CN102002507A

CN102002507A - 利用CsMADS1基因提高植物中目的基因表达量的方法

Info

Publication number: CN102002507A
Application number: CN 201010538337
Authority: CN
Inventors: 白书农; 李峰; 顾海涛; 孙进京; 王东辉; 许智宏
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2010-11-08
Filing date: 2010-11-08
Publication date: 2011-04-06
Anticipated expiration: 2030-11-08
Also published as: CN102002507B

Abstract

本发明公开了一种利用CsMADS1基因提高植物中目的基因表达量的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤1)或2)：1)将CsMADS1蛋白的编码基因和外源基因分别导入目的植物中，得到目的基因表达量强于所述目的植物的转基因植物；2)将CsMADS1蛋白的编码基因导入目的植物中，得到目的基因表达量强于所述目的植物的转基因植物。实验证明：雌激素诱导体系对要检测的目的基因没有影响。将CsMADS1基因与PCsETR1::GUS分别导入拟南芥中后，在雌激素诱导下，外源基因GUS表达量提高了，拟南芥内源基因AP3、ETR1、ERS1、ERS2的表达量也大大提高了。

Description

利用CsMADS1基因提高植物中目的基因表达量的方法

技术领域

本发明涉及一种提高植物中目的基因表达量的方法。

背景技术

将特定的外源目标基因转入植物，创造新的种质，改进植物性状，提高植物的品质是目前植物植物基因工程应用的主要形式，提高目的基因的表达对达成转基因植物的目的性状具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种培育目的基因表达量增强的转基因植物的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤1)或2)：

1)将CsMADS1蛋白的编码基因和外源基因分别导入目的植物中，得到目的基因表达量强于所述目的植物的转基因植物；

2)将CsMADS1蛋白的编码基因导入目的植物中，得到目的基因表达量强于所述目的植物的转基因植物；

上述CsMADS1蛋白的氨基酸序列是如下a)或b)：

a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列表中序列3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的由a)衍生的蛋白质。

进一步，上述CsMADS1蛋白的编码基因是如下I)或II)或III)：

I)其编码序列是序列表中的序列2；

II)在严格条件下与I)基因杂交且编码所述CsMADS1蛋白的基因；

III)与I)的基因具有90％以上的同源性且编码所述CsMADS1蛋白的基因。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

步骤1)和步骤2)中，所述CsMADS1蛋白的编码基因是通过重组表达载体导入所述目的植物中的；所述重组表达载体是将所述CsMADS1蛋白的编码基因插入到雌激素诱导表达载体的多克隆位点中得到的载体。

具体地讲，上述雌激素诱导表达载体是Px6。

步骤1)和步骤2)中所述目的植物是双子叶植物或单子叶植物，优选是拟南芥。

步骤1)中，所述外源基因是与黄瓜乙烯受体CsETR1启动子一起导入所述目的植物中的；所述由黄瓜乙烯受体CsETR1启动子的编码序列如序列表中序列1所示。

步骤1)中，所述目的基因是所述外源基因和/或内源基因。

所述内源基因是ETR1，ERS1，ERS2和AP3。

步骤2)中，所述目的基因是内源基因；所述内源基因优选是ETR1，ERS1，ERS2和AP3。

所述ETR1的Genbank号为NM_105305，所述ERS1的Genbank号为NM_129658，所述ERS2的Genbank号为NM_100312，所述AP3的Genbank号为NM_115294。

实验证明：雌激素诱导体系对要检测的目的基因没有影响。将CsMADS1基因与PCsETR1::GUS分别导入拟南芥中后，在雌激素诱导下，外源基因GUS表达量提高了，拟南芥内源基因AP3、ETR1、ERS1、ERS2的表达量也大大提高了。

