CN106755526A

CN106755526A - 一种墨兰“唇瓣和花瓣萼片化”性状相关的功能性分子标记及其鉴定方法

Info

Publication number: CN106755526A
Application number: CN201710096526.8A
Authority: CN
Inventors: 苏诗豪; 邵晓宇; 黄霞; 罗达
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: National Sun Yat Sen University
Priority date: 2017-02-22
Filing date: 2017-02-22
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2037-02-22
Also published as: CN106755526B

Abstract

本发明提供了一种墨兰“唇瓣和花瓣萼片化”性状相关的功能性分子标记，所述功能性分子标记为M4wt或M4m，所述M4wt的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述M4m的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明通过分离和比对多种墨兰品种中的相关基因序列，得到了在“唇瓣和花瓣萼片化”品种“绿云”与“太阳花”中有别于其他墨兰品种的1处功能特异性位点。基于这处位点差异设计了三条特异性引物：M4F1，M4F2和M4R。利用引物对M4F1+M4R和M4F2+M4R扩增墨兰基因组总DNA后进行琼脂糖凝胶电泳检测，可以快速鉴定“唇瓣和花瓣萼片化”的墨兰品种，本发明提供的方法对墨兰种质资源的鉴定和保护、分子标记辅助育种以及分子设计育种具有重要的价值和意义。

Description

一种墨兰“唇瓣和花瓣萼片化”性状相关的功能性分子标记及其鉴定方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地，涉及一种墨兰“唇瓣和花瓣萼片化”性状相关的功能性分子标记及其鉴定方法。

背景技术

国兰作为中国传统名花，一般指我国原产的兰属的一些地生种类，如春兰（Cymbidium goeringii）、莲瓣兰（Cymbidium tortisepalum）、建兰（Cymbidiumensifolium）、寒兰（Cymbidium kanran）以及墨兰（Cymbidium sinense）等（陈心启，1988）。国兰栽培始于唐宋，盛于明清，自明代《南中幽芳录》中提出了“以瓣论花”的观点，瓣型理论逐渐成为人们选育鉴赏国兰的基准，一直沿用至今。

国兰花的标准形态包括最外轮三枚萼片、第二轮三枚花瓣，其中一枚特化为色彩艳丽的唇瓣、最内轮一个蕊柱和一个子房。在国兰瓣型变异中，有一类与众不同的“唇瓣和花瓣萼片化”类型，其花朵的唇瓣没有异色色斑，花瓣和唇瓣变成细长的萼片状，且蕊柱也产生异化。这类瓣型品种广泛分布在地生兰属的各个种中，如春兰中的“黑珍珠”、莲瓣兰中的“奇花素”、建兰中的“七仙女”以及墨兰中的“绿云”、“太阳花”等。

墨兰又称“报岁兰”，其花期适逢中国传统春节，已经发展成为产业化程度最高的兰花品种之一。通过杂交育种获得瓣型变异的奇花品种是墨兰育种的主要方向之一。由于墨兰从种子萌发到开花需要数年的生长周期，在非花期只能借助叶形、根系、叶甲等辅助性状对于奇花品种进行鉴定，而这不仅要求鉴定者具有极其丰富的经验，且这些性状易受种植环境等影响，因而极大地影响了鉴定结果的可靠性。分子标记辅助育种技术具有方便快捷、周期短、准确性高、不受种植环境影响等优点，在近年深受农艺工作者的青睐。因此，利用分子生物学手段开发并应用墨兰特异瓣型性状相关的功能性分子标记，不但可以对特定瓣型品种进行快速识别和品种保护，而且可以结合杂交育种、遗传转化等技术，使基因聚合的分子设计育种成为可能。

近年来，在蝴蝶兰和文心兰中的研究发现一类具有MADS-box结构域的同源异型基因，对于兰花花瓣的发育起着至关重要的调控作用。这类DEF-like基因在兰科植物的进化历程中发生了至少两次复增，产生了四个亚枝（clade1/2/3/4），这四个亚枝的成员在不同兰花花器官中具有不同的表达模式，其中第三进化枝（clade3）DEF-like基因在兰花的花瓣、唇瓣和蕊柱中具有高的表达水平，对内轮花器官的发育起到至关重要的作用（Mondragón-Palomino等，2011）。

