CN108586179B - 一种从葛根中同时提取4种异黄酮类化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从葛根中同时提取4种异黄酮类化合物的方法，同时提取的4种异黄酮类化合物分别为：葛根素、3‑甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元；提取方法包括如下步骤：1)将洗净干燥后的葛根进行粉碎、过筛，得葛根粉体，葛根粉体的粒度大于109目；2)将葛根粉体与水按质量比为1:16‑18混合后进行高温反应，反应的温度为118‑122℃，压强为0.1‑0.2MPa；3)反应完成后，对反应后溶液进行萃取，取上清液，过滤后检测。该方法可以同时提高葛根素、3‑甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元这四种异黄酮类物质的提取率，并且可以同时取得最佳的提取率。

Description

一种从葛根中同时提取4种异黄酮类化合物的方法
技术领域
本发明具体涉及一种从葛根中同时提取4种异黄酮类化合物的方法。
背景技术
葛根别称：野葛、葛条、甘葛、葛藤，为豆科植物野葛或甘葛藤萝的块根。野葛属多年生落叶藤本，具有粗壮藤条，长可达8米，全体被黄色长硬毛，茎基部木质，有粗厚的块状根。羽状复叶具3小叶；托叶背着，卵状长圆形，具线条；小托叶线状披针形，与小叶柄等长或较长；小叶三裂，偶尔全缘，顶生小叶宽卵形或斜卵形，长8～19厘米，宽5～18厘米，顶端长渐尖，侧生小叶斜卵形，稍小，上面被淡黄色、平伏的疏柔毛。下面较密；小叶柄被黄褐色绒毛。荚果长椭圆形，长5～9厘米，宽8～11毫米，扁平，被褐色长硬毛。花期为9～10月，果期为11～12月。生于山坡草丛中或路旁及较阴湿的地方，或生于海拔1000～3200米的山沟林中。
葛根是中国南方一些省区的一种常食蔬菜，其味甘凉可口，常作煲汤之用，也可作药物，在中国大部地区有产，主要分布于辽宁、河北、河南、山东、安徽、江苏等地。
野生葛根内含12％的异黄酮类化合物，如葛根素、大豆黄酮苷、花生素等营养成分，还有蛋白质、氨基酸、糖和人体必需的铁、钙、铜、硒等矿物质。葛根具有抗菌、活血化瘀、扩张冠状动脉血管和脑血管、降低心肌耗氧量、改善心肌收缩功能、促进血液循环、增强机体免疫力等药理与保健作用[1-3]，是老少皆宜的名贵滋补品，有“千年人参”之美誉。
葛根中的主要生物活性成分为异黄酮类化合物，包括葛根素(puerarin，黄豆苷元-8-C-葡萄糖苷)、黄豆苷(daidzin，黄豆苷元-7-O-葡萄糖苷)、黄豆苷元(daidzein)等，其中以葛根素的量最高。
现有技术中有采用亚临界水提取葛根中的异黄酮类物质，一方面，由于不同异黄酮类物质的极性不同，所需的亚临界水的最佳条件差别较大，在对葛根中的多种有效成分同时进行提取时，难以保证葛根有效成分的同时取得良好的提取效率；另一方面，采用亚临界水进行提取时，一般需要较高的温度和压力才能达到较好的提取效果，对反应容器的密封和耐压性能要求较严格。
发明内容
针对上述现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供一种从葛根中同时提取4种异黄酮类化合物的方法。
为了达到以上目的，本发明的技术方案为：
一种从葛根中同时提取4种异黄酮类化合物的方法，同时提取的4种异黄酮类化合物分别为：葛根素、3-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元；
提取方法包括如下步骤：
1)将洗净干燥后的葛根进行粉碎、过筛，得葛根粉体，葛根粉体的粒度大于109目；
2)将葛根粉体与水按质量比为1:16-18混合后进行高温反应，反应的温度为118-122℃，压强为0.1-0.2MPa；
3)反应完成后，对反应后溶液进行萃取，取上清液，过滤后检测。
试验证明，当葛根粉体与水的质量比在1:16-18时，与其他参数进行配合时，可以同时提高葛根素、3-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元这四种异黄酮类物质的提取效率；采用该种方法时，对反应体系的压强要求较低，对反应容器的要求低，降低了异黄酮的提取成本。
优选的，步骤1)中，葛根粉体的粒度为110-120目。试验证明，葛根粉体的粒度过细，会增加后续操作的困难程度，进而增加在操作过程中有效物质的浪费，不利于提高异黄酮类物质的提取效率；葛根粉体的粒度过粗，也会影响异黄酮类的提取效率。
进一步优选的，葛根粉体的粒度为115目。
优选的，步骤2)中，葛根粉体与水的质量比为1:17。
优选的，步骤2)中，反应的温度为120℃，提取的时间为45min。
优选的，步骤2)中，反应的压强为0.7MPa。
优选的，步骤3)中，对反应后的溶液采用无水甲醇进行萃取。
优选的，步骤3)中，对上清液采用液相色谱法进行检测。
进一步优选的，色谱条件为：GL Sciences InertSustain C18column(5μm，250mm×4.6mm)；以乙腈(B)-水(0.1％甲酸)(A)作为流动相，梯度洗脱程序：0-16min，15-30％B；16-34min，30-100％B；34-40min，100％B；40-41min，100-15％B；41-48min，15％B)；检测波长为λ＝260nm；流速为0.80mL/min；进样量为5.0μL。
本发明的有益效果为：
本发明的提取方法可以使葛根中的葛根素、3-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元等四种异黄酮类化合物的提取率达到最佳。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1为亚临界水的提取设备结构示意图；
