CN108611345A - 一种菠萝染色体二级结构的样品制备方法 - Google Patents

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赵丽华
蔡汉阳
侯志敏
张曼
陈票娟
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

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Abstract

本发明提供一种菠萝染色体二级结构的样品制备方法，通过配置特定的核裂解液、酶解缓冲液，对菠萝叶片进行样品处理、提取细胞核、酶切、电泳回收条带等步骤，获得菠萝染色体二级结构。通过有效的实验方案来揭示菠萝二级染色体的基本构象，为进一步研究菠萝功能基因，表观遗传等提供更准确的数据支持。

Description

一种菠萝染色体二级结构的样品制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种利用核小体占位分析菠萝染色体二级结构的样品制备方法。
背景技术
脱氧核糖核酸是组成染色体的主要成分，是基因的物质基础。生物界几乎所有生物都由四种脱氧核糖核苷酸排列成长链，两条长链互绕而成稳定结构，即1953年，沃森和克里克共同提出的DNA分子的双螺旋结构。生物体内的染色体和其组蛋白八聚体进一步相互作用，形成染色体二级结构，称为核小体(Kornberg and Lorch et al., 1999)。其中每个核小体单位包括200bp左右的DNA超螺旋和一个组蛋白八聚体及一个分子H1。组蛋白八聚体构成核小体的盘状核心结构；147bp的DNA分子超螺旋盘绕组蛋白八聚体1.75圈，组蛋白H1在核心颗粒外结合额外20bp DNA，锁住核小体DNA的进出端，起稳定核小体的作用。此时，染色体再进一步压缩，凝聚，形成高级结构状态的染色体分布在细胞核内或细胞质中（ThomasJO et al.，1975）。目前对非模式植物菠萝的染色体二级结构知之甚少。菠萝作为闽台重要的经济作物，近年来已解析了基因组，并证明了菠萝基因组可作为所有单子叶植物的参考基因组（Ray, 2014），但我们对菠萝染色体的结构及其功能基因的研究却很少。
作为二级结构状态存在的染色体基本单位核小体，对mRNA的转录过程起到关键的调控作用，其中反式作用因子和顺式作用元件的互相作用直接影响染色体二级结构状态（Li et al., 2007; Narlikar et al., 2013）。现国内外常用的分析方法有：（1）.核酸酶酶切PCR或高通量测序法：首先，用1%的甲醛固定材料，室温下孵育 10 分钟。用终浓度0.125 M 的甘氨酸以终止交联反应。加提核缓冲液4度孵育半小时，滤膜过滤液体，滤出液4℃ 11000g离心20min 。弃上清，加入1ml 预冷的酶切缓冲液，37℃反应10分钟。加20μlEDTA终止反应，12000转离心10分钟，取上清，用试剂盒回收200bp左右的核苷酸片段。片段回收后可以做定量PCR或者建库测序。 （2）. Hi-C：取材料用1%甲醛抽真空5分钟，进行固定，加甘氨酸（2M）终止反应。洗净材料，液氮中研磨，加和裂解液摇床上摇15min，两层Miracloth过滤后，3000g，4℃离心15min。去上清，完成提核。用HindIII 37℃ 800rpm 12h，进行酶解。之后回收DNA，利用biotin-14-dCTP末端标记DNA片段并进行过夜连接反应。反应结束后纯化DNA，再利用T4 DNA聚合酶去除末端标记。重新用乙醇纯化DNA片段后用超声波仪打断DNA，大小片段在300-500bp，之后进行建库测序。
以上两种方法是常规研究染色体二级结构的手段，基本适用于动物细胞或者模式生物。而在非模式植物菠萝中直接利用以上方法分析染色体的二级结构存在一定的困难，由于植物材料含高纤维或次生代谢物等，导致对植物染色体的提取存在一定难度，需要对原有的方法进行改良，寻找合适的步骤对菠萝染色体进行二级结构进行研究。而近年来流行利用Hi-C的方法，在一些非模式植物中的应用更少，目前还未见有报道。
发明内容
本发明的目的是为了研究菠萝二级染色体的结构，利用核小体占位来进行分析。提供一种新的，完整的，有效的实验方案来揭示菠萝二级染色体的基本构象，为进一步研究菠萝功能基因，表观遗传等提供更准确的数据支持。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
核小体占位分析菠萝染色体二级结构的样品制备方法步骤：
（1）溶液的配制：
核裂解液含有：0.25M蔗糖，pH6.8 PIPES 15mM，5mM MgCl2，60mM KCl，15mM NaCl，1mMCaCl2，0.9wt.%Triton X-100 ，用前加100μl cocktail溶液和1mM PMSF；cocktail制备方法为取1片cocktail溶于1ml水中，溶解完全。
酶解缓冲液含有：10wt.%蔗糖，pH 7.5 50mM Tris-HCl，4mM MgCl2，1mM CaCl2；
（2）材料的获得：
取菠萝较嫩的叶片研磨达成细粉末状；
（3）样品处理
将研磨好的菠萝叶片粉末转移至50ml离心管，加入核裂解液，至40ml；4℃ 处理30分钟；
（4）提取细胞核
将处理好的样品分两管，4℃，4000转/min，离心20分钟；去上清，1ml核核裂解液重悬沉淀，转移至1.5ml离心管，4℃，4000转/min，离心20分钟；可再洗一次沉淀，直至沉淀颜色较白；
（5）酶切
沉淀用1ml的酶解缓冲液悬浮，加0.1U MNase核酸酶，37℃反应10分钟，加20μl的0.5M、pH 8.0 EDTA终止反应；
（6）电泳回收条带
12000g 离心10分钟，取上清，分两管，加入等体积的酚：氯仿抽提一次，酚：氯仿体积比为1:1，然后加入2倍体积乙醇在-20℃下沉淀DNA 20分钟；12000g离心10分钟，取沉淀，75%乙醇洗一次；电泳并回收200 DNA条带；
（7）准备样品送测序或者PCR
回收试剂盒回收目的条带后，进行PCR反应，或者建库后送测序，即获得菠萝染色体二级结构。
本发明的优点在于：
本发明方法和之前的方法相比，能够有效的得到一定量的菠萝DNA，进一步优化了酶切时酶的用量以达到更好的效果，使得有足够量的短DNA片段，之后便于建库测序或PCR来研究菠萝染色体的二级结构。
附图说明
图1是本发明方法不同酶浓度下电泳观察到的DNA电泳图。其中第一泳道为不同条带大小的marker，1号泳道为4U的酶量进行酶切后得到的条带分布情况，2号泳道为1U的酶量进行酶切后得到的条带分布情况，3泳道为0.5U的酶量进行酶切后得到的条带分布情况，4泳道为0.1U的酶量进行酶切后得到的条带分布情况。对比电泳的结果，发现在0.1个U的酶量酶切后染色体片段大小最合适，且在对比共同样品量下，酶解剩下的DNA片段为是最多的，因此0.1U为最佳的用量。为之后进一步建库测序实验提供最佳条件。
具体实施方式
实施例1
方法步骤：
（1）溶液的配制：
核裂解液含有：0.25M蔗糖，pH6.8 PIPES 15mM，5mM MgCl2，60mM KCl，15mM NaCl，1mMCaCl2，0.9wt.%Triton X-100 ，用前加1×cocktail和1m MPMSF；；
酶解缓冲液含有：10wt.%蔗糖，pH 7.5 50mM Tris-HCl，4mM MgCl2，1mM CaCl2；
（2）材料的获得：
取菠萝较嫩的叶片10g（为最合适的起始量），蒸馏水清洗3遍，剪碎，放入液氮遇冷的研钵，进行研磨，由于显微较多需要研磨达十多次，直至成细粉末状。
（3）样品处理
将研磨好的菠萝叶片粉末转移至50ml离心管，加入核提取液，至40ml左右。4℃ 转30分钟。
（4）提取细胞核
将处理好的样品分两管，4℃，4000转，离心20分钟。去上清，1ml核提取液重悬沉淀，转移至1.5ml离心管，4℃，4000转，离心20分钟。可再洗一次沉淀，直至沉淀颜色较白。
（5）酶切
沉淀用1ml的酶解缓冲液悬浮，按梯度加入不同单位的MNase核酸酶（0.1U为最佳酶使用量），37℃反应10分钟。加20μl 的EDTA（0.5M，pH 8.0）终止反应。
（6）电泳回收条带
12000g 离心10分钟，取上清，分两管，加入等体积的酚：氯仿抽提一次，酚：氯仿体积比为1:1，再加入2倍体积乙醇-20℃沉淀DNA20分钟。12000g离心10分钟沉淀，75%乙醇洗一次。跑电泳(图1)，回收200左右DNA条带。
（7）准备样品送测序或者PCR
回收试剂盒回收目的条带后，进行PCR反应，或者建库后送测序。
由于目前为止还未在菠萝中实施核小体占位实验，根据在其它物种中核小体占位实验方法调节样品量和酶解量，优化了部分实验步骤。
以上所述步骤提供了详细完整的样品制备过程，因本发明为最新实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (1)