如何利用上述基因，并实现墨兰分子标记辅助育种，保护墨兰种质资源，提高育种效率以及降低育种成本，快速、准确地鉴定墨兰“唇瓣和花瓣萼片化”性状的功能性分子标记具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是为了能对“唇瓣和花瓣萼片化”性状相关墨兰品种进行快速、高效、准确的鉴定和检测。为墨兰种质资源的鉴定和保护、分子标记辅助育种以及分子设计育种奠定了分子基础。

本实验室克隆了墨兰中的第三进化枝（clade3）DEF-like基因CsMADS1，该基因主要在墨兰的花瓣、唇瓣和蕊柱中高表达。通过对收集到的不同墨兰品种进行分析，我们发现，在具有“唇瓣和花瓣萼片化”性状的墨兰品种“绿云”和“太阳花”中，CsMADS1在各花器官的表达均明显下降。为了推进CsMADS1基因在墨兰分子标记辅助育种中的应用，保护墨兰种质资源，提高育种效率以及降低育种成本，利用该基因开发出可以快速、准确地鉴定墨兰“唇瓣和花瓣萼片化”性状的功能性分子标记具有十分重要的意义。

本发明的技术目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种墨兰“唇瓣和花瓣萼片化”性状相关的功能性分子标记，所述功能性分子标记为M4wt或M4m，所述M4wt的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述M4m的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明同时提供一种用于检测所述的功能性分子标记的引物对，所述引物对为M4F1+M4R或M4F2+M4R，所述M4F1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，M4F2的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，M4R的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

包含所述的引物对，并用于检测所述的功能性分子标记的试剂盒也在本发明的保护范围内。

所述的功能性分子标记和引物对在 “唇瓣和花瓣萼片化”的性状相关的墨兰品种鉴定中的应用均在本发明的保护范围内。

本发明同时提供一种 “唇瓣和花瓣萼片化”的性状相关的墨兰品种鉴定的方法，所述方法为首先提取检测对象的基因组DNA；然后利用所述的引物对进行PCR扩增，并检测PCR扩增结果。

优选地，利用所述的引物对进行PCR扩增时，根据扩增片段的有无，确定检测对象是否为“唇瓣和花瓣萼片化”的形状相关的墨兰品种。

优选地，当采用M4F1+M4R引物对进行扩增时，如果扩增得到功能性分子标记M4wt，则检测对象为其他瓣型品种；

当采用M4F2+M4R进行扩增时，如果扩增得到功能性分子标记M4m，则检测对象为“唇瓣和花瓣萼片化”的形状相关的墨兰品种。

优选地，采用CTAB法提取检测对象的基因组DNA。

优选地，利用琼脂糖凝胶电泳法对PCR扩增结果进行检测。

优选地，所述“唇瓣和花瓣萼片化”性状相关的墨兰品种为“绿云”或“太阳花”。

更具体地，基因组DNA提取方法为：取0.1g叶片加入液氮研磨至粉末状；加入300μl的1.5％CTAB抽提液，置于65℃热水浴进行裂解60min；加入300ul的氯仿：异戊醇溶液（24:1）猛烈混匀，常温下12000rpm离心10min。转移上清加入等体积-20℃预冷的异戊醇，上下颠倒混匀后置于-20℃静置30min后12000rpm离心10min。弃去上清液，加入500μl70％乙醇洗涤，12000rpm离心5min，重复一次。在通风橱中彻底吹干残留乙醇后加入100μl 1×TEBuffer溶解DNA。DNA溶液置于-80℃保存、备用。