附图说明

图1为转基因植物的GUS检测，从左到右依次为marker，1-15号植株基因组PCR检测。

图2为为转基因植物的CsMADS1检测，从左到右依次为marker，1-15号植株基因组PCR检测。

图3为雌激素诱导体系对目的基因无影响验证，PCsETR1::GUS阳性植株在雌激素诱导后，ETR1、ERS1和GUS基因表达没有明显变化。

图4为转基因株系中CsMADS1、GUS检测。

图5为转基因株系的CsMADS1的Western blot检测，其中nuclear protin为核蛋白，cytoplasm protin为胞质蛋白；MADS1是CsMADS1的简写；Tublin为广泛表达的蛋白，作为内参。

图6为转基因株系中内源基因表达检测。

其中，图3-图6中的mock为水代替雌激素负对照，induce为进行雌激素诱导的实验组。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、转基因植物的培育及其基因表达检测

一、转基因植物的培育

1、重组表达载体构建

1)黄瓜乙烯受体CsETR1启动子(PCsETR1)与外源基因(GUS)构成的重组载体

利用5′GTAAGCTTtcttttaatcatagg和ccatggGTCCATGGGAGTCTAAATGCAATGTT从黄瓜基因组中克隆到黄瓜ETR1启动子，命名为PCsETR1，经HINDIII和Nco I双酶切后连入pCAMBIA1305.1(CAMBIA公司)的相应多克隆位点，构成PCsETR1::GUS载体。

测序表明：PCsETR1::GUS是在pCAMBIA1305.1的HIND III和Nco I酶切位点间插入了序列表中序列1所示的PCsETR1启动子。

2)CsMADS1基因插入雌激素诱导表达载体Px6构成的重组载体

用CsMADS1引物(S：actagtATGGCTCGTGGGAAGATCCAGA和A：ctcgagCTCAAGGAGTGGATAGGTAGTG)，从黄瓜cDNA模板中PCR扩增全长cDNA，经过双酶切(Spe1和Xho1)连入载体Px6(购自NEB公司)的相应多克隆位点，构成CsMADS1-Px6。

测序表明：CsMADS1-Px6是在Px6的Spe1和Xho1酶切位点间插入了序列表中序列2所示的CsMADS1基因。

2、转基因植物构建

①将步骤1中的PCsETR1::GUS通过花絮浸泡方法方法导入拟南芥(Col-0生态型)(美国拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC))，得到含GUS报告基因的转基因拟南芥。

②将步骤1中的CsMADS1-Px6通过花絮浸泡方法方法导入上述含GUS报告基因的转基因拟南芥中，得到转基因植物。

3)筛选阳性株系

将步骤2)得到的转基因植物在抗性培养基(含卡纳霉素和潮霉素的MS培养基)中筛选到具有双抗性的阳性苗转到土里培养，长出真叶后进行基因组DNA的PCR组鉴定，筛选同时具有GUS报告基因(表1中的引物)(图1)和CsMADS1(表1中的引物)(图2)的阳性植株。

二、基因表达检测

(一)雌激素诱导体系的影响

为了确定雌激素诱导体系对要检测的目的基因没有影响，对只转入GUS报告基因的拟南芥株系(即上述步骤一中步骤2的①中含GUS报告基因的转基因拟南芥)进行雌激素诱导，用表1中的引物Real-timePCR检测了四个基因：GUS，ETR1，ERS1，ACS7。除ACS7略有升高外，其余三个基因对雌激素处理都没有反应，说明雌激素诱导表达系统正常(图3)。

表1.检测引物

(二)基因表达检测

将步骤一中经鉴定过的阳性苗，采用花序浸泡雌激素17β-雌二醇(17β-estradiol)的方法来检测诱导表达后目的基因的表达水平，每次选用4-5株拟南芥花序取平均值来降低个体间表达差异，处理时间为三到五分钟，处理后透光密封放置8小时。

1、Real-timePCR(外源基因：CsMADS1、GUS)