1.一种菠萝染色体二级结构的样品制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
（1）溶液的配制：
核裂解液含有：0.25M蔗糖，pH6.8 PIPES 15mM，5mM MgCl2，60mM KCl，15mM NaCl，1mMCaCl2，0.9wt.%Triton X-100，用前加100ul cocktail和1mM PMSF；
酶解缓冲液含有：10wt.%蔗糖，pH 7.5 50mM Tris-HCl，4mM MgCl2，1mM CaCl2；
（2）材料的获得：
取菠萝嫩的叶片研磨达成细粉末状；
（3）样品处理
将研磨好的菠萝叶片粉末转移至50ml离心管，加入核裂解液，至40ml；4℃ 处理30分钟；
（4）提取细胞核
将处理好的样品分两管，4℃，4000转/min，离心20分钟；去上清，1ml核核裂解液重悬沉淀，转移至1.5ml离心管，4℃，4000转/min，离心20分钟；可再洗一次沉淀，直至沉淀颜色较白；
（5）酶切
沉淀用1ml的酶解缓冲液悬浮，加0.1UM Nase核酸酶，37℃反应10分钟，加20μl 的0.5M、pH 8.0 EDTA终止反应；
（6）电泳回收条带
12000g 离心10分钟，取上清，分两管，加入等体积的酚：氯仿抽提一次，酚：氯仿体积比为1:1，然后加入2倍体积乙醇在-20℃下沉淀DNA 20分钟；12000g离心10分钟，取沉淀，75%乙醇洗一次；电泳并回收200bp DNA条带；
（7）准备样品送测序或者PCR
回收试剂盒回收目的条带后，进行PCR反应，或者建库后送测序，即获得菠萝染色体二级结构。
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