图2为4种异黄酮类物质的液相色谱分离图谱。
其中，1-反应釜 2-加热炉 3-压力表 4-热电偶 5-温度控制器 6-针阀。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
材料与试剂
野葛根：山东省中医药大学中鲁医院；
甲醇：北京百灵威科技有限公司；
乙腈：赛默飞世尔科技(中国)有限公司；
甲酸：天津市光复精细化工研究所；
去离子水：Elga Purelab water system(Elga,England)。
实验仪器
XS205型电子天平：METTLER TOLEDO；DHG-9146A型电热恒温干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；HA–4型加热搅拌控制仪：海安石油科研仪器有限公司；SPD-20A型液相色谱仪(紫外)：日本岛津公司；KQ-600KDE型超声清洗仪：昆山市超声仪器有限公司；HH-S4型数显恒温水浴锅：金坛市医疗仪器厂；JYL–G12E型料理机：九阳股份有限公司；LabSolutions系统：Shimadzu Corporation；带聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜。
亚临界水提取设备的安装
亚临界水的提取装置如下图1所示，主要有反应釜、温度控制器和加热仪组成。在加热实验室实验台上准备好加热搅拌控制仪，使加热搅拌控制器水平放置并检查仪器温度参数。然后检查反应釜的密封性，确保反应釜不会在实验中由于高温高压而漏气。
从葛根中同时提取葛根素、3-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元4种异黄酮类化合物的方法，包括如下步骤：
1)把采购的野葛根放入粉碎机进行粉碎，依次过不同目数筛，得到不同颗粒度的样品，置于干燥阴暗处备用。
2)准确称取0.2g(±0.0005g)的葛根样品，加入带聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，然后加入不同体积的去离子水，拧紧反应釜将其放入设定好的120℃的加热搅拌控制仪中，提取45min后取出反应釜用流动的水冷却至室温，打开反应釜用1.0mL纯甲醇分三次冲洗反应釜顶部溶液，将冲洗液提取至10mL的比色管中，然后用纯甲醇提取样品溶液并定容至刻度。摇匀静置后，取上层清液，经0.45μm有机膜过滤得到样品溶液，进行HPLC检测。
色谱条件如下：采用GL Sciences InertSustain C18column(5μm，250mm×4.6mm)；以乙腈(B)-水(0.1％甲酸)(A)作为流动相，(梯度洗脱：0～16min,15～30％B；16～34min,30～100％B；34～40min,100％B；40～41min，100～15％B；41～48min，15％B)；检测波长为λ＝260nm；流速为0.80mL/min；进样量为5.0μL。可以将这四种异黄酮类化合物完全分离，并且峰形良好，如图2所示。
葛根中异黄酮类物质的提取率的计算公式为：
提取液经0.45μm的滤膜过滤，精确吸取200μL滤液于50mL比色管中，然后用纯甲醇定容至刻度，室温下超声15min混匀，以纯甲醇作为空白，在λ＝260nm下测定各提取液中异黄酮的浓度，进行葛根中各异黄酮类物质的测定，计算葛根提取液中各异黄酮的提取率。
Figure BDA0001598005220000041
不同提取条件下的提取率如表1-表4所示：
表1葛根素在不同条件下的提取率
Figure BDA0001598005220000042
表2 3-甲氧基葛根素在不同条件下的提取率
Figure BDA0001598005220000043
Figure BDA0001598005220000051
表3大豆苷在不同条件下的提取率
Figure BDA0001598005220000052
表4大豆苷元在不同条件下的提取率
Figure BDA0001598005220000053
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种从葛根中同时提取4种异黄酮类化合物的方法，其特征在于：同时提取的4种异黄酮类化合物分别为：葛根素、3-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元；提取方法包括如下步骤：
1)将洗净干燥后的葛根进行粉碎、过筛，得葛根粉体，葛根粉体的粒度为115目；
2)将葛根粉体与水按质量比为1:17混合后进行高温反应，反应的温度为120℃，压强为0.1MPa；
3)反应完成后，对反应后溶液进行萃取，取上清液，过滤后检测；
步骤2)中，反应时间为45min；
步骤3)中，对反应后的溶液采用无水甲醇进行萃取；
步骤3)中，对上清液采用液相色谱法进行检测；
色谱条件为：5μm，250mm×4.6mm的GL Sciences InertSustain C18column；以乙腈-水作为流动相，水中含有0.1％甲酸；梯度洗脱程序：0-16min，15-30％乙腈；16-34min，30-100％乙腈；34-40min，100％乙腈；40-41min，100-15％乙腈；41-48min，15％乙腈；检测波长为λ＝260nm；流速为0.80mL/min；进样量为5.0μL。
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