提取RNA反转录后，利用表1中引物进行Real-timePCR检验。经过雌激素处理的转基因植株，与负对照(水代替雌激素)相比，CsMADS1和GUS基因表达都有明显上升(图4)。

2、Western blot(CsMADS1)

雌激素诱导后通过Western blot检测转基因植株(分别测核蛋白和胞质蛋白中CsMADS1蛋白)，经过诱导后CsMADS1蛋白含量明显增加(图5)，并且CsMADS1集中在诱导后的核蛋白中，说明雌激素诱导体系不仅在转录水平激活CsMADS1表达，而且可以翻译成为蛋白质进入细胞核。

其中，Western blot检测步骤：

1)取材：叶子4g。

2)植物细胞核提取：液氮研磨材料，加入25ml预冷的提核缓冲液(Nuclei isolation buffer：0.25mM蔗糖，15mM PIPES(pH6.8)，5mM MgCl2，60mM KCl，15mM NaCl，1mM CaCl2，0.9％Triton X-100(用前加1Xcocktail和1mMPMSF))，其中PMSF和cocktail现用现加。

3)用滤膜过滤研磨得到的液体，单层过滤2次，滤出液4℃ 11000g离心20min。上清可作为胞质蛋白保存。

4)核裂解：弃上清，向沉淀加入1ml预冷的Co-IP buffer(Co-IP buffer：Nuclei isolation buffer：0.25mM蔗糖，15mM PIPES(pH6.8)，5mM MgCl2，60mM KCl，15mM NaCl，1mM CaCl2，0.9％Triton X-100(用前加1Xcocktail和1mMPMSF))，重悬，将重悬液转入新的1.5ml EP管中。

5)超声破碎：将EP管放在EP管架上并泡在冰水混合物中，超声条件：200W 3-5S。中间。

6)4℃ 13800g离心10分钟，取上清作为核蛋白。

7)煮样：用2x蛋白电泳buffer50-100ul煮沉淀10min.

8)western检测(western检测所用抗体是anti-CsMADS1(Santa cruz(sc-12639))。

3、Real-timePCR(内源基因：AP3、ETR1、ERS1、ERS2)

提取RNA反转录后用表1所示引物针对AP3、ETR1、ERS1、ERS2分别进行Real-timePCR检验。在雌激素诱导实验中拟南芥乙烯受体基因ETR1，ERS1，ERS2的表达也有明显上升，并且花器官中AP3表达量也明显增加(图6)，说明CsMADS1可以激活AP3表达。

Claims

1.一种培育目的基因表达量增强的转基因植物的方法，包括如下步骤1)或2)：

所述CsMADS1蛋白的氨基酸序列是如下a)或b)：

a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述CsMADS1蛋白的编码基因是如下I)或II)或III)：

I)其编码序列是序列表中的序列2；

II)在严格条件下与I)基因杂交且编码所述CsMADS1蛋白的基因；

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤1)和步骤2)中，所述CsMADS1蛋白的编码基因是通过重组表达载体导入所述目的植物中的；所述重组表达载体是将所述CsMADS1蛋白的编码基因插入到雌激素诱导表达载体的多克隆位点中得到的载体。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述雌激素诱导表达载体是Px6。

5.如权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：步骤1)和步骤2)中所述目的植物是双子叶植物或单子叶植物，优选是拟南芥。

6.如权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述外源基因是与黄瓜乙烯受体CsETR1启动子一起导入所述目的植物中的；所述由黄瓜乙烯受体CsETR1启动子的编码序列如序列表中序列1所示。

7.如权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述目的基因是所述外源基因和/或内源基因。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述内源基因是ETR1，ERS1，ERS2和AP3。

9.如权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述目的基因是内源基因；所述内源基因优选是ETR1，ERS1，ERS2和AP3。

10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述ETR1的Genbank号为NM_105305，所述ERS1的Genbank号为NM_129658，所述ERS2的Genbank号为NM_100312，所述AP3的Genbank号为NM_115294。