PCR扩增（CsMADS1基因）的方法为：10X KOD PCR Buffer 5μl，2.5mM dNTPs 5μl，10pmol 上下游引物各1μl，1U/μl KOD DNA聚合酶1μl，基因组总DNA 100ng，ddH₂0 补齐至50μl。PCR扩增条件为94℃ 3min；98℃ 30sec，55℃ 30sec，68℃ 1min，35个循环；68℃5min；在上述PCR扩增产物中加入10μl的载样缓冲液，混匀后点样于含有SYBR Green染料的1%琼脂糖凝胶点样孔中。在1XTAE电泳缓冲液中，以10V/cm的电压进行电泳。

多序列比对方法为：使用ClustalW序列比对软件将获得的基因序列进行多序列比对。

PCR扩增和检测分子标记M4wt和M4m的方法为：10X Taq PCR Buffer 3μl，2mMdNTP Mix 3μl，10pmol 上下游引物各1μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl，基因组总DNA50ng，ddH₂0 补齐至30μl。M4F1+M4R引物对的PCR扩增条件为94℃ 3min；94℃ 30sec，55℃30sec，72℃ 1min，30个循环；72℃ 3min；M4F2+M4R引物对的PCR扩增条件为94℃ 3min；94℃ 30sec，57℃ 30sec，72℃ 1min，30个循环；72℃ 3min；在上述PCR扩增产物中加入5μl的载样缓冲液，混匀后点样于含有SYBR Green染料的1%琼脂糖凝胶点样孔中。在1XTAE电泳缓冲液中，以10V/cm的电压进行电泳，然后置于凝胶成像仪中进行拍照分析。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明与传统方法相比能够快速、高效、准确地鉴定“唇瓣和花瓣萼片化”的墨兰品种。传统的花型鉴定方法通常在花期时期进行，这就极大了制约了鉴定的效率；而借助叶形、根系、叶甲等具有相关性的辅助性状鉴定花型，则对鉴定者的水平提出了很高的要求，且在准确度上大打折扣。本发明的鉴定方法还可以应用于墨兰的分子标记辅助育种中，为保护墨兰种质资源，提高育种效率以及降低育种成本都具有十分重要的意义。

附图说明

图1为不同墨兰品种中的CsMADS1的序列比对结果。

图中wt、s、lv和w分别代表“企黑”、“文山奇蝶”、“绿云”和“太阳花”中相应CsMADS1的部分序列，可以看出在“唇瓣和花瓣萼片化”的墨兰品种“绿云”和“太阳花”中，133 bp和134bp处发生了2 bp的缺失。

图2为分子标记M4wt和M4m的序列比对结果。

图3为M4F1+M4R引物对在多种墨兰品种中对分子标记M4wt的PCR扩增结果。

图中M为marker DL2000，黑色箭头所指条带大小为750 bp。1~9分别是“企黑”、“华光蝶”、“十八娇”、“绿云”、“岭南大梅”、“文山奇蝶”、“太阳花”、“玉麒麟”以及“大屯麒麟”。从图中可看出M4F1+M4R引物不能在墨兰“唇瓣和花瓣萼片化”品种（4为“绿云”，7为“太阳花”）中扩增出功能性分子标记M4wt，而在其他瓣型品种中均能扩增得到。

图4为M4F2+M4R引物对在多种墨兰品种中对分子标记M4m的PCR扩增结果。

图中M为marker DL2000，黑色箭头所指条带大小为750 bp。1~9分别是“企黑”、“华光蝶”、“十八娇”、“绿云”、“岭南大梅”、“文山奇蝶”、“太阳花”、“玉麒麟”以及“大屯麒麟”。从图中可看出M4F2+M4R引物仅能在“绿云”和“太阳花”中扩增出与其“唇瓣和花瓣萼片化”瓣型性状相关的功能性分子标记M4m，而在其他瓣型品种中均不能扩增得到。

