培养瓶中加入含胎牛培养基进行培养；
脐带间充质干细胞的培养：
(1)七天，在每个培养瓶中加入含胎牛的培养基，注意加液时培养瓶不能侧立，可将移液管伸入培养瓶内缓慢滴加，避免组织移动；
(2)约十四天左右，显微镜下可见MSC细胞爬出组织，轻轻晃动培养瓶使组织脱落去除，加入培养基继续培养；
(3)三天左右全量换液，并将没有去除的少量组织块用移液管轻轻吹下倒掉；
(4)显微镜下观察局部细胞融合度达到90％以上时，用胰酶消化传代，两个培养瓶的细胞合成一瓶；
干细胞传代：
(1)细胞融合度达到85％-90％时，吸出培养基，加入PBS洗涤，向培养瓶中加入胰酶；
(2)吸取细胞悬液于15ml离心管内，1000rpm离心5分钟；
(3)倒去上清液，再加入5ml培养基重悬，离心洗涤；
(4)倒去上清液，加入7ml培养基重悬细胞，混合均匀，加入T-75培养瓶中，放入培养箱继续培养；
间充质干细胞天然分泌因子多肽收集：收集生长旺盛期的P3、P4、P5代的分泌的细胞多肽成分即干细胞天然分泌多肽活性添加物。
2.一种复合多肽的面膜液，其特征在于：至少包括下列重量份的组分
3.一种复合多肽的面膜液制备方法，其特征在于：包括下述步骤
(1)采用超临界CO2萃取法工艺获取薰衣草提取物，收集新鲜的薰衣草，风干，磨成粉，将薰衣草粉装入萃取罐中，在6.5Mpa，4度下通入CO2，萃取一定1.5小时后，从解析罐中放出萃取物，待用；
(2)将薰衣草提取物10-13粉，透明质酸3-5份、甘油5-8份、维生素E 6-9份PEG-40氢化蓖麻油7-10份、去离子水89-93份。放入搅拌机中，90度搅拌均匀；
(3)在静置条件下，将搅拌容器冷却；
(4)待温度降到40°后加入权利要求1制备得的干细胞天然分泌多肽活性添加物3-5份、骨胶原1-2份，进行搅拌，搅拌的速度低于500r/min。
4.根据权利要求3所述的复合多肽的面膜液制备方法，其特征在于：所述步骤(4)的搅拌的速度为t，满足数量关系t<500r/min。
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