具体实施方式

下面通过实施例和附图对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制。

如无特殊说明，均参考《分子克隆实验指南(第3版)》（科学出版社，2002）。本实施例中所使用的实验试剂，如无特殊说明，均可通过商业途径购得。

（1）品种收集和DNA提取。本实施例中使用的9种墨兰品种均来自深圳市兰科植物保护研究中心。它们分别是：“企黑”、“华光蝶”、“十八娇”、“绿云”、“岭南大梅”、“文山奇蝶”、“太阳花”、“玉麒麟”以及“大屯麒麟”。用CTAB法进行墨兰叶片总DNA提取。取0.1g叶片加入液氮研磨至粉末状；加入300μl的1.5％CTAB抽提液，置于65℃热水浴进行裂解60min；加入300ul的氯仿：异戊醇溶液（24:1）猛烈混匀，常温下12000rpm离心10min。转移上清加入等体积-20℃预冷的异戊醇，上下颠倒混匀后置于-20℃静置30min后12000rpm离心10min。弃去上清液，加入500μl 70％乙醇洗涤，12000rpm离心5min，重复一次。在通风橱中彻底吹干残留乙醇后加入100μl 1×TE Buffer溶解DNA。DNA溶液置于-80℃保存、备用。

（2）CsMADS1基因序列比对和差异位点的鉴定。利用PCR扩增得到多个墨兰品种中的CsMADS1基因序列，使用ClustalW序列比对软件将获得的基因序列进行多序列比对。如图1所示，我们发现在“唇瓣和花瓣萼片化”的墨兰品种“绿云”和“太阳花”中，该基因在133bp，134bp处发生了2 bp的缺失。

（3）引物设计。基于步骤（2）所述位点差异，设计出三条特异性引物：

M4-F1（SEQ ID NO：3）：5’-TGTGACGCTCAGCTCTCCCT-3’；

M4-F2（SEQ ID NO：4）：5’-TGTGACGCTCAGCTCTCCTG-3’；

M4-R（SEQ ID NO：5）：5’-CTACAAAGATCGCAGTGATGGAAG-3’。

（4）分子标记的PCR扩增体系为：10X Taq PCR Buffer 3μl，2mM dNTP Mix 3μl，10pmol 上下游引物各1μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl，基因组总DNA 50ng，ddH₂0 补齐至30μl。M4F1+M4R引物对的PCR扩增条件为94℃ 3min；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1min，30个循环；72℃ 3min；M4F2+M4R引物对的PCR扩增条件为94℃ 3min；94℃ 30sec，57℃30sec，72℃ 1min，30个循环；72℃ 3min；

（5）电泳检测：在上述PCR扩增产物中加入5μl的载样缓冲液，混匀后点样于含有SYBRGreen染料的1%琼脂糖凝胶点样孔中。在1XTAE电泳缓冲液中，以10V/cm的电压进行电泳，然后置于凝胶成像仪中进行拍照分析。

（6）结果分析：对9个墨兰品种进行功能性分子标记M4m和M4wt检测，电泳结果如图2和图3所示。结果显示，以M4F2和M4R为引物，仅能在“唇瓣和花瓣萼片化”的墨兰品种“绿云”和“太阳花”中扩增出691bp的特异片段；而以M4F1和M4R为引物，则仅能在其他瓣型的墨兰品种“企黑”、“华光蝶”、“十八娇”、 “岭南大梅”、“文山奇蝶”、“玉麒麟”和“大屯麒麟”中扩增出693bp的特异片段。这说明利用分子标记M4m和M4wt可以将 “唇瓣和花瓣萼片化”的墨兰品种与其它瓣型的墨兰品种区分开来，用于墨兰“唇瓣和花瓣萼片化”性状的筛选和鉴定。

上述实施例仅用于解释说明本发明的构思，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，都应属于本发明专利的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学

<120> 一种墨兰"唇瓣和花瓣萼片化"性状相关的功能性分子标记及其鉴定方法

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 693

<212> DNA

<213> M4wt

<400> 1

tgtgacgctc agctctccct tgtaatgttc tcgagcactg gcaagttctc tgagtattgt 60

agtccaacca ctgagtaagt ttaatttgaa cgtgttttgc cacatcagtt tcttctgttg 120

ttcaatttcc tcattttagg gttcctgttg cttacgtata tctattgctt ccagcaccaa 180

gagcatatat gatcgttacc agcaggtgtc cggcataaat ctatggagct cgcagtacga 240

ggcgagtgat atctctacga tgaaactagt ataaagaatt atatatagaa tttttctagg 300

aattcgtaag gaaacaataa aacttcgtaa ttatttatta ttatttttat cataatcatt 360

atcatcagat tcatcaccat tattattatt attattatta tagccatagg atcactttgt 420

attattgctt agtaggattt attgtcgagt ataagatgtt aagaggccgg agcatcagac 480

gtcgaattat atccactctc agttaattat ataaacaatt tttatcttta ataataagag 540

tcaatcttag taatgatttg tcagaataca ttcaaaaatt ttgatgtaaa acaaaatttt 600

gtatggcgct tttttttttc ggtgttcgac aaaatttttt aaggaattcc gtatcaatat 660

ttggtccctc ttccatcact gcgatctttg tag 693

<210> 2

<211> 691

<212> DNA

<213> M4m

<400> 2

tgtgacgctc agctctcctg taatgttctc gagcactggc aagttctctg agtattgtag 60

tccaaccact gagtaagttt aatttgaacg tgttttgcca catcagtttc ttctgttgtt 120

caatttcctc attttagggt tcctgttgct tacgtatatc tattgcttcc agcaccaaga 180

gcatatatga tcgttaccag caggtgtccg gcataaatct atggagctcg cagtacgagg 240

cgagtgatat ctctacgatg aaactagtat aaagaattat atatagaatt tttctaggaa 300

ttcgtaagga aacaataaaa cttcgtaatt atttattatt atttttatca taatcattat 360

catcagattc atcaccatta ttattattat tattattata gccataggat cactttgtat 420

tattgcttag taggatttat tgtcgagtat aagatgttaa gaggccggag catcagacgt 480

cgaattatat ccactctcag ttaattatat aaacaatttt tatctttaat aataagagtc 540

aatcttagta atgatttgtc agaatacatt caaaaatttt gatgtaaaac aaaattttgt 600

atggcgcttt tttttttcgg tgttcgacaa aattttttaa ggaattccgt atcaatattt 660

ggtccctctt ccatcactgc gatctttgta g 691

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> M4-F1

<400> 3

tgtgacgctc agctctccct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> M4-F2

<400> 4

tgtgacgctc agctctcctg 20

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> M4-R

<400> 5

ctacaaagat cgcagtgatg gaag 24

Claims

1.一种墨兰“唇瓣和花瓣萼片化”性状相关的功能性分子标记，其特征在于，所述功能性分子标记为M4wt或M4m，所述M4wt的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述M4m的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种用于检测权利要求1所述的功能性分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对为M4F1+M4R或M4F2+M4R，所述M4F1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，M4F2的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，M4R的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

3.一种用于检测权利要求1或2所述的功能性分子标记的试剂盒，其特征在于，包含权利要求3所述的引物对。

4.权利要求1所述的功能性分子标记在 “唇瓣和花瓣萼片化”的性状相关的墨兰品种鉴定中的应用。

5.权利要求2所述的引物对在“唇瓣和花瓣萼片化”的性状相关的墨兰品种鉴定中的应用。

6.一种 “唇瓣和花瓣萼片化”的性状相关的墨兰品种鉴定的方法，其特征在于，首先提取检测对象的基因组DNA；然后利用权利要求2所述的引物对进行PCR扩增，并检测PCR扩增结果。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，利用所述的引物对进行PCR扩增时，根据扩增片段的有无，确定检测对象是否为“唇瓣和花瓣萼片化”的形状相关的墨兰品种。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，当采用M4F1+M4R引物对进行扩增时，如果扩增得到功能性分子标记M4wt，则检测对象为其他瓣型品种；

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，采用CTAB法提取检测对象的基因组DNA。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，利用琼脂糖凝胶电泳法对PCR扩增结果进行检测。